專利名稱：人idh基因突變的檢測引物和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種生物檢測試劑，更具體的說，本發(fā)明涉及ー種人IDH基因突變(包括IDHl基因和IDH2基因)的檢測引物和試劑盒。
背景技術(shù)：
異朽1檬酸脫氫酶(isocitrate dehydrogenase, IDH)是三羧酸循環(huán)中一種關(guān)鍵性限速酶，在細胞氧化損傷反應(yīng)中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。自2008年IDH基因被發(fā)現(xiàn)在膠質(zhì)瘤中突變以來，迅速成為研究熱點。IDH基因突變可作為診斷膠質(zhì)瘤的一個特異性指標，是膠質(zhì)瘤分級判斷和鑒別的有效分子標記，并可作為判斷膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的獨立因素。IDH突變還發(fā)生于少數(shù)白血病及骨髓增殖性疾病(MPD)等多種血液病中。人類IDH有IDHl、IDH2和IDH3三個亞家族，IDHl位于胞漿和過氧化物酶體內(nèi)，IDH2和IDH3酶位于線粒體內(nèi)，參與三羧酸循環(huán)并提供能量。目前，僅發(fā)現(xiàn)IDHl和IDH2基因存在突變。IDHl基因位于染色體2q33. 3，目前發(fā)現(xiàn)的IDHl基因突變都發(fā)生在第四外顯子的 R132 位，共發(fā)現(xiàn)了六種突變類型(包括 R132H，R132C，R132S，R132G，R132L，R132V)，IDH2基因位于染色體15q26. 1，目前發(fā)現(xiàn)的IDH2基因突變發(fā)生在第四外顯子的R140 (包括R140W, R140L 和 R140Q 三種)和 R172 (包括 R172K, R172M, R172G, R172S 和 R172W 五種)。
由于臨床對IDH突變檢測診斷作用的極大興趣，當前德國已出現(xiàn)了商業(yè)化的對IDH1R132H高度特異的單克隆抗體，可實現(xiàn)在常規(guī)免疫組化中對突變基因編碼的蛋白進行特異性檢測。由于可以簡單納入常規(guī)組織病理學工作，該抗體在德國臨床診斷中得到了廣泛應(yīng)用。但是，針對其他類型的IDHl突變(R132C，R132S，R132L，R132G)以及IDH2突變的單克隆抗體尚未商業(yè)化生產(chǎn)。用單克隆抗體檢測突變?yōu)橥蛔儽硇蜋z測，通過檢測突變基因的表達蛋白來檢測基因突變，但由于受到腫瘤細胞基因表達調(diào)控的影響，常常不能真實反映基因突變情況。因此，現(xiàn)階段，考慮到膠質(zhì)瘤中IDH突變與預(yù)后密切相關(guān)，學者們推薦所有免疫組化為陰性的患者還需通過基因檢測的方法來判斷IDH基因是否存在突變。目前，對基因檢測突變的分析的技術(shù)方法主要包括測序、限制性片段長度多態(tài)性方法(RFLP)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)、變性高效液相色譜(DHPLC)、熒光定量PCR法、基因芯片、液相芯片等方法。這些方法都有各自的優(yōu)點和缺陷，尚有待改進和標準化。I.直接測序=Sanger測序法因為可以讀到DNA每個堿基的變化，目前被認為是檢測基因突變的金標準方法。但是，因為靈敏度低(檢測突變靈敏度約為20%)，檢測異質(zhì)性較高的臨床腫瘤組織樣本時假陰性率高。同吋，測序步驟繁瑣、耗時長，對設(shè)備和操作人員的要求較高，檢測周期長，多限于在科研單位進行，大多數(shù)醫(yī)院都無法獨立完成檢測，不易于形成標準化操作、適合臨床單位應(yīng)用的體外診斷產(chǎn)品。2.熒光定量PCR法通過序列特異性探針實現(xiàn)基因突變檢測，該方法靈敏度高、特異性好，是目前基因檢測體外診斷試劑最常用的技術(shù)平臺。但是，該方法需熒光標記的特異性探針，一種探針只能進行ー種基因突變類型的檢測，因此檢測試劑成本高，檢出突變種類少，操作相對復雜。對突變類型較多的IDH基因，該方法并不十分合適。目前，尚未開發(fā)成功基于該方法的檢測IDH基因突變的試劑盒。3.限制性片段長度多態(tài)性方法(RFLP):該方法成本低，對檢測設(shè)備要求低，突變基因的檢出限在5 10%。但是，勞動強度稍大、需專業(yè)的技術(shù)人員、不適于高通量檢測和大規(guī)模臨床應(yīng)用。