專利名稱：一種施羅氏弧菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)引物、檢測(cè)試劑盒和檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediatedisothermal ampification,LAMP)技術(shù)原理而開發(fā)的施羅氏弧菌(Vibrio shilonii)的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)引物、檢測(cè)試劑盒和檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
施羅氏弧菌(Vibrio shilonii)是一種海洋弧菌,能夠侵染珊瑚，引起珊瑚的細(xì)菌性白化。目前，施羅氏弧菌的檢測(cè)方法主要是傳統(tǒng)的微生物分類鑒定方法及依賴于PCR技術(shù)的檢測(cè)方法。傳統(tǒng)的微生物分類和鑒定方法主要足以微生物的形態(tài)學(xué)和生理生化等特性作為判斷依據(jù)，雖然結(jié)果可信度高，但是繁瑣且費(fèi)時(shí)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)靈敏度高，可達(dá)98% 100%，但是特異性較差，而且需要PCR擴(kuò)增儀、凝膠電泳儀等相關(guān)貴重設(shè)備，不利于基層實(shí)驗(yàn)站及現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediatedisothermal amplification, LAMP)技術(shù)是Notomi等于2000午報(bào)道的一種新型等溫核酸擴(kuò)增方法，該法針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4條特異引物，利用一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶(Bst DNA聚合酶)，在恒溫條件(65°C左右)孵育約60min，即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)，產(chǎn)生肉眼可見的反應(yīng)副產(chǎn)物一白色焦磷酸鎂沉淀。通過逆轉(zhuǎn)錄酶，還可進(jìn)行RT-LAMP而完成針對(duì)RNA的擴(kuò)增。該技術(shù)具有不需要PCR儀、肉眼可判斷結(jié)果及反應(yīng)時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)。擴(kuò)增結(jié)果也可用結(jié)合雙鏈DNA的熒光染料SYBRGreen I染色，在紫外燈或日光下通過肉眼進(jìn)行判定，如果含有擴(kuò)增產(chǎn)物，反應(yīng)混合物變綠；反之，則保持SYBR Green I的橙色不變。目前LAMP技術(shù)已有成功用于其他病原體檢測(cè)的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種檢測(cè)能力強(qiáng)、檢測(cè)限高、檢測(cè)時(shí)間短、特異性高、對(duì)儀器設(shè)備要求簡(jiǎn)單的施羅氏弧菌(Vibrio shilonii)的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)檢測(cè)引物、檢測(cè)試劑盒和檢測(cè)方法。本發(fā)明利用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，以施羅氏弧菌的toxR基因(Genebank登錄號(hào)為EU727208. I)為靶基因設(shè)計(jì)特異性引物，進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，并優(yōu)化反應(yīng)條件，在環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)過程中加入陽性對(duì)照質(zhì)控品和陰性對(duì)照質(zhì)控品，最后通過電泳分析或SYBR Green I熒光染色顯色法檢測(cè)陽性對(duì)照質(zhì)控品的擴(kuò)增產(chǎn)物、陰性對(duì)照質(zhì)控品的擴(kuò)增產(chǎn)物和目標(biāo)樣品組的擴(kuò)增產(chǎn)物，從而判斷目標(biāo)樣品是否含有施羅氏弧菌，達(dá)到簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、快捷和靈敏的效果，從而實(shí)現(xiàn)了本發(fā)明的目的。本發(fā)明的施羅氏弧菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)引物，其特征在于，所述的檢測(cè)引物如下所示前外引物F3 :5、-CAAACGGTTGGCGGTGTC-3,；(如 SEQ ID NO. I 所示)
