專(zhuān)利名稱(chēng)：用于檢測(cè)丙型肝炎患者il28b snp12980275多態(tài)性的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生命科學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是ー種臨床檢驗(yàn)用途的基因檢測(cè)試劑盒，采用基因測(cè)序技術(shù)，對(duì)IL28B SNP rsl2980275多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，可以用于預(yù)測(cè)丙型肝炎患者抗病毒治療效果。
背景技術(shù)：
丙型肝炎是ー種由丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)引起的肝臟急慢性炎癥，自從1989年被美國(guó)發(fā)現(xiàn)以來(lái)，HCV感染逐漸成為ー個(gè)世界性公衛(wèi)生問(wèn)題。我國(guó)感染者約有4200萬(wàn)人，每年的新發(fā)病例約300-400萬(wàn)。80%感染者會(huì)發(fā)展成慢性肝炎，30%進(jìn)展為終末期肝病，包括肝硬化、肝癌等。目前臨床上主要是應(yīng)用干擾素合用利巴韋林來(lái)進(jìn)行丙肝 的治療，但是這種聯(lián)合治療方案，不同的病人對(duì)這種聯(lián)合治療應(yīng)答的效果差異很大。IL28B基因編碼IFN- A 3，為III型干擾素，位于19號(hào)染色體上，包含6個(gè)外顯子，屬于IFN- A s家族。IFN- A主要是通過(guò)JAK-STAT信號(hào)途徑，誘導(dǎo)STATl和STAT2的磷酸化，使ISGF3復(fù)合物產(chǎn)生，而且使2’，5’ -寡腺苷酸合成酶(2，, 5’ -oligoadenyIatesynthetase, 0AS)基因家族和MxA (也稱(chēng)Mxl)蛋白的表達(dá)明顯提高，從而其抗病毒效應(yīng)才發(fā)揮出來(lái)。2009年，美國(guó)杜克大學(xué)Goldstein等研究發(fā)現(xiàn)，編碼IFN入3的IL28B基因附近有一些單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)與HCV病毒自發(fā)清除能力及對(duì)干擾素的應(yīng)答有夫。當(dāng)這些等位基因發(fā)生突變后，患者的丙肝病毒自發(fā)清除和對(duì)干擾素應(yīng)答能力發(fā)生明顯變化。近期在歐洲人群和非洲人群之間進(jìn)行的針對(duì)I型丙型肝炎基因組范圍相關(guān)性研究中發(fā)現(xiàn)，其單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)rs 12979860，rs 12980275，rs8099917等的變異與病毒的清除和干擾素治療的應(yīng)答高度相關(guān)，而位于IL28B基因下游3kb位置上的rsl2980275位點(diǎn)和治療無(wú)應(yīng)答(NVR)也密切相關(guān)。有報(bào)道指出IL28B SNP位點(diǎn)rsl2980275基因型為AA的患者的持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答(sustained virological response, SVR)百分比明顯高于GG基因型患者。通過(guò)研究rsl2980275位點(diǎn)的基因多態(tài)性，從而進(jìn)一步完善臨床對(duì)患者的丙肝病毒自發(fā)清除能力及丙型肝炎治療效果的評(píng)估。目前可用SNP多態(tài)性檢測(cè)的方法有限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(sscp)，基因測(cè)序，熒光定量PCR等，sscp技術(shù)相對(duì)簡(jiǎn)單，但酶切位點(diǎn)易受基因變異影響，影響結(jié)果判斷。本發(fā)明考慮到節(jié)約成本及時(shí)間等因素，選用基因測(cè)序法檢測(cè)IL28B基因多態(tài)性位點(diǎn)rsl2980275。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，提供一種用于檢測(cè)丙型肝炎患者IL28B SNP12980275多態(tài)性的試劑盒，可用于檢測(cè)rsl2980275位點(diǎn)是否發(fā)生突變。用于檢測(cè)丙型肝炎患者IL28B SNP12980275多態(tài)性的試劑盒，包括紅細(xì)胞裂解液、DNA提取液、檢測(cè)體系PCR反應(yīng)液，其特征在于檢測(cè)體系PCR反應(yīng)液包括dNTP，用于PCR反應(yīng)的Tag酶及其緩沖反應(yīng)液、檢測(cè)IL28Brsl2980275多態(tài)性用上下游引物，其中，IL28B 上游引物序列GTAGGGGGAATCATACAGCAITIL28B 下游引物序列GAGAGITCTGGAGAITGCTTGC。