專利名稱：一種豬肉風(fēng)味肽及其生產(chǎn)方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程和食品添加劑領(lǐng)域，具體涉及一種豬肉風(fēng)味肽及其生產(chǎn)方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
食品具有營(yíng)養(yǎng)、安全和感官三大要素。滋味是食品感官質(zhì)量最重要的屬性之一，主要是通過(guò)舌頭的味蕾感知，其次是自由神經(jīng)末梢，是水溶性物質(zhì)刺激味覺(jué)感受器再經(jīng)過(guò)味覺(jué)神經(jīng)傳入到大腦的味覺(jué)中樞，經(jīng)分析整合產(chǎn)生的化學(xué)感應(yīng)。滋味一般由甜味、成味、苦味、酸味和鮮味五種基本味覺(jué)構(gòu)成，它們的味覺(jué)感受器分別位于舌頭的不同區(qū)域，同時(shí)口腔后部，胃和直腸也有部分能與呈味物質(zhì)發(fā)生特異性結(jié)合的受體，呈味物質(zhì)與這些受體結(jié)合后并不能讓人產(chǎn)生味感，而只是起到加強(qiáng)味感的作用。呈味肽是指從食物中提取或由氨基酸合成得到的對(duì)食品風(fēng)味具有一定貢獻(xiàn)的相對(duì)分子量低于5000u的寡肽類，包括·特征滋味肽和風(fēng)味前體肽。呈味肽具有多種滋味特征，其呈味效果往往不是單一的某種滋味，而是各種滋味的綜合效應(yīng)，從而賦予食品鮮美濃郁、圓潤(rùn)香滑、回味悠長(zhǎng)的味感。呈味肽存在于肉類、水果和蔬菜等各種食物中，無(wú)論對(duì)于加工食品還是未經(jīng)加工食品的風(fēng)味都非常重要。呈味肽不但能產(chǎn)生特征滋味，還可以作為揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的前體物參與美拉德反應(yīng)，形成特殊的芳香氣味，因此通常所說(shuō)的各種肽的呈味作用是其綜合效果?；蚬こ碳夹g(shù)在食品工程領(lǐng)域得到了越來(lái)越多的應(yīng)用。在蛋白類香精生產(chǎn)方面，利用基因工程方法特異性表達(dá)蛋白類香精具有目前酶法水解方法無(wú)法比擬的專一性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)也將克服目前蛋白類香精生產(chǎn)原料成分不確定，有苦味物質(zhì)存在，影響產(chǎn)品風(fēng)味等缺點(diǎn)，得到了世界香精香料大公司和一些研究單位的重視。天津科技大學(xué)曾松榮等中國(guó)生物工程雜志發(fā)表《重組畢赤酵母發(fā)酵牛肉風(fēng)味肽的中試研究》，稱在畢赤酵母中表達(dá)牛肉風(fēng)味肽，生產(chǎn)的牛肉風(fēng)味肽具有牛肉風(fēng)味特征，但其采用的表達(dá)宿主菌是畢赤酵母，其利用甲醇作為碳源與誘導(dǎo)劑具有較高的食品安全隱患。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述不足，提供一種具有強(qiáng)烈豬肉風(fēng)味特征與高食品安全的豬肉風(fēng)味肽。本發(fā)明另一目的在于提供上述豬肉風(fēng)味肽的生產(chǎn)方法。本發(fā)明還有一個(gè)目的在于提供上述豬肉風(fēng)味肽的應(yīng)用。本發(fā)明上述目的通過(guò)以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)一種豬肉風(fēng)味肽，其氨基酸序列如SEQ ID N0:1所示。編碼所述豬肉風(fēng)味肽的核苷酸序列如SEQ ID NO : 2所示。一種重組質(zhì)粒，是將所述豬肉風(fēng)味肽基因連入釀酒酵母分泌表達(dá)載體PlCAS中，構(gòu)成重組質(zhì)粒。
