專利名稱：一種大黃魚線粒體全基因組序列的擴增引物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及ー種大黃魚線粒體全基因組序列的擴增引物及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
大黃魚(Pseudosciaena crocea),又名黃魚、黃花魚，隸屬于S盧形目(Perciformes)、石首魚科(Sciaenidae)、黃魚屬(Pseudosciaena),是我國海洋捕撈主要經(jīng)濟魚類之一，是中國海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖產(chǎn)量最大的魚類品種。我國沿海大黃魚大致分為岱衢族、閩-粵東族、硇洲族三個地理種群。岱衢族大黃魚呈金黃或虎黃色，有光澤，鰓絲清晰呈鮮紅或紫紅色，眼球飽滿，肌肉結(jié)實，富有弾性，是黃魚族中的極品，其主要分布在浙北舟山岱衢洋漁場，由于過量捕撈，環(huán)境惡化，目前野生岱衢族大黃魚十分稀少。由于閩-粵東族 大黃魚和岱衢族大黃魚外部形態(tài)相似，很難進行區(qū)分，市場上ー些商戶甚至將閩-粵東族大黃魚和岱衢族大黃魚混淆銷售，欺詐消費者，因此將外形上相似的大黃魚進行物種鑒定顯得十分必要。目前，通過序列差異來鑒別外形上相似的魚類是ー種十分便利準確的方法，其中線粒體序列差異的研究是其中重要的ー種方法。線粒體是細胞內(nèi)的重要細胞器，屬于母性遺傳并具有自身的ー套基因組，是半自主性細胞器，且由于其結(jié)構(gòu)簡單、幾乎不發(fā)生重組、進化速度快、不同區(qū)域進化速度存在差異等特點，使其在種類鑒別、系統(tǒng)進化和種群遺傳學(xué)的研究方面應(yīng)用十分廣泛。不同生物線粒體基因組在結(jié)構(gòu)、基因數(shù)和基因排列方式等方面均顯示出極大的多樣性，因此線粒體基因組的全序列研究成為動物分子系統(tǒng)發(fā)生最有力的證據(jù)。中國專利名稱為哲羅鮭線粒體全基因組序列及其擴增引物(申請?zhí)朇N200910073114. 8)，黑龍江省野豬線粒體基因組全序列克隆及進化分析(申請?zhí)朇N200810172959.8)等分別對線粒體全基因組進行了測序，而不同地理種群的大黃魚(如閩-粵東族大黃魚和岱衢族大黃魚)的線粒體全基因組序列到目前為止仍未測定。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供ー種大黃魚線粒體全基因組序列的擴增引物及其應(yīng)用，利用該擴增引物可獲得不同種類的大黃魚的線粒體全基因組序列及大黃魚高變異區(qū)域擴增引物，為大黃魚的保護遺傳學(xué)、進化遺傳學(xué)及其物種的分子鑒定提供物質(zhì)基礎(chǔ)。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為ー種大黃魚線粒體全基因組序列的擴增引物，大黃魚線粒體全基因組序列的擴增引物為15對，基因序列分別如下所示(I)大黃魚線粒體全基因組序列擴增引物第I對的上游引物為5' -AGTCAACGGCGTAAAGAGTGG-3'，下游引物為5' -TACCCTTCTGGGAAAGTTGT-3'；(2)大黃魚線粒體全基因組序列擴增引物第2對的上游引物為5' -CCTGGGAAATGAATAGAAGT-3'，下游引物為5' -AAAATCATGGCATAGATAGA-3'；(3)大黃魚線粒體全基因組序列擴增引物第3對的上游引物為5' -TTACGACCTCGATGTTGGATCAG-3'，下游引物為5' -GGAAGCACTAGGAGTTTTGAGT-3'(4)大黃魚線粒體全基因組序列擴增引物第4對的上游引物為5' -AAGGGCCACTTTGATAGAGTG-3'，下游引物為5' -GTGAGTGCGGGGGTTTTGGCTCA-3'；(5)大黃魚線粒體全基因組序列擴增引物第5對的上游引物為5' -TTGCCTACTCCTCAATTGCCCAC-3'，下游引物為5' -CTTATGTTATTCATTCGGGGGAA-3'；(6)大黃魚線粒體全基因組序列擴增引物第6對的上游引物為5' -CCTCTACCTAATTTTTGGTGC-3'，下游引物為5' -ATGCGGTTGGCTTGAAATCAA-3'；(7)大黃魚線粒體全基因組序列擴增引物第7對的上游引物為
5' -AGCACTTGAACAAAAGCTCACTT-3 '，下游引物為5 ' -GTCGAAGAGGCTTACAGTCATGGTCA-3
