深靜脈血栓易感性檢測試劑盒（mthfr等基因）的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種檢測深靜脈血栓易感基因無創(chuàng)檢測試劑盒。該試劑盒包括檢測EPCR基因上A6936G、MTHFR基因上C677T(rs1801133)、ACE基因上I/D(rs4646994)的3個單核苷酸多態(tài)性位點基因型的特異性引物與DNA測序引物、PCR反應(yīng)組件、PCR產(chǎn)物純化組件、DNA測序反應(yīng)組件等。本發(fā)明的試劑盒通過檢測與深靜脈血栓發(fā)生密切相關(guān)的3個單核苷酸多態(tài)性位點的基因型從基因?qū)用鎭碓u估深靜脈血栓發(fā)病的風(fēng)險級別，指導(dǎo)人群提早預(yù)防疾病的發(fā)生。本發(fā)明采樣方法是口腔黏膜細胞采樣，無痛、無創(chuàng)、避免了交叉感染。測序檢測結(jié)果準確，可靠，不必購置價格昂貴的進口專用儀器，方法易普及推廣。
【專利說明】深靜脈血栓易感性檢測試劑盒(MTHFR等基因)
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本項目屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)，具體涉及一種與深靜脈血栓形成易感基因檢測試劑盒，根據(jù)檢測結(jié)果從基因?qū)用嬖u估深靜脈血栓發(fā)病的風(fēng)險級別，并作為預(yù)防和治療深靜脈血栓的方向指導(dǎo)。
【背景技術(shù)】
[0002]深靜脈血栓是血栓性疾病的一種，成為近年來嚴重威脅人類健康的醫(yī)學(xué)問題之一。我國人群年發(fā)病率約為1/1000，且無性別和年齡差別，是骨折、大手術(shù)病人、腫瘤及其他慢性病患者的主要合并癥。深靜脈血栓的形成機制很復(fù)雜。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，一些血栓易感基因成為研究熱點，這其中包括內(nèi)皮細胞蛋白C受體(endothelialprotein Creceptor, EPCR)、5, 10-亞甲基四氫葉酸還原酶(methylenetetra-hydrofolatereductase, MTHFR)和血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(angiotensin-converting enzyme, ACE)。
[0003]EPCR是Fukudome等在1994年發(fā)現(xiàn)的蛋白C系統(tǒng)的一個新成員，主要表達于大血管的內(nèi)皮細胞上。目前為止已發(fā)現(xiàn)EPCR存在多種基因突變或多態(tài)性。其中外顯子4的多態(tài)性(A6936G)與深靜脈血栓形成有很大關(guān)系。當(dāng)EPCR基因6936位點上的堿基A突變成G后，導(dǎo)致EPCR蛋白跨膜區(qū)219位點由絲氨酸(Ser)變?yōu)楦拾彼?Gly)，而變異體中的這些殘基將導(dǎo)致Gly-Gly配對，可能改變跨膜螺旋?；蛲蛔兊慕Y(jié)果導(dǎo)致EPCR從細胞膜上脫落下來形成可溶性 EPCR (soluble endothelial cell protein C receptor, sEPCR)。sEPCR水平增高的與血栓形成患病率增高有關(guān)，是白種人靜脈血栓形成的危險因素之一。
[0004]MTHFR是同型半胱氨酸代謝途徑中的關(guān)鍵酶，能催化同型半胱氨酸轉(zhuǎn)化成甲硫氨酸。MTHFR基因突變其代謝活性下降，從而導(dǎo)致血管舒縮因子平衡紊亂，形成深靜脈血栓(特別是兒童)。MTHFR基因內(nèi)存在著十多種多態(tài)性，最常見的則是C677T多態(tài)性。由于MTHFR基因677位點堿基C突變成 了 T，導(dǎo)致該位點的氨基酸由丙氨酸(Ala)突變成了纈氨酸(Val)，從而增加了一個新的限制性酶切位點。丙氨酸是MTHFR活性中心的重要氨基酸，其被纈氨酸替代則使酶的活性和耐熱性都大大下降。該位點的3個基因型CC、CT和TT中TT的活性最低，約為CC基因型的45%。因此，MTHFR基因第677位點的TT基因型多態(tài)性與深靜脈血栓形成有關(guān)。
[0005]ACE是腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-agiotensin system, RAS)中的關(guān)鍵酶,而RAS在維持機體纖溶平衡中具有重要的意義。ACE基因的16內(nèi)含子處有一段287bp的插入/缺失(Ι/D)多態(tài)性。ACE基因Ι/D多態(tài)性與循環(huán)及組織ACE水平密切相關(guān)。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，具有ACE基因DD型的個體，其血漿ACE水平較高，而II型個體血漿ACE水平較低。與等位基因I相比，DD型個體靜脈血栓形成危險顯著增高。因此ACE基因Ι/D多態(tài)性與靜脈血栓形成過程關(guān)系密切。
