專利名稱：基因Ⅵb亞型新城疫病毒致弱株ⅥbI4及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及應(yīng)用反向遺傳技術(shù)，產(chǎn)生一種基因VIb亞型新城疫病毒致弱株VI bl4，用于制造疫苗。
背景技術(shù)：
反向遺傳操作技術(shù)(Reversegenetics manipulation technique)是指在體外通過構(gòu)建RNA病毒的感染性分子克隆，將病毒基因組RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，在DNA分子水平上對(duì)其進(jìn)行各種體外人工操作，由病毒基因組cDNA和各種輔助蛋白來組裝新的RNA病毒的一項(xiàng)石開究技術(shù)[Leyrer S，Neubert WJ, SedlmeierR. Rapid and efficient recovery of Sendaivirus from cDNA:factors influencing recombinant virus rescue. J Virol Methods1998，75(1) :47-58.]，也叫全長感染性cDNA克隆技術(shù)，又常被稱為“病毒拯救”。由于最 終“拯救”出的RNA病毒來源于cDNA克隆，因此，可通過中間過程中人為加入的DNA環(huán)節(jié)，在DNA水平上對(duì)RNA病毒基因組進(jìn)行各種體外人工操作，如進(jìn)行基因突變、基因插入、基因敲除(缺失)、等改造，解決了對(duì)RNA病毒基因組難以操作這一難題，極大地方便了人們進(jìn)行病毒各基因的功能、致病機(jī)理和病毒病防制策略的研究，同時(shí)為新型疫苗的研制和開發(fā)提供了新的思路[Engel-Herbert I, Werner O, Teifke JP, et al. Characterization of arecombinant Newcastle disease virus expressing the green fluorescent protein.JVirol Methods. 2003, 108(I):19-28.]。鴻新城疫(NewcastleDisease)是由鴻 I 型副黏病毒(pigeon paramyxovirus I,PPMV-I)引起鴿的一種高度接觸性，高發(fā)病率和高死亡率都很高的急性傳染病，其癥狀同雞新城疫相似。PPMV-I屬于禽副黏病毒科、腮腺炎病毒屬，通常被認(rèn)為是雞新城疫病毒(NDV)的變異株，基因組為單股負(fù)鏈RNA，長度為15kb，基因組序列為3’-NP-P-M-F-HN-L-5’，分別編碼6種蛋白核衣殼蛋白(NP)、磷蛋白(P)、基質(zhì)蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝素-神經(jīng)氨酸酶蛋白(HN)和大分子蛋白(L)。此外，P基因轉(zhuǎn)錄過程中，在484位會(huì)插入一或兩個(gè)額外的非模板鳥嘌呤核苷酸(G堿基)，發(fā)生RNA編輯現(xiàn)象而產(chǎn)生V和W蛋白，它們和P蛋白含有相同的N端，但是具有不同的C端[15]。其中F和HN兩種糖蛋白位于病毒囊膜表面，是分子生物學(xué)研究的首選基因。[Steward M, Vipond I B, Millar, et al. RNA editing inNewcastle disease virus. Journal of General Virology,1993，74:2539-2547.]。Dorina Ujvari 等[Ujvari D, Wehmann E, Kaleta EF,et al. Phylogeneticanalysis reveals extensive evolution of avian paramyxovirus type I strains ofpigeons(Columba livia)and suggests multiple species transmission. 2003, 96(1-2):63-73.]在1978 2002年對(duì)16個(gè)國家的鴿源新城疫分離株進(jìn)行序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，絕大多數(shù)屬于VIb亞型。