一種重組菌株,是攜帶有所述重組質(zhì)粒質(zhì)粒的菌株Escherichia coli Top 10/PICAS-PFP。一種重組工程菌，由所述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化釀酒酵母宿主菌釀酒酵母MT8-1后得到。本發(fā)明所述豬肉風(fēng)味肽的生產(chǎn)方法，其特征在于包括如下步驟(I)將豬肉通過(guò)木瓜蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、中性蛋白酶中的一種或幾種酶解獲得豬肉酶解物，通過(guò)Sephadex G_15凝膠柱分離不同肽類物質(zhì)，并進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，利用MALD1-T0F-MS質(zhì)譜分析鑒定感官評(píng)價(jià)6. 5分以上的呈味肽肽段序列，得到具有明顯豬肉風(fēng)味特征的豬肉風(fēng)味肽氨基酸序列；(2)利用釀酒酵母偏好密碼子設(shè)計(jì)與豬肉風(fēng)味肽氨基酸序列相對(duì)應(yīng)的核苷酸序列，通過(guò)β_乙腈亞磷酸胺化學(xué)合成法，使用全自動(dòng)合成儀合成；(3)為實(shí)現(xiàn)豬肉風(fēng)味肽在釀酒酵母中分泌表達(dá)，采用PICAS質(zhì)粒，該質(zhì)粒主要包含它有一個(gè)啟動(dòng)子GAPDH，一個(gè)來(lái)自葡萄糖淀粉酶的分泌信號(hào)序列，一個(gè)多克隆位點(diǎn)(包含Sac I1、Bgl I1、Xho1、Nco I酶切位點(diǎn));含有兩個(gè)選擇性遺傳標(biāo)記TRPl和Ampr以及一個(gè)可在大腸桿菌中獨(dú)立復(fù)制的復(fù)制起始位點(diǎn)ColElori，在其基礎(chǔ)上引入技術(shù)方案I中合成的基因(SEQ ID NO 3)，合成的基因中引入Bgl II與Xho I酶切位點(diǎn)，把合成基因與PICAS質(zhì)粒通過(guò)Bgl II與Xho I進(jìn)行雙酶切，體外連接構(gòu)建重組質(zhì)粒pICAS-pfp ；(4)以LiCl法將Xba I線性化的質(zhì)粒pICAS-p fp轉(zhuǎn)化釀酒酵母MT8-1，在SD平板上培養(yǎng)3-4天，挑取SD平板上的克隆轉(zhuǎn)化子，提取基因組DNA作為模板，進(jìn)行酵母重組基因組PCR鑒定，獲得重組轉(zhuǎn)化子；(5)將重組轉(zhuǎn)化子接種至ImL YI3D培養(yǎng)基中培養(yǎng)適當(dāng)時(shí)間后，轉(zhuǎn)接到50mlSDC培養(yǎng)基中培養(yǎng)72h離心收集上清液，對(duì)上清液進(jìn)行抽濾，即得到具有強(qiáng)烈豬肉風(fēng)味的豬肉風(fēng)味肽； 其中，步驟(I)中所述感官評(píng)價(jià)的方法是將酶解產(chǎn)物水提物凝膠柱分離峰組分凍干粉，按照O. 2mg/mL的質(zhì)量濃度添加到純水中,請(qǐng)12名感官評(píng)定員進(jìn)行評(píng)定,評(píng)定的定義是添加酶解產(chǎn)物純水的濃厚味強(qiáng)度為4分，并以八分標(biāo)度法對(duì)樣品濃厚感強(qiáng)度進(jìn)行標(biāo)度檢驗(yàn)，從而評(píng)定這酶解產(chǎn)物對(duì)豬肉風(fēng)味的影響。每個(gè)評(píng)價(jià)樣品都隨機(jī)3位數(shù)編號(hào)后，打亂順序交給評(píng)價(jià)員進(jìn)行滋味評(píng)定，同一個(gè)樣品每名評(píng)價(jià)員評(píng)價(jià)3次，，取3次測(cè)定平均值為最終評(píng)價(jià)分?jǐn)?shù)。本發(fā)明豬肉風(fēng)味肽與10%木糖、6%核糖、50%奶油、14%丙二醇、20%水調(diào)節(jié)pH值6. 5，在100°C加熱2h，除去上層奶油層即得豬肉熱反應(yīng)香精。在200g本發(fā)明豬肉風(fēng)味肽中加入10%肉豆蘧油、5%姜油，7%月桂油，7%孜然油、3%芥末油加入單甘酯乳化lOmin，即得具有豬肉風(fēng)味的調(diào)味品。