后外引物B3 :5、-CCGCAAGATGCTGAAGGATC-3、；(如 SEQ ID NO. 2 所示)前內(nèi)引物FIP:5、-CTGCAAGAGCCAAACTCTGCGTCTTITGGAGCTGGTGGGAT-3、；(如SEQ IDNO. 3所示)后內(nèi)引物BIP :5、-GCTTCTGATGAAGCGACAGGCAGTAAAGACGGTGCCTAAGCG-3、；(如 SEQID NO. 4 所示)。本發(fā)明的施羅氏弧菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒，包括環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液、BstDNA聚合酶、陽性對(duì)照質(zhì)控品、陰性對(duì)照質(zhì)控品和檢測(cè)引物，其特征在于，所述的檢測(cè)引物包括前外引物F3 :5、-CAAACGGTTGGCGGTGTC-3,；(如 SEQ ID NO. I 所示)后外引物B3 :5、-CCGCAAGATGCTGAAGGATC-3、；(如 SEQ ID NO. 2 所示)前內(nèi)引物FIP:5、-CTGCAAGAGCCAAACTCTGCGTCTTITGGAGCTGGTGGGAT-3、；(如SEQ IDNO. 3所示)后內(nèi)引物BIP :5、-GCTTCTGATGAAGCGACAGGCAGTAAAGACGGTGCCTAAGCG-3、；(如 SEQIDN0. 4 所示)。所述的陽性對(duì)照質(zhì)控品優(yōu)選為含有施羅氏弧菌的toxR基因(Genebank登錄號(hào)為EU727208. I)的質(zhì)粒DNA，可以通過人工的方法構(gòu)建，如PCR的方法從施羅氏弧菌的基因組DNA擴(kuò)增得到toxR基因。所述的陰性對(duì)照質(zhì)控品為不同于施羅氏弧菌的toxR基因(Genebank登錄號(hào)為EU727208. I)的DNA序列即可。本發(fā)明的陽性對(duì)照質(zhì)控品和陰性對(duì)照質(zhì)控品是衡量實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果是否有效的重要標(biāo)志。在每批實(shí)驗(yàn)中，必須引入一個(gè)Vibrio shilonii的陽性對(duì)照質(zhì)控品的檢測(cè)，以保證反應(yīng)體系不會(huì)出現(xiàn)假陰性反應(yīng)；同樣的，在每批實(shí)驗(yàn)中，必須引入一個(gè)陰性對(duì)照質(zhì)控品的檢測(cè)，以保證反應(yīng)體系不會(huì)出現(xiàn)假陽性結(jié)果。本發(fā)明的非診斷目的的施羅氏弧菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟(I)對(duì)樣品進(jìn)行增菌培養(yǎng)，提取增菌液中菌體的基因組DNA作為模板；(2)使用上述施羅氏弧菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)引物，與環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液、BstDNA聚合酶和樣品菌體的基因組DNA混合形成擴(kuò)增反應(yīng)體系，進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，以陽性對(duì)照質(zhì)控品和陰性對(duì)照質(zhì)控品分別作為陽性對(duì)照和陰性對(duì)照；(3)擴(kuò)增反應(yīng)完成后，通過與陽性對(duì)照和陰性對(duì)照進(jìn)行對(duì)比，判斷樣品擴(kuò)增反應(yīng)體系中是否擴(kuò)增得到擴(kuò)增產(chǎn)物，來判斷樣品中是否含有施羅氏弧菌。所述的通過與陽性對(duì)照和陰性對(duì)照進(jìn)行對(duì)比，判斷樣品擴(kuò)增反應(yīng)體系中是否擴(kuò)增得到擴(kuò)增產(chǎn)物，來判斷樣品中是否含有施羅氏弧菌具體優(yōu)選為通過電泳分析或SYBR GreenI熒光染色顯色法同時(shí)檢測(cè)陽性對(duì)照、陰性對(duì)照和樣品擴(kuò)增反應(yīng)體系的擴(kuò)增產(chǎn)物，根據(jù)是否有梯狀電泳條帶或反應(yīng)體系的顏色來判斷樣品中是否有施羅氏弧菌。
SYBR Green I染色若反應(yīng)混合物變綠，說明含有擴(kuò)增產(chǎn)物，樣品中含有施羅氏弧菌(Vibrio shilonii);反之,反應(yīng)混合物保持SYBR Green I的橙色不變,則樣品中不含有施羅氏弧菌(Vibrio shilonii)。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)若樣品擴(kuò)增反應(yīng)體系的擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳條帶呈現(xiàn)特異性的梯狀條帶，說明反應(yīng)混合物中含有目的產(chǎn)物，樣品中含有施羅氏弧菌(Vibrio shilonii)；若無梯狀條帶產(chǎn)生，說明樣品中不含有施羅氏弧菌(Vibrio shilonii)。所述步驟(2)的擴(kuò)增反應(yīng)體系優(yōu)選為8mmol/LMgS04>I. Ommol/L dNTPs、0. 8mol/Lbetaine (甜菜堿)、1. 2 u mol/L 前內(nèi)引物 FIP、L 2 u mol/L 后內(nèi)引物 BIP、0. 