有研究表明VIb亞型NDV大多數(shù)是從鴿群中分離得到[Kim LM, KingDJ, Guzman H, et al. Biological and phylogenetic characterization of pigeonparamyxovirus serotypes I circulating in wild North American pigeons anddoves. 2008,46(10) : 3303-3310.]，由此可見，VI b亞型NDV對(duì)鴿子具有較強(qiáng)的宿主特異性。近幾年來，我國養(yǎng)鴿業(yè)發(fā)展迅速，該病在國內(nèi)亦呈上升趨勢，甚至一些養(yǎng)鴿場呈暴發(fā)流行，給養(yǎng)鴿業(yè)帶來較大的經(jīng)濟(jì)損失，并且常常引起雞新城疫的流行。近年來，基因II型疫苗株LaSota已在鴿場得到了廣泛使用，但免疫鴿群中仍可發(fā)生VIb亞型NDV的感染與流行，表明當(dāng)前疫苗株并不能有效預(yù)防VI b亞型NDV的感染。該類病毒的F蛋白含有典型的強(qiáng)毒裂解位點(diǎn)，有些對(duì)鴿致病力較強(qiáng)而對(duì)雞卻屬于弱或中等毒力。VIb亞型NDV感染鴿后，體內(nèi)帶毒時(shí)間較長，排毒明顯高于其他基因型，吳雙等[吳雙王偉偉，曹軍平，等.不同基因型新城疫病毒對(duì)美國白羽王鴿的致病性研究.中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)2010，32:424.]對(duì)白羽王鴿的致病性試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)相對(duì)于JS-5-05-Go(VII d亞型)，WX-10-07-Pi(VI b亞型)感染組鴿的泄殖腔棉拭子在感染后第5d至15d內(nèi)均可檢測到排毒，而且排毒率明顯高于JS-5-05-GO感染組。加上鴿的活動(dòng)范圍較廣，使得該類病毒在鴿群中傳播迅速，家鴿和野鴿與家禽的偶然接觸也增加了其他家禽感染的風(fēng)險(xiǎn)。鴿源NDV通過雞或雞胚傳代后毒力增強(qiáng)的現(xiàn)象也多次被報(bào)道[Dortmans JC, Rottier PJ, Koch G, etal. Passaging of a Newcastle disease virus pigeon variant in chickens results inselection of viruses with mutations in the polymerase complex enhancing virusreplication and virulence. 2011，92 (2) : 336-345.]。因此，鴻源 NDV—旦突破了這種宿·主特異性而傳染給其他家禽，將會(huì)給養(yǎng)禽業(yè)帶來巨大的威脅。鴿源NDV被認(rèn)為是雞源NDV的變異株，其在抗原性上與雞源疫苗毒株存在明顯的差異[Dortmans JC, Koch G，RottierPJ,et al. A comparative infection study of pigeon and avian paramyxovirustypelviruses in pigeons:evaluation of clinical signs, virus shedding and seroconversion. 2011，40 (2) : 125-130]。研究證實(shí)，使用與流行株基因型一致的疫苗株能有效降低免疫禽群中NDV強(qiáng)毒的攜帶量及感染率(Hu S，Ma H, Wu Y, et al. A vaccine candidate ofattenuated genotype VII Newcastle disease virus generated by reverse genetics.Vaccine2009, 27(6) :904-910.)。鴿新城疫的預(yù)防應(yīng)該使用專門的鴿源新城疫疫苗。一個(gè)好的疫苗候選毒株需同時(shí)具有毒力弱、繁殖滴度高和遺傳穩(wěn)定性好的特點(diǎn)，而目前國內(nèi)外分離到的PPMV-I普遍存在強(qiáng)毒裂解位點(diǎn)、效價(jià)低和容易發(fā)生變異等缺點(diǎn)。