I(8)大黃魚線粒體全基因組序列擴增引物第8對的上游引物為5' -GCAAGCGTTAGCCTTTTAAGC-3'，下游引物為5' -CAGGGGCTGGGGTCTACTAT-3'；(9)大黃魚線粒體全基因組序列擴增引物第9對的上游引物為5' -CCTACACTTCTTATCCCTAITCTAAT-3'，下游引物為5' -GGAGAAAGGGAGGCGAGCGGT-3'；(10)大黃魚線粒體全基因組序列擴增引物第10對的上游引物為5' -AGTATTAGTGACTTCCAATCA-3'，下游引物為5' -TGTAGAATAGAAAATAAGTGCC-3'；(11)大黃魚線粒體全基因組序列擴增引物第11對的上游引物為5' -CCTCTTAACATCCCTGCAAATC-3'，下游引物為5' -TTCCTAAGACCAACGGATGAGC-3'；(12)大黃魚線粒體全基因組序列擴增引物第12對的上游引物為5' -AAAACATTAGATTGTGATTCTAA-3'，下游引物為5' -GACTCGGAGGCTGTAAATAG-3'；(13)大黃魚線粒體全基因組序列擴增引物第13對的上游引物為5' -GCCTGGCCCTCACTGGTACC-3'，下游引物為5' -AGCGGGTGGGTTTTGCGTAG-3'；(14)大黃魚線粒體全基因組序列擴增引物第14對的上游引物為5' -CTCTAACCAGGACTAATGGCTTG-3'，下游引物為5' -TGATTATCAATCAATGTCCC-3'；(15)大黃魚線粒體全基因組序列擴增引物第15對的上游引物為5' -TCAACATTAATTACCACGCT-3'，下游引物為5' -GGGGTATCTAATCCCAGTTT-3'。ー種大黃魚線粒體全基因組序列的擴增引物的應(yīng)用，利用所述的擴增引物獲得的岱衢族大黃魚線粒體全基因組序列如SEQ ID NO:31所示。ー種大黃魚線粒體全基因組序列的擴增引物的應(yīng)用，利用所述的擴增引物獲得的閩-粵東族大黃魚線粒體全基因組序列如SEQ ID NO: 32所示。ー種大黃魚線粒體全基因組序列的擴增引物的應(yīng)用，利用所述的擴增引物獲得的大黃魚高變異區(qū)域擴增引物，基因序列如下BI 上游引物 5' -AGACCTTCTAGGCTTTGCAATC-3'，BI 下游引物 5' -GGAGCTTTCTAGGGCTCATCT-3'；B2 上游引物5' -TTATTTTCTATTCTACACCCTGGC-3'，B2 下游引物 5' -AGAGGGAATACCCCGCTGT-3'。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于本發(fā)明首次公開了大黃魚線粒體全基因組序列的15對擴增引物，15對擴增引物對大黃魚樣本進行PCR擴增，分別獲得片段大小在900-1560bp之間的特異性擴增產(chǎn)物，無需高質(zhì)量的DNA模板和長鏈PCR技術(shù)，克隆的成功率高，而且每對引物擴增所獲得的產(chǎn)物不需步移法直接測序即可測通；相鄰區(qū)域擴增產(chǎn)物的序列有SObp以上的重疊部分，方便測序結(jié)果的拼接，可以快速、高效的分別獲取岱衢族大黃魚和閩-粵東族大黃魚線粒體全基因組序列，并將不同大黃魚進行同源序列比對，對大黃魚高變異區(qū)域序列進行分析獲得大黃魚高變異區(qū)擴增引物，為大黃魚的種類鑒定、地理種群鑒別、種質(zhì)資源和遺傳多祥性的研究提供支持，為進ー步開發(fā)岱衢族大黃魚和閩-粵東族大黃魚的鑒別技術(shù)提供基礎(chǔ)。


圖I為岱衢族大黃魚PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果示意圖；圖2為閩-粵東族大黃魚PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果示意圖。
具體實施例方式以下結(jié)合附圖實施例對本發(fā)明作進ー步詳細描述。具體實施例一本發(fā)明大黃魚線粒體全基因組序列的擴增引物為15對，基因序列如下所示本發(fā)明所設(shè)計的引物的擴增產(chǎn)物應(yīng)覆蓋整個線粒體全基因組，每對引物的擴增產(chǎn)物長度在900-1560bp，且相鄰兩對引物獲得的序列重疊為80bp以上。
權(quán)利要求
1.ー種大黃魚線粒體全基因組序列的擴增引物，其特征在于大黃魚線粒體全基因組序列的擴增引物為15對，基因序列分別如下所示 (1)大黃魚線粒體全基因組序列擴增引物第I對的上游引物為5' -AGTCAACGGCGTAAAGAGTGG-3'，下游引物為5' -TACCCTTCTGGGAAAGTTGT-3'； (2)大黃魚線粒體全基因組序列擴增引物第2對的上游引物為5' -CCTGGGAAATGAATAGAAGT-3'，下游引物為5' -AAAATCATGGCATAGATAGA-3'； (3)大黃魚線粒體全基因組序列擴增引物第3對的上游引物為5' -TTACGACCTCGATGTTGGATCAG-3'，下游引物為5' -GGAAGCACTAGGAGTTTTGAGT-3' (4)大黃魚線粒體全基因組序列擴增引物第4對的上游引物為5' -AAGGGCCACTTTGATAGAGTG-3'，下游引物為5' -GTGAGTGCGGGGGTTTTGGCTCA-3'； (5)大黃魚線粒體全基因組序列擴增引物第5對的上游引物為5' -TTGCCTACTCCTCAATTGCCCAC-3'，下游引物為5' -CTTATGTTATTCATTCGGGGGAA-3'； (6)大黃魚線粒體全基因組序列擴增引物第6對的上游引物為5' -CCTCTACCTAATTTTTGGTGC-3'，下游引物為5' -ATGCGGTTGGCTTGAAATCAA-3'； (7)大黃魚線粒體全基因組序列擴增引物第7對的上游引物為5' -AGCACTTGAACAAAAGCTCACTT-3'，下游引物為5' GTCGAAGAGGCTTACAGTCATGGTCA-3' (8)大黃魚線粒體全基因組序列擴增引物第8對的上游引物為5' -GCAAGCGTTAGCCTTTTAAGC-3'，下游引物為5' -CAGGGGCTGGGGTCTACTAT-3'； (9)大黃魚線粒體全基因組序列擴增引物第9對的上游引物為5'-CCTACACTTCTTATCCCTATTCTAAT-3'，下游引物為5' GGAGAAAGGGAGGCGAGCGGT-3'； (10)大黃魚線粒體全基因組序列擴增引物第10對的上游引物為5' -AGTATTAGTGACTTCCAATCA-3'，下游引物為5' -TGTAGAATAGAAAATAAGTGCC-3'； (11)大黃魚線粒體全基因組序列擴增引物第11對的上游引物為5' -CCTCTTAACATCCCTGCAAATC-3'，下游引物為5' -TTCCTAAGACCAACGGATGAGC-3'； (12)大黃魚線粒體全基因組序列擴增引物第12對的上游引物為5' -AAAACATTAGATTGTGATTCTAA-3'，下游引物為5' -GACTCGGAGGCTGTAAATAG-3'； (13)大黃魚線粒體全基因組序列擴增引物第13對的上游引物為5' -GCCTGGCCCTCACTGGTACC-3'，下游引物為5' -AGCGGGTGGGTTTTGCGTAG-3'； (14)大黃魚線粒體全基因組序列擴增引物第14對的上游引物為5' -CTCTAACCAGGACTAATGGCTTG-3'，下游引物為5' -TGATTATCAATCAATGTCCC-3'； (15)大黃魚線粒體全基因組序列擴增引物第15對的上游引物為5' -TCAACATTAATTACCACGCT-3'，下游引物為5' -GGGGTATCTAATCCCAGTTT-3'。
2.—種權(quán)利要求I所述的大黃魚線粒體全基因組序列的擴增引物的應(yīng)用，其特征在干利用所述的擴增引物獲得的岱衢族大黃魚線粒體全基因組序列如SEQ ID NO:31所示。
3.—種權(quán)利要求I所述的大黃魚線粒體全基因組序列的擴增引物的應(yīng)用，其特征在干利用所述的擴增引物獲得的閩-粵東族大黃魚線粒體全基因組序列如SEQ ID NO:32所/Jn o
4.一種權(quán)利要求I所述的大黃魚線粒體全基因組序列的擴增引物的應(yīng)用，其特征在于利用所述的擴增引物獲得的大黃魚高變異區(qū)域擴增引物，基因序列如下 BI 上游引物 5' -AGACCTTCTAGGCTTTGCAATC-3'， BI 下游引物 5' -GGAGCTTTCTAGGGCTCATCT-3'；B2 上游引物 5' -TTATTTTCTATTCTACACCCTGGC-3'， B2 下游引物 5' -AGAGGGAATACCCCGCTGT-3'。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種大黃魚線粒體全基因組序列的擴增引物及其應(yīng)用，特點是其擴增引物為15對，基因序列分別如SEQ ID NO:1-30所示，還利用該擴增引物獲得岱衢族大黃魚線粒體全基因組序列和閩-粵東族大黃魚線粒體全基因組序列分別如SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32所示，并獲得了大黃魚高變異區(qū)域擴增引物，優(yōu)點是通過上述15對擴增引物可以快速、高效的分別獲取岱衢族大黃魚和閩-粵東族大黃魚線粒體全基因組序列，及大黃魚高變異區(qū)域擴增引物，為大黃魚的種類鑒定、地理種群鑒別、種質(zhì)資源和遺傳多樣性的研究提供支持，為進一步開發(fā)岱衢族大黃魚和閩-粵東族大黃魚的鑒別技術(shù)提供基礎(chǔ)。
文檔編號C12Q1/68GK102776183SQ20121024149
公開日2012年11月14日 申請日期2012年7月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月12日
發(fā)明者嚴小軍, 沈錫權(quán), 王夢林, 閆旭紅 申請人:寧波大學(xué)