2 u mol/L 前外引物 F3、0. 2iimol/L 后外引物 B3、4X104U/L Bst DNA 聚合酶、I XThermoPol buffer、適量的模板DNA和水。所述步驟(2)的進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，其反應(yīng)參數(shù)優(yōu)選為65°C溫育I小時(shí)，然后80°C滅活lOmin，最后10°C保存。所述的陽性對(duì)照質(zhì)控品優(yōu)選為含有施羅氏弧菌的toxR基因(Genebank登錄號(hào)為EU727208. I)的質(zhì)粒DNA，可以通過人工的方法構(gòu)建，如PCR的方法從施羅氏弧菌的基因組DNA擴(kuò)增得到toxR基因。所述的陰性對(duì)照質(zhì)控品為不同于施羅氏弧菌的toxR基因(Genebank登錄號(hào)為 EU727208. I)的DNA序列即可。本發(fā)明一方面是填補(bǔ)在施羅氏弧菌(Vibrio shilonii)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)檢測(cè)技術(shù)方面的空白，使施羅氏弧菌(Vibrio shilonii)檢測(cè)技術(shù)達(dá)到國(guó)際先進(jìn)水平，檢測(cè)能力大幅提高，施羅氏弧菌(Vibrio shilonii)的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)檢測(cè)方法的檢測(cè)限高于傳統(tǒng)檢測(cè)方法100 200倍；另一方面本發(fā)明的施羅氏弧菌(Vibrio shilonii)的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)檢測(cè)方法具有儀器設(shè)備要求簡(jiǎn)單(只需要簡(jiǎn)單結(jié)構(gòu)的恒溫箱)、檢測(cè)時(shí)間短(0. 5^1. 0小時(shí))、特異性高(針對(duì)靶基因的8/6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)6/4種特異引物)等特點(diǎn)，彌補(bǔ)了經(jīng)典聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增技術(shù)對(duì)儀器設(shè)備要求高(如PCR擴(kuò)增儀、瓊脂凝膠電泳系統(tǒng)等)、技術(shù)較為復(fù)雜等諸多弊端，具有檢測(cè)能力強(qiáng)、檢測(cè)時(shí)間短、對(duì)儀器設(shè)備要求簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)，具有廣闊的應(yīng)用前景。


圖I是實(shí)施例3中的樣品、陽性對(duì)照質(zhì)控品和陰性對(duì)照質(zhì)控品的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)后的擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖，其中M marker ;1、2為陽性對(duì)照；3、4為陰性對(duì)照；5為樣品；圖2是實(shí)施例3中的樣品、陽性對(duì)照質(zhì)控品和陰性對(duì)照質(zhì)控品的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)后的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)熒光染色后的結(jié)果圖，其中1、2、3為陽性對(duì)照的三個(gè)重復(fù)，4、5是樣品的兩個(gè)重復(fù)，6、7、8為陰性對(duì)照的三個(gè)重復(fù)。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例I :引物的設(shè)計(jì)和合成按照環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物的設(shè)計(jì)原則，利用Genebank數(shù)據(jù)庫查找施羅氏弧菌中適用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的基因序列，選定toxR基因(Genebank登錄號(hào)為EU727208. I)為靶基因，針對(duì)施羅氏弧菌(Vibrio shilonii)的toxR基因設(shè)計(jì)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物。按照LAMP引物設(shè)計(jì)原則，利用Genebank數(shù)據(jù)庫查找Vibrio shilonii的LAMP基因序列,選取其特異性序列，利用PrimerExplorer IV軟件進(jìn)行進(jìn)一步分析,針對(duì)施羅氏弧菌的祀基因設(shè)計(jì)一套引物。