大部分PPMV-IF蛋白裂解位點(diǎn)序列為強(qiáng)毒特征，在CEF上可以形成空斑，但對(duì)雞的致病力較弱，推測這種毒力的差異可能由于病毒的復(fù)制能力的差異而引起。Dortmans，J. C等將PPMV-I弱毒株AV324與強(qiáng)毒株Herts的NP、P、M和L基因互換，利用反向遺傳技術(shù)拯救出重組病毒，測定重組毒的ICPI、空斑試驗(yàn)，生物學(xué)特性試驗(yàn)結(jié)果表明NP、P、L蛋白對(duì)病毒的復(fù)制能力和毒力有直接影響[Dortmans JCj Rottier PJj Koch G，et al. The viralreplication complex is associated with the virulence of Newcastle disease virus. 2010，84(19): 10113-10120·]。2007年王偉偉等在發(fā)病的鴿群中，成功分離到了基因VIb亞型鴿源新城疫JS/07/04/Pi株，并進(jìn)行了全基因組測序，登錄號(hào)為FJ766526 (王偉偉.江蘇省新城疫病毒分子流行病學(xué)研究及鴿源分離株基因組序列的分析.揚(yáng)州大學(xué)碩士論文.揚(yáng)州，揚(yáng)州大學(xué)，2009. )。2012年，朱艷梅等構(gòu)建出了 JS/07/04/Pi株的全長表達(dá)克隆[朱艷梅，胡增魚，宋慶慶，等.鴻源新城疫病毒JS/07/04/Pi株感染性分子克隆的構(gòu)建及病毒拯救.病毒學(xué)報(bào).2012，28 (I)，67-72·]。2005年姚春峰等從發(fā)病鵝群中分離到基因VII型NDV毒株JS-5-05-GO，其尿囊液的HA價(jià)為81og2明顯高于JS/07/04/Pi株(姚春峰.我國部分地區(qū)新城疫病毒的部分生物學(xué)特性鑒定及分子流行病學(xué)研究.揚(yáng)州大學(xué)碩士學(xué)位論文.揚(yáng)州，2007，6. ),2011年胡增磊等構(gòu)建出該毒株的全長表達(dá)克隆pNDV/14，并成功將其致弱，致弱后的NDV/AI4,效價(jià)高達(dá) 101og2 [Hu Z, Hu S，Meng C，et al. Generation of a genotypeVII Newcastle disease virus vaccine candidate with high yield in embryonatedchicken eggs. Avian Dis2011, 55(3):391-397.]。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個(gè)目的在于發(fā)明一種基因VI b亞型鴿源新城疫病毒致弱株，從而解決當(dāng)前所用疫苗株與鴿新城疫流行株基因型不一致的問題。本發(fā)明基因VIb亞型新城疫病毒致弱株VI bI4，于2012年5月23日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC，中國，北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)中國科學(xué)院微生物研究所)，其保藏號(hào)CGMCC No 61490·
本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供一種基因VIb亞型鴿源新城疫病毒致弱株VIbI4的構(gòu)建方法本發(fā)明利用已建立的鴿源新城疫病毒的反向遺傳操作平臺(tái)，將JS/07/04/Pi株的F裂解位點(diǎn)突變致弱后，將繁殖性能較高的新城疫病毒rNDV/I4的NP、P和L基因片段替換轉(zhuǎn)錄載體ApTVT/071204上的對(duì)應(yīng)部分構(gòu)建出重組質(zhì)粒ApTVT/ VI bI4，該重組質(zhì)粒與輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染BSR-T7/5細(xì)胞后，獲得了具有較高繁殖性能的基因VI b亞型鴿源新城疫致弱株VIbI4,適合于疫苗的大規(guī)模生產(chǎn)。另外，該致弱毒株為基因VI b亞型與當(dāng)前我國鴿新城疫流行株的基因型相一致，因此，同常規(guī)疫苗(基因I和II型)相比，致弱株VI bI4在控制當(dāng)前鴿新城疫的發(fā)病和流行方面顯示出了廣闊的應(yīng)用前景。