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果本發(fā)明采用釀酒酵母表達(dá)體系分泌表達(dá)從豬肉酶解物中分離純化出的豬肉風(fēng)味肽，在保持豬肉風(fēng)味的同時(shí)，與一般昂貴的通過(guò)蛋白酶酶解豬肉獲得豬肉風(fēng)味肽的方法比起來(lái)具有產(chǎn)量高、生產(chǎn)成本低可工業(yè)化應(yīng)用等優(yōu)點(diǎn)。釀酒酵母作為釀酒工業(yè)中廣泛應(yīng)用的菌種，具有遺傳背景清晰并且已經(jīng)被證明是一種安全的可應(yīng)用于食品的微生物。利用釀酒酵母作為表達(dá)體系的宿主菌，在高效、快速、低成本獲取豬肉風(fēng)味肽的同時(shí)保證了獲取的豬肉風(fēng)味肽食品安全的問(wèn)題。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步解釋本發(fā)明，但實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)明做任何形式的限定。實(shí)施例1豬肉風(fēng)味肽的氨基酸序列與基因序列將豬肉通過(guò)木瓜蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、中性蛋白酶中的一種或幾種酶解獲得豬肉酶解物，通過(guò)Sephadex G_15凝膠柱分離不同肽類物質(zhì)，將酶解產(chǎn)物水提物凝膠柱分離峰組分凍干粉，按照O. 2mg/mL的質(zhì)量濃度添加到純水中，請(qǐng)12名感官評(píng)定員進(jìn)行評(píng)定，評(píng)定的定義是添加酶解產(chǎn)物純水的濃厚味強(qiáng)度為4分，并以八分標(biāo)度法對(duì)樣品濃厚感強(qiáng)度進(jìn)行標(biāo)度檢驗(yàn)，從而評(píng)定這酶解產(chǎn)物對(duì)豬肉風(fēng)味的影響。每個(gè)評(píng)價(jià)樣品都隨機(jī)3位數(shù)編號(hào)后，打亂順序交給評(píng)價(jià)員進(jìn)行滋味評(píng)定，同一個(gè)樣品每名評(píng)價(jià)員評(píng)價(jià)3次，取3次測(cè)定平均值為最終評(píng)價(jià)分?jǐn)?shù)。取感官評(píng)價(jià)分?jǐn)?shù)在6. 5分以上的組分，利用MALD1-T0F-MS質(zhì)譜分析鑒定感官評(píng)價(jià)6. 5分以上的呈味肽肽段序列，得到具有明顯豬肉風(fēng)味特征的豬肉風(fēng)味肽氨基酸序列，基因序列根據(jù)豬肉風(fēng)味肽氨基酸序列利用釀酒酵母偏好密碼子設(shè)計(jì)基因序列，得到具有豬肉風(fēng)味肽的基因序列(PfP)。具體的序列見(jiàn)SEQ ID NO I與SEQ ID NO 2。設(shè)計(jì)的基因在兩端引入Bgl II與Xho I酶切位點(diǎn)，并在兩端引入GCGC保護(hù)堿基(SEQ ID NO 3)后委托上海生物工程有限公司合成。實(shí)施例2重組質(zhì)粒pICAS-pfp的構(gòu)建將上述合成的基因序列與質(zhì)粒pICAS進(jìn)行雙酶切。體系為無(wú)菌(ΜΗ2013μ1、質(zhì)粒pICAS 或 pfp 基因 3μ 1、10XM buffer 2μ1、Bgl II I μ1、Xho I μ I。將雙酶切后的 pfp基因與質(zhì)粒進(jìn)行體外的連接后用CaC12轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入Ε. coli ToplOF，在Amp+LB (50mg/ml)平板上涂板，過(guò)夜培養(yǎng)。提取 陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子委托上海生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。