由此設(shè)計(jì)的施羅氏弧菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)引物為前外引物F3 :5、-CAAACGGTTGGCGGTGTC-3、；后外引物B3 :5、-CCGCAAGATGCTGAAGGATC-3、；前內(nèi)引物 FIP : 5、-CTGCAAGAGCCAAACTCTGCGTCTTTTGGAGCTGGTGGGAT-3、；后內(nèi)引物BIP :5、-GCTTCTGATGAAGCGACAGGCAGTAAAGACGGTGCCTAAGCG-3、。實(shí)施例2:核酸提取從37°C搖床培養(yǎng)10小時(shí)的施羅氏弧菌菌懸液中吸取菌液lmL，12000r/min離心5min,去上清,在沉淀中加入100 u L無菌水,混勻后，于100°C水浴IOmin,再冰浴2min,12000r/min離心5min，上清液即為施羅氏弧菌基因組DNA，將其作為DNA模板用于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)。實(shí)施例3 :環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)樣品的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系，反應(yīng)體系25 ii L，包括實(shí)施例2的DNA模板2 u L, I XThermoPol緩沖液(反應(yīng)體系終濃度),8mmol/L MgSO4(反應(yīng)體系終濃度)，I. Ommol/LdNTPs(反應(yīng)體系終濃度)，0. 8mol/L betaine(反應(yīng)體系終濃度)，I. 2u mol/L前內(nèi)引物FIP(反應(yīng)體系終濃度)，I. 2 u mol/L后內(nèi)引物BIP (反應(yīng)體系終濃度)，0. 2 u mol/L前外引物F3(反應(yīng)體系終濃度)，0. 2 u mol/L后外引物B3 (反應(yīng)體系終濃度)，IUBstDNA聚合酶，用滅菌去尚子水補(bǔ)齊至25 u L0陽性對(duì)照質(zhì)控品的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系，反應(yīng)體系25 UL，包括人工構(gòu)建的含有施羅氏弧菌toxR基因的質(zhì)粒DNA2ii L，I X ThermoPol緩沖液(反應(yīng)體系終濃度)，8mmoI/LMgSO4 (反應(yīng)體系終濃度)，I. Ommol/L dNTPs (反應(yīng)體系終濃度),0. 8mol/L betaine(反應(yīng)體系終濃度)，I. 2 u mol/L前內(nèi)引物FIP (反應(yīng)體系終濃度)，I. 2 u mol/L后內(nèi)引物BIP(反應(yīng)體系終濃度)，0. 2 ii mol/L前外引物F3 (反應(yīng)體系終濃度),0. 2 y mol/L后外引物B3(反應(yīng)體系終濃度)，IU Bst DNA聚合酶，用滅菌去離子水補(bǔ)齊至25 iiL。所述的人工構(gòu)建的含有施羅氏弧菌toxR基因的質(zhì)粒DNA的制備方法為以pUC19質(zhì)粒作為載體，根據(jù)Genebank中的基因序列人工合成toxR基因片度作為目的DNA片段，以E. coliDH5a作為感受態(tài)細(xì)胞。將pUC19質(zhì)粒以Hind III酶切后，與目的DNA片段在T4連接酶的催化下連接，轉(zhuǎn)化E. coli DH5a感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)氨芐青霉素平板篩選出陽性克隆，以堿裂解法提取重組質(zhì)粒,經(jīng)酶切電泳和PCR電泳檢測(cè)質(zhì)粒構(gòu)建的正確性。陰性對(duì)照質(zhì)控品的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系，反應(yīng)體系25y L，包括陰性對(duì)照質(zhì)控品(以大腸桿菌(E. coli)基因組DNA作為陰性對(duì)照質(zhì)控品)2 u L，IXThermoPol緩沖液(反應(yīng)體系終濃度)，8mmol/L MgSO4 (反應(yīng)體系終濃度)，I. Ommol/L dNTPs (反應(yīng)體系終濃度)，0. 8mol/Lbetaine (反應(yīng)體系終濃度)，I. 2u mol/L前內(nèi)引物FIP (反應(yīng)體系終濃度)，
I.2 ii mol/L后內(nèi)引物BIP (反應(yīng)體系終濃度)，0. 2iimol/L前外引物F3 (反應(yīng)體系終濃度)，0. 2 u mol/L后外引物B3 (反應(yīng)體系終濃度)，IUBstDNA聚合酶，用滅菌去離子水補(bǔ)齊至25 u L0分別將上述三種環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系混合均勻后，放入恒溫水浴箱，設(shè)定反應(yīng)條件65°C,60min ;80°C，lOmin，終止反應(yīng);10°C保存。