本發(fā)明包括以下具體步驟I)新城疫病毒JS/07/04/Pi株的F蛋白致弱突變構(gòu)建陽性質(zhì)粒APF 分別從JS/07/04/Pi株基因組的4107nt 4903nt，4871ηΓ5676η 位置通過Overlap PCR克隆出部分F基因片段，在質(zhì)粒pCR2. I載體中相連，獲得陽性質(zhì)粒APF ；分別將APF與P34用Afl II和Bsu36 I進(jìn)行雙酶切后，回收目的片段，連接構(gòu)建成AP34 ;將質(zhì)粒AP34與P58用BstB I和Xba I雙酶切，回收目的片段后連接成中間質(zhì)粒AP38，最后將AP38用Age I和Mlu I雙酶切后替換到pTVT/071204的對(duì)應(yīng)序列，構(gòu)建出重組質(zhì)粒ApTVT/071204，具體的構(gòu)建模式見圖I。兩對(duì)突變引物分別是APFl 5’GTGATGTACTCGGACCTTCTGTGCTTGT3’ (SEQ ID No. I)APF2 5’ATAAGGCGCCCTTGCCTCCCTCCTCCTGATGTGGACA3’ (SEQ ID No. 2)APF3 5，ACATCAGGAGGAGGGAGGCAAGGGCGCCTTAT3，(SEQ ID No. 3)APF4 5’TCAGTCTTTGAATACATGCAGGCTGATG3’ (SEQ ID No. 4)2)重組病毒VI bI4株的拯救由于rNDVI4和JS/07/04/Pi病毒基因組的2880bp和9520bp位置均有相同的單酶切位點(diǎn)Age I和FspA I，所以將pNDV/14和ApTVT/071204用Age I和FspA I雙酶切后，回收ApTVT/071204小片斷、pNDV/14大片段，連接成重組質(zhì)粒ApTVT/VI bI4。具體的構(gòu)建模式見圖2。將質(zhì)粒ApTVT/ VI bI4與pCI_NP、pCI-P和pCI_L三個(gè)真核表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染BSR-T7/5細(xì)胞，轉(zhuǎn)染18h后加入終濃度為10%的SPF雞胚尿囊液，轉(zhuǎn)染60h后將轉(zhuǎn)染樣品接種擴(kuò)11日齡SPF雞胚，即獲得基因VI b亞型新城疫病毒致弱株VI bI4。上述基因VI b亞型新城疫病毒致弱毒株VI bI4的構(gòu)建方法，其特征在于步驟I)中通過APF1+APF2和APF3+APF4兩對(duì)突變弓I物分別擴(kuò)增APFa和APFb兩個(gè)片段，凝膠電泳回收APFa和APFb，用弓I物APFl和APF4將以上兩個(gè)擴(kuò)增片段通過Overlap PCR方法相連，得到裂解位點(diǎn)產(chǎn)生突變的擴(kuò)增片段APF，將其替換中間質(zhì)粒P34的對(duì)應(yīng)部分得到質(zhì)粒AP34，該質(zhì)粒AP34和P58相連得到AP38，利用AP38中含有的Age I和Mlu I，替換轉(zhuǎn)錄載體pTVT/071204上的對(duì)應(yīng)部分從而獲得了突變后的質(zhì)粒ApTVT/071204。


圖I重組質(zhì)粒ApTVT/071204構(gòu)建模式圖。圖2重組質(zhì)粒ApTVT/ VI bI4構(gòu)建模式圖。圖3重組質(zhì)粒ApTVT/ VI bI4的Afl II和Xho I酶切鑒定。其中
I.ApTVT/ A/I bI4digested with Afl II ;2· ApTVT/ A/I bI4digested with Xho I ；M. DNAMarker 圖4F蛋白裂解位點(diǎn)突變模式圖(方框中為突變序列)。圖5致弱株VI bI4的RT-PCR鑒定。圖6致弱株VI bI4滅活苗免疫鴿后誘導(dǎo)抗體的產(chǎn)生情況(以鴿源毒株070422作為檢測抗原)。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明構(gòu)建的基因VI b亞型鴿源新城疫病毒致弱毒株VI bI4于2012年5月23日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏單位地址中國科學(xué)院微生物研究所，其保藏號(hào)CGMCC No :6149，其長度為15192bp。