進(jìn)ー步地，所述試劑盒的使用方法包括如下步驟⑴采集待測(cè)血液樣本，提取DNA ；(ii)以該DNA為模板，用IL28B上游引物和下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR反應(yīng)產(chǎn)物；( iii )對(duì)PCR反應(yīng)產(chǎn)物測(cè)序，與IL28B正?；蛐蛄羞M(jìn)行比較，確定是否存在突變位點(diǎn)。 優(yōu)選地，步驟(ii)的PCR反應(yīng)按以下條件進(jìn)行擴(kuò)增94°C 5min;98°C 10s、58°C 20s,68°C 2min、40 個(gè)循環(huán)。本發(fā)明通過(guò)設(shè)計(jì)ー對(duì)與IL28B基因特異結(jié)合的引物，擴(kuò)增片段包括SNP12980275序列。采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技木，對(duì)特定核苷酸片斷進(jìn)行指數(shù)擴(kuò)增，并以擴(kuò)增出的高濃度目的基因進(jìn)行基因測(cè)序，檢測(cè)IL28B SNP位點(diǎn)rsl2980275多態(tài)性，該位點(diǎn)的基因型有AA，AG及GG三種。本發(fā)明引物通過(guò)如下的方案進(jìn)行設(shè)計(jì)使用Primer 6. Or軟件協(xié)助設(shè)計(jì)引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增，將IL28B rsl2980275多態(tài)性位點(diǎn)位點(diǎn)完全擴(kuò)增,然后進(jìn)行直接測(cè)序,通過(guò)測(cè)序檢測(cè)rsl2980275位點(diǎn)是否發(fā)生突變。IL28B 上游引物序列GTAGGGGGAATCATACAGCAITIL28B 下游引物序列GAGAGITCTGGAGAITGCTTGC用上述設(shè)計(jì)的引物對(duì)送檢樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行正反向測(cè)序反應(yīng)擴(kuò)增、純化后變性、直接測(cè)序可以精確的檢測(cè)IL28B SNP位點(diǎn)rs 12980275多態(tài)性。本發(fā)明的有益效果通過(guò)使用針對(duì)IL28B SNP位點(diǎn)rsl2980275的特異性引物進(jìn)行檢測(cè)，具有很高的特異性及準(zhǔn)確性；采用PCR方法擴(kuò)增目的基因并測(cè)序檢測(cè)其基因多態(tài)性，具有靈敏度高，操作簡(jiǎn)單、成本低等優(yōu)點(diǎn)。


圖I是IL28B基因擴(kuò)增后，經(jīng)I. 5%瓊脂糖凝膠電泳后的電泳圖。其中，從左至右泳道I為T(mén)AKARA2000的Marker，泳道2_3為受檢樣本。圖2是樣本I測(cè)序結(jié)果圖。圖3是樣本2測(cè)序結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)ー步闡述本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)注意的是，實(shí)施例中未說(shuō)明的常規(guī)條件和方法，通常按照所屬領(lǐng)域?qū)嶒?yàn)人員常規(guī)采用方法譬如，奧斯柏和金斯頓主編的《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》第四版，或者按照制造廠商所建議的步驟和條件。實(shí)施例I用于檢測(cè)丙型肝炎患者IL28B SNP12980275多態(tài)性的試劑盒，包括(I)紅細(xì)胞裂解液；
(2) TIANGEN組織/血液/細(xì)胞基因組DNA抽提試劑盒；(3)檢測(cè)體系PCR反應(yīng)液，包括dNTP，用于PCR反應(yīng)的Tag酶及其緩沖反應(yīng)液、檢測(cè)IL28B rsl2980275多態(tài)性用上下游引物，其中，IL28B 上游引物序列GTAGGGGGAATCATACAGCAITIL28B 下游引物序列GAGAGITCTGGAGAITGCTTGC。實(shí)施例2本發(fā)明試劑盒的使用方法I. I抽取300uL血液加入900uL紅細(xì)胞裂解液，顛倒混勻，室溫放置5分鐘，期間再顛倒混勻幾次。IOOOOrpm離心I分鐘(若離心機(jī)最高轉(zhuǎn)速不允許,可3000rpm離心5min), 吸去上清，留下白細(xì)胞沉淀，加200uL緩沖液GA，振蕩至徹底混勻。I. 2加入20 ill蛋白酶K溶液，混勻。I. 3加入200 U I緩沖液GB，充分顛倒混勻，70°C放置10分鐘，溶液應(yīng)變清亮，簡(jiǎn)短