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)完成后取5 ii L上述三種擴(kuò)增反應(yīng)體系的擴(kuò)增產(chǎn)物，于2%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)，如圖I所示，電泳分析檢測(cè)結(jié)果顯示樣品的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系和陽性對(duì)照質(zhì)控品的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系的電泳條帶呈現(xiàn)特異性的梯狀條帶，而陰性對(duì)照質(zhì)控品的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系無特異性的條帶，說明樣品的DNA模板含有施羅氏弧菌的特異性toxR基因，則說明樣品中含有施羅氏弧菌(Vibrio shilonii)。分別取I ii L SYBR Green I熒光染料，與反應(yīng)完成后的上述三種擴(kuò)增體系混勻，觀察反應(yīng)體系是否顏色發(fā)生變化。如圖2所示，SYBR Green I熒光染色顯色法檢測(cè)結(jié)果顯示樣品的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系和陽性對(duì)照質(zhì)控品的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系變成綠色，而陰性對(duì)照質(zhì)控品的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系仍為橙色，說明樣品的DNA模板含有施羅氏弧菌的特異性toxR基因，則說明樣品中含有施羅氏弧菌(Vibrio shilonii)。綜上所述，利用本發(fā)明的檢測(cè)引物及檢測(cè)方法，可以簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、快捷、靈敏地檢測(cè) 出施羅氏弧菌，且檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠。
權(quán)利要求
1.一種施羅氏弧菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)引物，其特征在于，所述的檢測(cè)引物如下所示 前外引物 F3 :5、-CAAACGGITGGCGGTGTC-3、； 后外引物 B3 :5、-CCGCAAGATGCTGAAGGATC-3、；前內(nèi)引物 FIP 5, -CTGCAAGAGCCAAACTCTGCGTCTTTTGGAGCTGGTGGGAT-3,；后內(nèi)引物 BIP :5、-GCTTCTGATGAAGCGACAGGCAGTAAAGACGGTGCCTAAGCG-3、。
2.一種施羅氏弧菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒，包括環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液、BstDNA聚合酶、陽性對(duì)照質(zhì)控品、陰性對(duì)照質(zhì)控品和檢測(cè)引物，其特征在于，所述的檢測(cè)引物包括 前外引物 F3 :5、-CAAACGGITGGCGGTGTC-3、； 后外引物 B3 :5、-CCGCAAGATGCTGAAGGATC-3、；前內(nèi)引物 FIP 5, -CTGCAAGAGCCAAACTCTGCGTCTTTTGGAGCTGGTGGGAT-3,；后內(nèi)引物 BIP :5、-GCTTCTGATGAAGCGACAGGCAGTAAAGACGGTGCCTAAGCG-3、。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的施羅氏弧菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述的陽性對(duì)照質(zhì)控品為含有施羅氏弧菌的toxR基因的質(zhì)粒DNA。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的施羅氏弧菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述的陰性對(duì)照質(zhì)控品為不同于施羅氏弧菌的toxR基因的DNA序列。
5.一種非診斷目的的施羅氏弧菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)對(duì)樣品進(jìn)行增菌培養(yǎng)，提取增菌液中菌體的基因組DNA作為模板； (2)使用權(quán)利要求I所述的施羅氏弧菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)引物，與環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液、Bst DNA聚合酶和樣品菌體的基因組DNA混合形成擴(kuò)增反應(yīng)體系，進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，以陽性對(duì)照質(zhì)控品和陰性對(duì)照質(zhì)控品分別作為陽性對(duì)照和陰性對(duì)照； (3)擴(kuò)增反應(yīng)完成后，通過與陽性對(duì)照和陰性對(duì)照進(jìn)行對(duì)比，判斷樣品擴(kuò)增反應(yīng)體系中是否擴(kuò)增得到擴(kuò)增產(chǎn)物，來判斷樣品中是否含有施羅氏弧菌。