構(gòu)建步驟一鴿新城疫病毒致弱全長表達(dá)克隆構(gòu)建生物材料準(zhǔn)備新城疫病毒JS/07/04/Pi株的全長表達(dá)克隆pTVT/071204，及其中間質(zhì)粒P34、P58 [朱艷梅，胡增壘，宋慶慶，等.鴿源新城疫病毒JS/07/04/Pi株感染性分子克隆的構(gòu)建及病毒拯救.病毒學(xué)報(bào).2012，28 (1),67-72.]由揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)業(yè)部畜禽傳染病實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建、保存。申請(qǐng)人承諾自申請(qǐng)日起向公眾發(fā)放二十年。pCR2. I 載體購自 Invitrogen 公司。I、F裂解位點(diǎn)的突變?cè)O(shè)計(jì)2對(duì)引物用于突變擴(kuò)增JS/07/04/Pi株基因組F基因4107nt 5676nt約1569bp大小的片段。兩對(duì)突變引物分別是APFl 5’ GTGATGTACTCGGACCTTCTGTGCTTGT3’
APF2 5’ ATA\(,.GCGCmTGCCTCCr TCCTCCTGATGTGGACA’r 和APF3 5' ACATCAGGAGCA (；GGAGGC4A(,，(；GCGCdTAT 3'APF4 5’ TCAGTCTTTGAATACATGCAGGCTGATG3’突變堿基由斜體標(biāo)注，重疊部分有下劃線標(biāo)注。以上引物由上海生物工程有限公司合成。PCR反應(yīng)以轉(zhuǎn)錄載體pTVT/071204為模板配制如下PCR反應(yīng)體系
10><Expand Buffer2.5 μ
I .M Primer ( 50 μ mol/ L)0.5μι,·
I:游 Primer (50 μ mol/ L)0.5llL
dNTPs(10mmol/L)0.5 μL
Expand High Fidelity Polymerase(3.5 υ/μ )0.1 μL
模板 cDNA (1:500 稀釋)Ιμ
MgS04i.uL
s\\18.9μ PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)94°C預(yù)變性2min ；94°C 20s，56°C 30s，72°C延伸，延伸時(shí)間為lmin/kb, 20 循環(huán)后 72°C延伸 10min,4°C保存。用引物APFl和APF2擴(kuò)增病毒基因組的4107nt 4903nt區(qū)域，用引物APF3和APF4擴(kuò)增基因組的4871nt 5676nt區(qū)域。Overlap PCR反應(yīng)體系及條件
I OxReaction Buffer2.5 μL
PrimerAPFl ( 50pmol/iiL)0.5liL
Primer APF4(50pmol,^L)0.5‘uL
dNTPs( I Ommol/ L)0.5 μL
Expand High Fidelity Polymerase (3.5 U/pL.)0.1 pL
APF〗和APF2擴(kuò)增片段(APFa)Ιμ
APF3 和 APF4 擴(kuò)增片-段(APFb)Ιμ ,
SW18.9‘liLPCR /乂應(yīng)循環(huán)參數(shù)94 °C預(yù)變性4min ;50°C退火lmin，72°C延伸5min，之后再94°C 20s, 56°C 30s，72。。延伸 2min30s，20 循環(huán)后 72°C延伸 10min，4°C保存。用引物APFI和APF4將以上兩個(gè)擴(kuò)增片段通過Overlap PCR方法相連(Overlap部分在上述引物中以下劃線標(biāo)注)，得到裂解位點(diǎn)發(fā)生4個(gè)氨基酸突變的F基因片段，突變模式見圖4。2、全長致弱質(zhì)粒的構(gòu)建PCR產(chǎn)物經(jīng)回收純化后與pCR2. I載體相連，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒，質(zhì)粒提取后送南京金斯瑞生物有限公司進(jìn)行測序驗(yàn)證，陽性質(zhì)粒命名為APF，分別將APF與P34用Afl II和Bsu36 I進(jìn)行雙酶切后，回收目的片段，連接構(gòu)建成AP34 ;將質(zhì)粒AP34與P58用BstB I和Xba I雙酶切，回收目的片段后連接成中間質(zhì)粒AP38。