實(shí)施例3表達(dá)豬肉風(fēng)味肽工程菌的構(gòu)建培養(yǎng)將質(zhì)粒pICAS-pfp線性化后按照以下方法轉(zhuǎn)化釀酒酵母分別在ΙΟΟμ I新制備酵母感受態(tài)細(xì)胞的Ep管中加入3 μ I Xba I線性化處理的pICAS、pICAS-celAL-CALB，再加入10 μ I變性處理的Herring Testes Carrier DNA(購(gòu)自Takara公司)輕輕混勻。每管中加Λ 600 μ L PEG/LiAc溶液，輕輕振蕩混勻。30°C溫育30分鐘，每隔10分鐘輕搖振蕩一次，以混勻溶液。加入70 μ L DMSO，輕搖混勻。42°C熱激15min,每5min輕搖振蕩一次。熱激后在冰上放置15min。14, OOOrpm高速離心5min。棄去上清，用500 μ L TE溶液懸浮細(xì)胞。取200 μ L涂布于SD平板上培養(yǎng)3-4 天。利用目的基因的基因序列，提取SD平板上單克隆轉(zhuǎn)化子提取酵母基因組PCR鑒定總反應(yīng)體積為20 μ L，酶量為2U，取2 μ LPCR產(chǎn)物進(jìn)行O. 8%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。實(shí)施例4豬肉風(fēng)味調(diào)味品的制備在200g豬肉風(fēng)味肽中加入10%肉豆蘧油、5%姜油，7%月桂油，7%孜然油、3%芥末油加入單甘酯乳化lOmin，即得具有豬肉風(fēng)味的調(diào)味品。實(shí)施例5熱反應(yīng)豬肉香精的制備取500g豬肉風(fēng)味肽加入10%木糖、6%核糖、50%奶油、14%丙二醇、20%水調(diào)節(jié)pH值6. 5，在100°C加熱2h，除去上層奶油層即得豬肉熱反應(yīng)香精。序列表
發(fā)明名稱一種豬肉風(fēng)味肽及其生產(chǎn)方法與應(yīng)用申請(qǐng)人廣州市澳鍵豐澤生物科技有限公司
SEQ ID NO:〗豬肉風(fēng)味肽氨基酸序列
Gly-V al-Glu-Asn—Ala-V al-V al-Pro-Gln-Asn
SEQ ID N02豬肉風(fēng)味肽核苷酸序列
GGT-GTT-GAA-AAT-GCT-GTT-GTT-CCA-CAA-AAT
SEQ ID N0:3 GCGC保護(hù)堿基
GCGC-GGT-GTT-GAA-AAT-GCT-GTT-GTT-CCA-CAA-AAT—GCGC
權(quán)利要求
1.一種豬肉風(fēng)味肽，其氨基酸序列如SEQ ID N0:1所示。
2.編碼權(quán)利要求1所述豬肉風(fēng)味肽的核苷酸序列如SEQID N0:2所示。
3.—種重組質(zhì)粒，其特征在于是將權(quán)利要求2所述豬肉風(fēng)味肽基因連入釀酒酵母分泌表達(dá)載體PlCAS中，構(gòu)成重組質(zhì)粒。
4.一種重組菌株，其特征在于是攜帶有權(quán)利要求3所述重組質(zhì)粒質(zhì)粒的菌株Escherichia coli Top 10/pICAS_PFPo
5.一種重組工程菌，其特征在于由權(quán)利要求3所述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化釀酒酵母宿主菌釀酒酵母MT8-1后得到。
6.權(quán)利要求1所述豬肉風(fēng)味肽的生產(chǎn)方法，其特征在于包括如下步驟 (1)將豬肉通過(guò)木瓜蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、中性蛋白酶中的一種或幾種酶解獲得豬肉酶解物，通過(guò)Sephadex G_15凝膠柱分離不同肽類物質(zhì)，并進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，然后利用MALD1-TOF-MS質(zhì)譜分析鑒定感官評(píng)價(jià)6. 