4. SSCP, DHPLC、基因芯片、液相芯片等方法操作復雜、對設(shè)備要求高，僅在科研單位實驗室應(yīng)用，不適合大范圍推廣使用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在干解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種檢測效果更全面、特異性高、漏檢率低的人IDH基因突變的檢測引物。本發(fā)明的另一目的在干解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供ー種操作簡單快捷、檢測效果更全面、特異性高、漏檢率低的人IDH基因突變的檢測試劑盒。為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供了ー種人IDH基因突變檢測引物對，用于PCR與高分辨率熔解曲線分析技術(shù)聯(lián)用，所述引物對為IDHlf ACCAAATGGCACCATACGA(SEQ ID NO 1),IDHlr TTCATACCTTGCTTAATGGGTGT(SEQ ID NO 2)；或IDH2f AGTCCCAATGGAACTATCCG (SEQ ID NO: 3)，IDH2r:AAGCCAGCCTCACCTCGTC(SEQ ID NO :4)。為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明還提供了ー種人IDH基因突變檢測的試劑盒，用于PCR與高分辨率熔解曲線分析技術(shù)聯(lián)用，所述試劑盒包括引物對IDHlf ACCAAATGGCACCATACGA(SEQ ID NO :1)，IDHlr TTCATACCTTGCTTAATGGGTGT(SEQ ID NO :2)；或IDH2f AGTCCCAATGGAACTATCCG(SEQ ID NO :3),IDH2r:AAGCCAGCCTCACCTCGTC(SEQ ID NO :4)。優(yōu)選的，所述試劑盒還包括突變對照標準品和野生對照標準品。優(yōu)選的，所述試劑盒包括反應(yīng)液，反應(yīng)液含有PCR緩沖液、dNTP混合液、MgCl2、引物對、DNA聚合酶、熒光染料和去DNA酶蒸餾水。更優(yōu)選的，所述反應(yīng)液各組分的反應(yīng)濃度為PCR緩沖液2X、dNTP混合液各
O.4-0. 8mM、MgCl2L 0-5. OmM、引物對各 O. 5-0. 8 μ M, DNA 聚合酶 O. 2-0. 6U/y L、熒光染料2Χ，去DNA酶蒸餾水加至配制2X檢測反應(yīng)液總體積。本發(fā)明采用的核心技術(shù)一高分辨率熔解曲線(HRM)分析技術(shù)是近年來興起的一種用于鑒別基因序列差異的分析方法。檢測原理是運用PCR方法特異性擴增IDH基因片段，繼之用HRM法分析擴增片段的差異，在HRM分析步驟中，由于反應(yīng)體系中使用了ー種小分子熒光飽和染料，使突變導致的DNA分子熔解溫度的微小差異都能突顯出來。這種DNA分析技術(shù)以野生型基因組DNA為參照，能分辨出待檢測樣本中是否含有突變型基因，具有極高的靈敏度和準確性。該技術(shù)不受突變堿基位點與類型局限，無需序列特異性探針，特別適用于突變位點較集中且臨床上無需區(qū)分具體突變類型的突變檢測，檢測突變靈敏度高于傳統(tǒng)測序。相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果在于(I)特異性引物的設(shè)計針對IDHl和IDH2基因突變位點，設(shè)計所擴增序列包含突變位點、擴增特異性和擴增效率高的PCR引物，且擴增目的片段不包含影響HRM分析的其他突變位點或SNP位點，以保證擴增出的PCR產(chǎn)物在進行HRM分析時的分辨率和準確度。(2)對PCR反應(yīng)及HRM分析的各個條件進行優(yōu)化，PCR擴增的非特異性產(chǎn)物的比例要求控制的盡可能低，以保證HRM分析的準確度，同時，野生型與突變型分子的熔解曲線差異達到最大化，從而最大限度地提高分析靈敏度。本發(fā)明的檢測引物和相應(yīng)的檢測試劑盒不受突變類型局限，無需序列特異性探
針，可以檢測IDHl和IDH2基因外顯子4上發(fā)生的所有突變類型。在PCR結(jié)束后直接運行高分辨熔解，即可完成對樣品突變的分析。操作簡便快速，成本低，靈敏度、特異性好，結(jié)果準確，為臨床IDH基因突變檢測提供ー種便利有效的新手段，輔助腫瘤診斷、治療及判斷預(yù)后。