最后將目的片段AP38經(jīng)Age I和Mlu I酶切后替換轉(zhuǎn)錄載體pTVT/071204上的對(duì)應(yīng)序列。重組質(zhì)粒用PCR方法鑒定，陽性克隆命名為ApTVT/071204。(見圖I)。步驟二 重組病毒VI bI4株的拯救生物材料準(zhǔn)備pNDV/14 [Hu Z, Hu S，Meng C，et al. Generation of a genotype VII Newcastledisease virus vaccine candidate with high yield in embryonated chicken eggs.Avian Dis2011, 55(3):391-397.]由揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)業(yè)部畜禽傳染病實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建、保存。pCI-NP、pCI-P、pCI_L真核表達(dá)質(zhì)粒(胡順林.鵝源新城疫病毒反向遺傳技術(shù)平 臺(tái)的建立及其應(yīng)用.揚(yáng)州揚(yáng)州大學(xué)；2007)由揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)業(yè)部畜禽傳染病學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建、保存。BSR-T7/5 細(xì)胞[Romer-Oberdorfer, A.，et al. , Generat ion ofrecomb inant lentogenic Newcastle disease virus from cDNA. J GenVirol, 1999. 80(11) :2987-2995.]由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所步志高研究員惠贈(zèng)?；騃I型疫苗株Lasota由揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)業(yè)部畜禽傳染病實(shí)驗(yàn)室保存。VI b亞型070422株由揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)業(yè)部畜禽傳染病實(shí)驗(yàn)室于2007年發(fā)病鴿中分離并保存。以上生物材料申請(qǐng)承諾自申請(qǐng)日起向公眾提供20年。I、NP、P、L基因的替換將pNDV/14 和 ApTVT/071204 用 Age I 和 FspA I 雙酶切后，回收 ApTVT/071204 小片斷、pNDV/14大片段，連接成重組質(zhì)粒ApTVT/VI bI4。見圖2.2、重組質(zhì)粒ApTVT/ VI bI4的酶切鑒定質(zhì)粒ApTVT/ VI bI4經(jīng)Afl II酶切電泳后將出現(xiàn)2. 2kb、6. 3kb、9. 4kb大小的條帶，而經(jīng)Xho I酶切后出現(xiàn)I. 7kb、l. 8kb、6. 3kb和8. 4kb大小的條帶，由于I. 7kb和I. 8kb相差太小，電泳僅呈現(xiàn)一條帶。(見圖3)。3、重組病毒VI bI4株的拯救將5X 105BSR-T7/5細(xì)胞接種于35_ dish中，用含lmg/mL G418和10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)過夜，約60°/Γ80%鋪滿時(shí)用于轉(zhuǎn)染。將pCI-NP、pCI_P和pCI_L3個(gè)真核表達(dá)質(zhì)粒與含有NDV基因組cDNA全長的轉(zhuǎn)錄載體(ApTVT/ VI bI4)共轉(zhuǎn)染BSR-T7/5細(xì)胞，18_24h后加入10%SPF胚尿囊液，60h后將轉(zhuǎn)染樣品用封口膜(paraf ilm)封好，轉(zhuǎn)移到_70°C低溫冰箱反復(fù)凍融2次，然后將轉(zhuǎn)染細(xì)胞輕輕刮下，與細(xì)胞上清充分混合后接種擴(kuò)11日齡SPF雞胚，每個(gè)樣品接種3枚，0. 