[0006]綜上所述，鑒于EPCR基因、MTHFR基因以及ACE基因在深靜脈血栓形成中有著不可忽視的作用，可以通過疾病易感基因檢測及時篩查出易患深靜脈血栓的高危人群，從而有針對性的預(yù)防和治療，這對于降低深靜脈血栓的發(fā)病率有非常重要的意義。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]基于EPCR 基因上 A6936G、MTHFR 基因上 C677T (rsl801133)、ACE 基因上 I/D(rs4646994)的3個單核苷酸多態(tài)性位點基因型可用來評估深靜脈血栓發(fā)病風(fēng)險級別，本發(fā)明提供一種深靜脈血栓基因無創(chuàng)檢測試劑盒。
[0008]該試劑盒包括:
檢測 EPCR 基因上 A6936G、MTHFR 基因上 C677T (rsl801133)、ACE 基因上 I/D(rs4646994)的3個單核苷酸多態(tài)性位點基因型的特異性引物對及DNA測序引物；
PCR反應(yīng)組件(包括Taq酶、dNTP混合液、反應(yīng)緩沖液、ddH20等)；
PCR產(chǎn)物純化組件(包括SAP酶、ExoI酶、ddH20等)；
DNA測序反應(yīng)組件(包括BigDye mix，EDTA溶液、100%乙醇溶液、70%乙醇溶液、HIDI溶液、ddH20 等)。
[0009]本發(fā)明試劑盒的組分和含量包括:
PCR 反應(yīng)體系:10 XPCR 反應(yīng)緩沖液 2.5ul ；25mM dNTP 混合液 0.2ul ；5U/ul Taq DNA聚合酶0.125ul ;20uM特異性引物對(每條引物各0.25ul) ；ddH20 19.175ul。
[0010]PCR 產(chǎn)物純化體系:iu/ul SAP 酶 0.75ul ；10U/ul ExoI 酶 0.375ul ；ddH20
3.875ul。
[0011]測序反應(yīng)體系:25%BigDyemix lul ；3.2uM DNA 測序引物 lul ; 125mM EDTA 溶液lul ；100% 乙醇溶液 15ul ；70% 乙醇溶液 30ul ；HIDI 溶液 8ul ；ddH20 2ul。
[0012]本試劑盒供一人份檢測使用，試劑盒的保存溫度為-20°C。
【具體實施方式】
[0013]下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。
[0014]除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。
[0015]實施例1.檢測試劑盒的使用 1、抽提DNA模板
刮取受檢者口腔黏膜上皮細胞，用酚氯仿法抽提基因組DNA。
[0016]2、PCR擴增反應(yīng)
使用檢測試劑盒中的PCR反應(yīng)組件，其中，含有下列引物對:
(I)EPCR (A6936G)正向引物:5’AGACAAATGGATGGACCTG3’
EPCR (A6936G)反向引物:5’ AGGGAGGCTTCAACTACGC3’
(2 ) MTHFR (C677T )正向引物:5’ AGGGAGGCTTCAACTACGC3’
MTHFR (C677T)反向引物:5’ GCGGTTGAGGGTGTAGAAGT3’
(3)ACE (Ι/D)正向引物:5’ CTGGGCAACAGAGTGAGACC3’
ACE (Ι/D)反向引物:5’ACCCAAGTGCCAGTGATGTT3’PCR擴增的反應(yīng)體系為:10XPCR反應(yīng)緩沖液2.5ml ;25mM的dNTP混合液0.2ml、5U/ul Taq 酶 0.125ml、DNA 模板 Iml (12_15ng 左右)、20uM 正向引物反向引物各 0.25ml、ddH2019.175ml ；
反應(yīng)條件為:94°C 4分鐘變性和酶激活，94°C 30秒變性，55°C 30秒退火，72°C I分鐘延長，循環(huán)28次，最后72°C延長5分鐘以上。
[0017]3、PCR擴增產(chǎn)物純化
使用檢測試劑盒中的PCR產(chǎn)物純化組件，反應(yīng)體系為總體積25ul，包含PCR產(chǎn)物20ul，lU/ul SAP 酶 0.75ul，10U/ul ExoI 酶 0.375ul，去離子水 3.875ul ;
在ABI2720型PCR擴增儀上進行反應(yīng)，反應(yīng)條件為37°C、15min, 72°C、20min。
[0018]4、DNA測序反應(yīng)
使用檢測試劑盒中的測序反應(yīng)組件，其中，含有下列DNA測序引物:
(1)EPCR (A6936G)測序引物:5’ AGACAAATGGATGGACCTG3’
(2)MTHFR (C677T)測序引物:5’AGGGAGGCTTCAACTACGC3’
(3)ACE (Ι/D)測序引物:5’ CTGGGCAACAGAGTGAGACC3’
反應(yīng)的體系為總體積5ul，包含PCR純化產(chǎn)物lul，25%Bigdye mixlul, 3.2uM DNA測序引物lul，去離子水2ul ；
在ABI2720型PCR擴增儀上進 行反應(yīng)，反應(yīng)條件為98°C 2min，進行25個循環(huán)的96 °C30s, 55°C 30s, 60°C 4min ；
反應(yīng)結(jié)束后加入125mM EDTA溶液Iul和100%乙醇溶液15ul，于室溫下沉淀15min ;在4°C , 3600rpm/min的轉(zhuǎn)速離心30min,輕輕倒去上清液；加入70%乙醇溶液30ul, 3600rpm/min離心15min，輕輕倒去上清液；室溫放置20min后加入HIDI溶液8ul，放入測序儀中。