圖1(a)為本發(fā)明實施例I中樣本中不含IDHl基因第4外顯子突變的HRM分析圖；圖I (b)為本發(fā)明實施例I中樣本中有含IDHl基因第4外顯子R132H突變的HRM分析圖；圖I (c)為本發(fā)明實施例I中樣本中有含IDHl基因第4外顯子R132C突變的HRM分析圖；圖I (d)為本發(fā)明實施例I中樣本中有含IDHl基因第4外顯子R132S突變的HRM分析圖；圖2(a)為本發(fā)明實施例2中樣本中不含IDH2基因第4外顯子突變的HRM分析圖；圖2(b)為本發(fā)明實施例2中樣本中有含IDH2基因第4外顯子R140W突變的HRM分析圖；圖2(c)為本發(fā)明實施例2中樣本中有含IDH2基因第4外顯子R140L突變的HRM分析圖；圖2(d)為本發(fā)明實施例2中樣本中有含IDH2基因第4外顯子R172K突變的HRM分析圖；圖3(a)為本發(fā)明實施例4中樣本IDHl基因第4外顯子的擴增曲線圖；圖3 (b)為本發(fā)明實施例4中PCR產(chǎn)物熔解峰分析圖。
具體實施例方式檢測人IDH基因突變的檢測方法，包括以下步驟I.提取石蠟包埋腫瘤組織或外周血、骨髓基因組DNA，將DNA濃度調(diào)整到2_10ng/μ L02.樣本DNA IDHl和IDH2基因外顯子4的特異性擴增
①反應(yīng)體系的配制
權(quán)利要求
1.一種人IDH基因突變檢測引物對，用于PCR與高分辨率熔解曲線分析技術(shù)聯(lián)用，其特征在于，所述引物對為IDHlf ACCAAATGGCACCATACGA,IDHlr TTCATACCTTGCTTAATGGGTGT ； 或 IDH2f AGTCCCAATGGAACTATCCG,IDH2r:AAGCCAGCCTCACCTCGTC。
2.—種人IDH基因突變檢測的試劑盒，用于PCR與高分辨率熔解曲線分析技術(shù)聯(lián)用，其特征在于，所述試劑盒包括引物對IDHlf ACCAAATGGCACCATACGA,IDHlr TTCATACCTTGCTTAATGGGTGT ； 或IDH2f AGTCCCAATGGAACTATCCG,IDH2r:AAGCCAGCCTCACCTCGTC。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的人IDH基因突變檢測的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括突變對照標準品和野生對照標準品。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的人IDH基因突變檢測的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括反應(yīng)液，反應(yīng)液含有PCR緩沖液、dNTP混合液、MgCl2、引物對、DNA聚合酶、熒光染料和去DNA酶蒸餾水。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的人IDH基因突變檢測的試劑盒，其特征在于，所述反應(yīng)液各組分的反應(yīng)濃度為=PCR緩沖液2X、dNTP混合液各0. 4-0. 8mM、MgCl2L 0-5. OmM、引物對各.0.5-0. 8 uM, DNA聚合酶0. 2-0. 6U/ u L、熒光染料2X，去DNA酶蒸餾水加至配制2X檢測反應(yīng)液總體積。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種人IDH基因突變的檢測引物和檢測試劑盒，用于PCR與高分辨率熔解曲線分析技術(shù)聯(lián)用。本發(fā)明檢測試劑盒可用于檢測IDH1和IDH2基因外顯子4上的基因突變，檢測樣本為腫瘤組織、血液或骨髓細胞提取的人類基因組DNA，用于臨床腦膠質(zhì)瘤和血液病患者，輔助腫瘤診斷、治療及判斷預(yù)后。本發(fā)明檢測試劑盒的操作簡單快捷，檢測效果好。
文檔編號C12Q1/68GK102732633SQ20121023473
公開日2012年10月17日 申請日期2012年7月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月6日
發(fā)明者吳嵐曉, 姚飛, 曾慶, 譚杰鋒 申請人:廣州好芝生物科技有限公司