4mL/枚，37°C孵育。定時(shí)照胚，棄去24h內(nèi)死亡胚。取出24h后死亡胚置于4°C充分冷卻，待雞胚血管收縮后收集尿囊液。收集的尿囊液均按OIE標(biāo)準(zhǔn)所測HA效價(jià)為91og2，與母本VI b亞型毒株JS/07/04/Pi相比上升了 2個(gè)滴度。4、新城疫病毒致弱毒株VI bI4的RT-PCR鑒定將HA和HI檢測均為陽性的尿囊液在SPF雞胚上傳兩代后，收集尿囊液，抽提RNA用于RT-PCR反應(yīng)，利用引物APFl和APF4擴(kuò)增F基因長度約為1500bp左右大小的片段，回收目的片段進(jìn)行測序鑒定，擴(kuò)增片段的測序結(jié)果顯示F基因的裂解位點(diǎn)已突變成功(圖5)。用于擴(kuò)增新城疫病毒致弱毒株VI bI4中F基因的引物序列為APFl 5’ GTGATGTACTCGGACCTTCTGTGCTTGT3’
APF4 5’ TCAGTCTTTGAATACATGCAGGCTGATG3’步驟三、致弱毒株的生物學(xué)特性鑒定1、MDT 與 ICPI 的測定用滅菌生理鹽水分別連續(xù)10倍(10_3、10_4……10_7)遞增稀釋致弱病毒VI bI4，每個(gè)稀釋度接種5只9 11日齡SPF雞胚，37°C孵育5d，按OIE標(biāo)準(zhǔn)方法計(jì)算病毒的MDT ;致弱病毒的尿囊液以滅菌生理鹽水10倍稀釋后經(jīng)腦內(nèi)接種10只I日齡的SPF雞，按OIE標(biāo)準(zhǔn)方法計(jì)算病毒的ICPI。病毒5個(gè)稀釋度的接種雞胚在120h內(nèi)沒有發(fā)生死亡，說明該毒株的MDT值大于120h ;尿囊液經(jīng)腦內(nèi)接種I日齡SPF雞后，ICPI的測定值僅為O. 15，表明獲救病毒的毒力完全符合弱毒株的標(biāo)準(zhǔn)。2、致弱毒株的免疫原性試驗(yàn) 將30只40日齡非免疫肉鴿分為3組，每組10只。第I組和第2組按O. 5ml/只的量，經(jīng)肌肉注射基因II型Lasota (IV系苗，市售)和本發(fā)明致弱疫苗株VI bI4制成的油苗，第3組免疫相同劑量PBS做皮下注射。免疫后分別于第I周、第2周、第3周、第4周采血分離血清，分別用基因VI b亞型病毒JS-07-22-Pi (由揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)業(yè)部畜禽傳染病學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室分離保存，基因組序列登錄號(hào)FJ766526)和基因II型LaSota為4單位抗原，測定6組鴿在第1-4周內(nèi)的抗體水平。結(jié)果滅活苗組VI bI4同LaSota免疫組于第4周免疫鴿抗體水平均可達(dá)到61og2以上，同時(shí)PBS免疫組一直為O并且用VI b亞型毒株做抗原時(shí)。VI bI4滅活苗組的抗體水平比LaSota組高2個(gè)滴度，表明VI bI4滅活苗在預(yù)防鴿新城疫方面明為優(yōu)于LaSota (圖6)。
權(quán)利要求
1.基因VIb亞型鴿源新城疫病毒致弱株VIbI4，它的保藏號(hào)CGMCC No :6149。
2.權(quán)利要求I所述基因VIb亞型新城疫病毒致弱株VIbI4株的構(gòu)建方法，其特征在于對(duì)含有鴿源新城疫病毒JS/07/04/Pi基因組全長的轉(zhuǎn)錄載體pTVT/071204中的F基因進(jìn)行致弱突變后，得到F基因致弱后的轉(zhuǎn)錄載體ApTVT/071204，再利用基因重組的方法將新城疫病毒rNDV/I4的NP、P和L基因片段替換ApTVT/071204基因組的對(duì)應(yīng)部分，得到重組質(zhì)粒ApTVT/ VI bI4，該質(zhì)粒與輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染BSR-T7/5細(xì)胞后獲得重組病毒VI bI4。