[0019]5、基因型分析
熟悉DNA測序技術(shù)的本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠通過辨識DNA測序圖譜確定所檢測的SNP位點的基因型。
[0020]實施例2.為人群進行預(yù)防深靜脈血栓基因無創(chuàng)檢測的服務(wù)
1.采樣及抽提DNA
由醫(yī)院檢驗科醫(yī)師指導(dǎo)受檢者使用口腔采樣拭進行口腔上皮細胞取樣，采用酚氯仿法進行口腔上皮細胞的DNA抽提。
[0021]2.基因型檢測
使用本發(fā)明提供的試劑盒，對受檢者基因組DNA的EPCR基因上A6936G、MTHFR基因上C677T(rsl801133)、ACE基因上I/D (rs4646994)的3個單核苷酸多態(tài)性位點分別進行DNA測序，確定這3個SNPs位點的基因型。
[0022]3.深靜脈血栓高危人群風(fēng)險評估分析
通過對受檢者SNPs基因型的分析，出具深靜脈血栓風(fēng)險評估分析報告單。報告中詳細說明了受檢者EPCR基因上A6936G、MTHFR基因上C677T (rsl801133)、ACE基因上I/D(rs4646994)的3個SNP位點基因檢測信息以及遺傳風(fēng)險評估結(jié)果。除此之外，根據(jù)受檢者的風(fēng)險級別，并由醫(yī)師向受檢者詳細說明和解讀深靜脈血栓基因無創(chuàng)檢測報告單。
【權(quán)利要求】
1.一種篩查深靜脈血栓高危人群的基因無創(chuàng)檢測試劑盒，其特征在于:檢測EPCR基因上 A6936G、MTHFR 基因上 C677T (rsl801133)、ACE 基因上 I/D (rs4646994)的 3 個單核苷酸多態(tài)性位點基因型的特異性引物與DNA測序引物、Taq酶、dNTP混合液、反應(yīng)緩沖液、SAP酶、ExoI酶、BigDye mix、EDTA溶液、70%乙醇溶液、100%乙醇溶液、HIDI溶液、ddH20等。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于:所述的特異性引物對是指針對EPCR基因上 A6936G、MTHFR 基因上 C677T (rsl801133)、ACE 基因上 I/D (rs4646994)的 3 個單核苷酸多態(tài)性位點，能特異性擴增出包含這3個SNPs位點的DNA片段的引物對。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于:所述的DNA測序引物是針對EPCR基因上 A6936G、MTHFR 基因上 C677T (rsl801133)、ACE 基因上 I/D (rs4646994)的 3 個單核苷酸多態(tài)性位點而設(shè)計，能通過DNA測序技術(shù)特異性檢測出上述3個SNPs位點基因型的DNA測序引物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所示的試劑盒，其特征在于，所含的3對特異性引物序列如下: (I)EPCR (A6936G)正向引物:5’AGACAAATGGATGGACCTG3’ EPCR (A6936G)反向引物:5’ CAGACTAATTCAGCAAAGC3’
(2 ) MTHFR (C677T )正向引物:5’ AGGGAGGCTTCAACTACGC3’ MTHFR (C677T)反向引物:5’ GCGGTTGAGGGTGTAGAAGT3’ (3) ACE (Ι/D)正向引物:5’ CTGGGCAACAGAGTGAGACC3’
ACE (Ι/D)反向引物:5’ACCCAAGTGCCAGTGATGTT3’。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所含的3條DNA測序引物序列如下: (1)EPCR (A6936G)測序引物:5’ AGACAAATGGATGGACCTG3’ (2)MTHFR (C677T)測序引物:5’AGGGAGGCTTCAACTACGC3’ (3)ACE (Ι/D)測序引物:5’ CTGGGCAACAGAGTGAGACC3’。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于試劑盒的組分和含量包括: (1)?0?反應(yīng)體系:10父？0?反應(yīng)緩沖液2.5111，251111dNTP 混合液 0.2ul，5U / ul TaqDNA聚合酶0.125ul，20uM特異性引物對，每條引物各0.25ul，ddH20 19.175ul ； (2)PCR 產(chǎn)物純化體系:1 U / ul SAP 酶 0.75ul，10 U / ul ExoI 酶 0.375ul，ddH203.875ul ； (3)測序反應(yīng)體系:25%BigDye mixlul，3.2uM DNA測序引物 lul，125mM EDTA溶液 lul，100% 乙醇溶液 15ul,70% 乙醇溶液 30ul, HIDI 溶液 8ul, ddH20 2ul。
7.本試劑盒供一人份檢測應(yīng)用，試劑盒的保存溫度為_20°C。
【文檔編號】C12Q1/68GK103540649SQ201210236256
【公開日】2014年1月29日 申請日期:2012年7月10日 優(yōu)先權(quán)日:2012年7月10日
【發(fā)明者】石慧林 申請人:解碼（上海）生物醫(yī)藥科技有限公司