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的非診斷目的的施羅氏弧菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法，其特征在于，通過與陽性對(duì)照和陰性對(duì)照進(jìn)行對(duì)比，判斷樣品擴(kuò)增反應(yīng)體系中是否擴(kuò)增得到擴(kuò)增產(chǎn)物，來判斷樣品中是否含有施羅氏弧菌具體為通過電泳分析或SYBR Green I熒光染色顯色法同時(shí)檢測(cè)陽性對(duì)照、陰性對(duì)照和樣品擴(kuò)增反應(yīng)體系的擴(kuò)增產(chǎn)物，根據(jù)是否有梯狀電泳條帶或反應(yīng)體系的顏色來判斷樣品中是否有施羅氏弧菌。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的非診斷目的的施羅氏弧菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟(2)的擴(kuò)增反應(yīng)體系為8mmol/L MgSO4、I. OmmoI/L dNTPs、0. 8mol/Lbetaine、I. 2 u mol/L 前內(nèi)引物 FIP、I. 2u mol/L 后內(nèi)引物 BIP、0. 2 u mol/L 前外引物 F3、0. 2iimol/L后外引物B3、4X104U/LBst DNA聚合酶、I X ThermoPol buffer、適量的模板DNA和水。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的非診斷目的的施羅氏弧菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟(2)的進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，其反應(yīng)參數(shù)為65°C溫育I小時(shí)，然后80°C滅活lOmin，最后10°C保存。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的非診斷目的的施羅氏弧菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法，其特征在于，所述的陽性對(duì)照質(zhì)控品為含有施羅氏弧菌的toxR基因的質(zhì)粒DNA。
10.根據(jù)權(quán)利要求5所述的非診斷目的的施羅氏弧菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法，其特征在于，所述的陰性對(duì)照質(zhì)控品為不同于施羅氏弧菌的toxR基因的DNA序列。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種施羅氏弧菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)引物、檢測(cè)試劑盒和檢測(cè)方法。檢測(cè)引物為前外引物F35'-CAAACGGTTGGCGGTGTC-3'；后外引物B35'-CCGCAAGATGCTGAAGGATC-3'；前內(nèi)引物FIP5'-CTGCAAGAGCCAAACTCTGCGTCTTTTGGAGCTGGTGGGAT-3'；后內(nèi)引物BIP5'-GCTTCTGATGAAGCGACAGGCAGTAAAGACGGTGCCTAAGCG-3'。使施羅氏弧菌檢測(cè)技術(shù)達(dá)到國(guó)際先進(jìn)水平，檢測(cè)能力大幅提高，施羅氏弧菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法的檢測(cè)限高于傳統(tǒng)檢測(cè)方法100~200倍；另一方面本發(fā)明的施羅氏弧菌的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法具有儀器設(shè)備要求簡(jiǎn)單、檢測(cè)時(shí)間短(0.5~1.0小時(shí))、特異性高(針對(duì)靶基因的8/6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)6/4種特異引物)等特點(diǎn)，彌補(bǔ)了經(jīng)典PCR擴(kuò)增技術(shù)對(duì)儀器設(shè)備要求高、技術(shù)較為復(fù)雜等諸多弊端，具有檢測(cè)能力強(qiáng)、檢測(cè)時(shí)間短、對(duì)儀器設(shè)備要求簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)，具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102719551SQ201210240479
公開日2012年10月10日 申請(qǐng)日期2012年7月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月11日
發(fā)明者任春華, 劉助紅, 胡超群, 陳償, 高磊 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院南海海洋研究所