離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠。I. 4加人200 ill無(wú)水こ醇，充分振蕩混勻15秒，此時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)絮狀沉淀，簡(jiǎn)短離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠。I. 5將上一歩所得溶液和絮狀沉淀都加入一個(gè)吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12，OOOrpm(13, 400Xg)離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱CB3放回收集管中。1.6向吸附柱CB3中加入500iU緩沖液⑶(使用前請(qǐng)先檢查是否已加入無(wú)水こ醇)，12，000 rpm(13,400Xg)離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。I. 7向吸附柱CB3中加入700 ill漂洗液PW (使用前請(qǐng)先檢查是否已加入無(wú)水こ醇)，12，OOOrpm(13, 400Xg)離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。I. 8 向吸附柱 CB3 中加入 500 ill 漂洗液 Pff, 12，OOOrpm (13, 400 Xg)離心 30 秒，倒掉廢液。I. 9將吸附柱CB3放回收集管中，12，OOOrpm(13, 400Xg)離心2分鐘，倒掉廢液。將吸附柱CB3置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。I. 10將吸附柱CB3轉(zhuǎn)入ー個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加100 u I洗脫緩沖液TE，室溫放置2-5分鐘，12，OOOrpm(13, 400 X g)離心2分鐘，將溶液收集到離心管中。2)實(shí)驗(yàn)過(guò)程2. I按樣品數(shù)n (樣品數(shù)=待測(cè)樣本數(shù)+陰性對(duì)照I個(gè)+陽(yáng)性對(duì)照I個(gè))取預(yù)混PCR反應(yīng)液姆管20ul分裝于反應(yīng)管中。2. 2將上述處理好的待測(cè)樣本和陰性、陽(yáng)性對(duì)照各取2ul分別加入反應(yīng)管中，混勻，低速離心數(shù)秒，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，具體反應(yīng)體系如下
權(quán)利要求
1.用于檢測(cè)丙型肝炎患者IL28BSNP12980275多態(tài)性的試劑盒，包括紅細(xì)胞裂解液、DNA提取液、檢測(cè)體系PCR反應(yīng)液，其特征在于 檢測(cè)體系PCR反應(yīng)液包括dNTP，用于PCR反應(yīng)的Tag酶及其緩沖反應(yīng)液、檢測(cè)IL28Brsl2980275多態(tài)性用上下游引物，其中， IL28B 上游引物序列GTAGGGGGAATCATACAGCAIT IL28B 下游引物序列GAGAGITCTGGAGAITGCTTGC。
2.如權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒的使用方法包括如下步驟 (i)采集待測(cè)血液樣本，提取DNA； (ii)以該DNA為模板，用IL28B上游引物和下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR反應(yīng)產(chǎn)物； (iii )對(duì)PCR反應(yīng)產(chǎn)物測(cè)序，與IL28B正常基因序列進(jìn)行比較，確定是否存在突變位點(diǎn)。
3.如權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，步驟(ii)的PCR反應(yīng)按以下條件進(jìn)行擴(kuò)增94 0C 5 min ；98 °C 10s、58 °C 20s,68 °C 2 min、40 個(gè)循環(huán)。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了用于檢測(cè)丙型肝炎患者IL28BSNP12980275多態(tài)性的試劑盒，包括紅細(xì)胞裂解液、DNA提取液、檢測(cè)體系PCR反應(yīng)液,其特征在于檢測(cè)體系PCR反應(yīng)液包括dNTP，用于PCR反應(yīng)的Tag酶及其緩沖反應(yīng)液、檢測(cè)IL28Brs12980275多態(tài)性用上下游引物，其中，IL28B上游引物序列GTAGGGGGAATCATACAGCATT；IL28B下游引物序列GAGAGTTCTGGAGATTGCTTGC。通過(guò)使用針對(duì)IL28BSNP位點(diǎn)rs12980275的特異性引物進(jìn)行檢測(cè)，具有很高的特異性及準(zhǔn)確性；采用PCR方法擴(kuò)增目的基因并測(cè)序檢測(cè)其基因多態(tài)性，具有靈敏度高，操作簡(jiǎn)單、成本低等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102816838SQ20121023408
公開(kāi)日2012年12月12日 申請(qǐng)日期2012年7月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月6日
發(fā)明者李文靜, 徐建成, 王淑一, 孫翠蓮 申請(qǐng)人:吉林艾迪康醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司