5分以上的呈味肽肽段序列，得到具有明顯豬肉風(fēng)味特征的豬肉風(fēng)味肽氨基酸序列； (2)利用釀酒酵母偏好密碼子設(shè)計(jì)與豬肉風(fēng)味肽氨基酸序列相對(duì)應(yīng)的核苷酸序列，通過(guò)￠-乙腈亞磷酸胺化學(xué)合成法，使用全自動(dòng)合成儀合成； (3)為實(shí)現(xiàn)豬肉風(fēng)味肽在釀酒酵母中分泌表達(dá)，采用PICAS質(zhì)粒，在其基礎(chǔ)上引入GCGC保護(hù)堿基(如SEQ ID NO :3所示)，合成的基因中引入Bgl II與Xho I酶切位點(diǎn)，把合成基因與PICAS質(zhì)粒通過(guò)Bgl II與Xho I進(jìn)行雙酶切，體外連接構(gòu)建重組質(zhì)粒pICAS-pfp ； (4)以LiCl法將XbaI線性化的質(zhì)粒pICAS-p fp轉(zhuǎn)化釀酒酵母MT8-1，在SD平板上培養(yǎng)3-4天，挑取SD平板上的克隆轉(zhuǎn)化子，提取轉(zhuǎn)化子釀酒酵母基因組DNA作為模板，進(jìn)行酵母重組基因組PCR鑒定，獲得重組轉(zhuǎn)化子； (5)將重組轉(zhuǎn)化子接種至ImLYH)培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h后，轉(zhuǎn)接到50mlSDC培養(yǎng)基中培養(yǎng)72h離心收集上清液，對(duì)上清液進(jìn)行抽濾，即得到具有強(qiáng)烈豬肉風(fēng)味的豬肉風(fēng)味肽； 其中，步驟(I)中所述感官評(píng)價(jià)的方法是將酶解產(chǎn)物水提物凝膠柱分離峰組分凍干粉，按照0. 2mg/mL的質(zhì)量濃度添加到純水中，請(qǐng)12名感官評(píng)定員進(jìn)行評(píng)定，評(píng)定的定義是添加酶解產(chǎn)物純水的濃厚味強(qiáng)度為4分，并以八分標(biāo)度法對(duì)樣品濃厚感強(qiáng)度進(jìn)行標(biāo)度檢驗(yàn)，從而評(píng)定這酶解產(chǎn)物對(duì)豬肉風(fēng)味的影響。每個(gè)評(píng)價(jià)樣品都隨機(jī)3位數(shù)編號(hào)后，打亂順序交給評(píng)價(jià)員進(jìn)行滋味評(píng)定，同一個(gè)樣品每名評(píng)價(jià)員評(píng)價(jià)3次，取3次測(cè)定平均值為最終評(píng)價(jià)分?jǐn)?shù)。
7.權(quán)利要求1所述豬肉風(fēng)味肽在制備豬肉香精中的應(yīng)用，其特征在于200g的豬肉風(fēng)味肽中加入10%肉豆蘧油、5%姜油，7%月桂油，7%孜然油、3%芥末油加入單甘酯乳化IOmin,即得具有豬肉風(fēng)味的調(diào)味品。
8.權(quán)利要求1所述豬肉風(fēng)味肽在制備豬肉風(fēng)味調(diào)味料的應(yīng)用，其特征在于10%豬肉風(fēng)味肽加入10%木糖、6%核糖、50%奶油、14%丙二醇、20%水調(diào)節(jié)pH值6. 5，在100°C加熱2h,除去上層奶油層即得豬肉熱反應(yīng)香精。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種豬肉風(fēng)味肽及其生產(chǎn)方法與應(yīng)用。本發(fā)明所述豬肉風(fēng)味肽的氨基酸序列如SEQ ID NO1所示，編碼該蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO2所示。本發(fā)明將豬肉風(fēng)味肽基因經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu)化，在釀酒酵母中高效分泌表達(dá)，得到的豬肉風(fēng)味肽具有很強(qiáng)的豬肉風(fēng)味，適合應(yīng)用于調(diào)味品或香精領(lǐng)域。
文檔編號(hào)C12R1/19GK103044525SQ20121023568
公開(kāi)日2013年4月17日 申請(qǐng)日期2012年7月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月9日
發(fā)明者江逢春, 云帆, 許小博, 彭勇, 鐘健 申請(qǐng)人:廣州市澳鍵豐澤生物科技有限公司