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述基因VIb型新城疫病毒致弱株VI bI4的構(gòu)建方法，其特征在于包括以下具體步驟 1)新城疫病毒JS/07/04/Pi株的F蛋白致弱突變 構(gòu)建陽性質(zhì)粒APF :分別從JS/07/04/Pi株基因組的4107 nt 4903 nt，4871 nt 5676nt位置通過Overlap PCR克隆出部分F基因片段，在質(zhì)粒pCR2. I載體中相連，獲得陽性質(zhì)粒 APF ； 分別將APF與P34用J/7 II和fci/36 I進(jìn)行雙酶切后，回收目的片段，連接構(gòu)建成AP34 ；將質(zhì)粒AP34與P58用I和油a I雙酶切，回收目的片段后連接成中間質(zhì)粒AP38，最后將AP38用J職1和#々/ I雙酶切后替換pTVT/071204的對(duì)應(yīng)序列，構(gòu)建出重組質(zhì)粒ApTVT/071204, 兩對(duì)突變引物分別是 APFl 5’ GTGATGTACTCGGACCTTCTGTGCTTGT 3’APF2 5’ ATAAGGCGCCCTTGCCTCCCTCCTCCTGATGTGGACA 3’ APF3 5’ ACATCAGGAGGAGGGAGGCAAGGGCGCCTTAT 3’ APF4 5’ TCAGTCTTTGAATACATGCAGGCTGATG 3’ 2)重組病毒VIbI4株的拯救 由于rNDV/I4和JS/07/04/Pi病毒基因組的2880bp和9520bp位置均有相同的單酶切位點(diǎn)A供I和Fspk I，因此，將含有rNDV/I4基因組的轉(zhuǎn)錄載體pNDV/I4和ApTVT/071204以乂職I和I同時(shí)進(jìn)行雙酶切后，回收ApTVT/071204小片斷、pNDV/I4大片段，連接成重組質(zhì)粒ApTVT/VI bI4 ； 將質(zhì)粒ApTVT/ VI bI4與pCI-NP、pCI-P和pCI_L三個(gè)真核表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染BSR-T7/5細(xì)胞，轉(zhuǎn)染18h后加入終濃度為10%的SPF雞胚尿囊液，轉(zhuǎn)染60h后將轉(zhuǎn)染樣品接種9 11日齡SPF雞胚，即獲得基因VI b亞型新城疫病毒致弱株VI bI4。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述基因VIb亞型新城疫病毒致弱毒株VI bI4株的構(gòu)建方法，其特征在于步驟I)中通過APF1+APF2和APF3+APF4兩對(duì)突變引物分別擴(kuò)增APFa和APFb兩個(gè)片段，凝膠電泳回收APFa和APFb，用引物APFl和APF4將以上兩個(gè)擴(kuò)增片段通過OverlapPCR方法相連，得到裂解位點(diǎn)產(chǎn)生突變的擴(kuò)增片段APF，將其連接到中間質(zhì)粒中得到AP38，利用AP38中含有的J職I和#7 I，替換轉(zhuǎn)錄載體pTVT/071204上的對(duì)應(yīng)部分從而獲得了突變后的質(zhì)粒ApTVT/071204。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因Ⅵb亞型鴿源新城疫病毒致弱株ⅥbI4及其構(gòu)建方法。所述基因Ⅵb亞型鴿源新城疫病毒致弱株ⅥbI4，它的保藏號(hào)CGMCCNo6149。本發(fā)明涉及應(yīng)用反向遺傳技術(shù)，利用含有鴿源新城疫病毒JS/07/04/Pi基因組全長的轉(zhuǎn)錄載體pTVT/071204，對(duì)其F基因進(jìn)行致弱突變后獲得轉(zhuǎn)錄載體ApTVT/071204，再將新城疫病毒rNDV/I4的NP、P和L基因片段替換ApTVT/071204上的對(duì)應(yīng)部分，得到重組質(zhì)粒ApTVT/ⅥbI4，該質(zhì)粒與輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染BSR-T7/5細(xì)胞后成功拯救出重組病毒ⅥbI4。該病毒在雞胚上具有較高的繁殖滴度，適合于疫苗的大規(guī)模生產(chǎn)，可用于制造疫苗。
文檔編號(hào)C12N15/85GK102776156SQ201210240399
公開日2012年11月14日 申請(qǐng)日期2012年7月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月12日
發(fā)明者劉秀梵, 朱艷梅, 王曉泉, 胡增壘, 胡順林 申請(qǐng)人:揚(yáng)州大學(xué)