專利名稱：用于檢測轉(zhuǎn)基因玉米Bt176轉(zhuǎn)化體特異性序列的引物組、試劑盒及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物檢測領(lǐng)域，具體涉及一種用于檢測轉(zhuǎn)基因玉米Btl76轉(zhuǎn)化體特異性序列的引物組、試劑盒及方法。
背景技術(shù)：
隨著轉(zhuǎn)基因生物的迅速發(fā)展，其安全性在全球范圍內(nèi)引起激烈的爭論與普遍關(guān)注。為保障消費者的知情權(quán)和選擇權(quán)，世界上許多國家和地區(qū)都制定了相應的法律和法規(guī)，加強對進出口轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的管理，這給為轉(zhuǎn)基因生物安全監(jiān)管提供技術(shù)支撐的轉(zhuǎn)基因檢測 工作帶來更大的挑戰(zhàn)。檢測轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的方法有很多，主要分為針對外源蛋白質(zhì)的檢測與針對外源核酸的檢測兩大類。但轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品，經(jīng)過多道程序加工處理，絕大部分蛋白質(zhì)已經(jīng)被變性、破壞，檢出率較低。所以針對外源核酸的檢測更為普遍。轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中轉(zhuǎn)入的外源核酸一般包括啟動子、標記基因、目的基因和終止子，針對這些基因進行擴增分析可篩選檢測待檢樣品中的轉(zhuǎn)基因成分。根據(jù)檢測靶標的不同，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測方法分為篩查法、基因特異性檢測法、結(jié)構(gòu)特異性檢測法、轉(zhuǎn)化事件特異性檢測法4個層次，檢測的特異性由低到高。轉(zhuǎn)化事件特異性檢測法是針對插入的外源序列與植物基因組連接的邊界序列(即轉(zhuǎn)化體特異性序列)進行檢測。由于插入位點的唯一性，轉(zhuǎn)化事件特異性檢測具有更高的特異性和準確性，不僅可判斷待檢樣品中是否含有轉(zhuǎn)基因成分，而且還可具體鑒定待檢樣品含有何種轉(zhuǎn)基因品系，因此相比其它3種方法具有更好的特異性。轉(zhuǎn)基因玉米Btl76具有抗鱗翅目尤其是玉米螟等害蟲及耐草胺磷除草劑的抗性，自1995年在美國準許無限制種植以來，Btl76玉米已經(jīng)在許多國家和地區(qū)大面積種植并作為食品和飼料廣泛應用。目前國內(nèi)外已建立了多種檢測轉(zhuǎn)基因玉米Btl76的普通PCR法、熒光定量PCR法，這些方法都需要特特殊的試劑(如熒光探針)和復雜昂貴的儀器(如PCR儀、real-time PCR儀)，不適于現(xiàn)場的快速檢測和基層的普及使用。環(huán)介導等溫擴增技術(shù)(Loop-mediatedisothermal amplification,LAMP)是由日本榮研化學株式會社Notomi T等于2000年開發(fā)的一種新穎的恒溫核酸擴增方法。該技術(shù)利用一種具有鏈置換活性的Bst DNA聚合酶在恒溫條件(65°C左右)保溫30-60分鐘，即可實現(xiàn)核酸的大量擴增。其特點是操作簡單、快速、特異性高、成本低廉，故被廣大研究者認為是可能替代PCR的新的核酸擴增技術(shù)。因此針對轉(zhuǎn)基因玉米Btl76建立一種高特異性、適于大范圍推廣應用的轉(zhuǎn)化事件特異性檢測方法具有非常重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的在于提供一種轉(zhuǎn)基因玉米Btl76及其加工品的檢測引物組。
本發(fā)明的另一個目的在于提供一種轉(zhuǎn)基因玉米Btl76及其加工品的檢測試劑盒。本發(fā)明的另一個目的在于提供一種轉(zhuǎn)基因玉米Btl76及其加工品的檢測方法。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是
轉(zhuǎn)基因玉米Bt 176及其加工品的檢測引物組，包括引物組I和引物組2，其中，引物組I包括外引物 zSSIIb-F3、zSSIIb-B3 和內(nèi)引物 zSSIIb-FIP、zSSIIb-BIP，序列如下zSSIIb- F3 TGACCGTTAGCAATGGCTAC (SEQ ID N0:1)；zSSIIb- B3 AGCGTCTCGAACGTGTAGT (SEQ ID N0:2)；
zSSIIb-FIP ATGCCCTGCAGCTTCCAGTCGGGGAGCTGAAGACTTCGGAA (SEQ ID NO:3); zSSIIb-BIP CGTGAACGGCATCGACATGAGCTGGTGTAGTCGTCGGAGTG (SEQ ID N0:4)；
弓丨物組2包括外引物Btl76-F3、Btl76-B3和內(nèi)引物Btl76_FIP、Btl76_BIP，序列如下 Btl76-F3 CGGCTTCAAGCACGGGA (SEQ ID NO:5)；
Btl76-B3 GAGGGAGAGAGAGGGAGC (SEQ ID N0:6)；
Btl76-FIP AGGACCGGACGGGGCAGTACACTGGCATGACGTGGGTT (SEQ ID NO:7);
Btl76- BIP TCTCCTCCATTGATGCACGCCGGGGGAAGGGAGAAACGG (SEQ ID N0:8)。轉(zhuǎn)基因玉米Btl76及其加工品的檢測試劑盒，包括(I)上述的引物組I ;(2)引物組2 ; (3) Bst DNA聚合酶；(4) LAMP反應液；(5)染色劑；(6)內(nèi)對照；(7)陽性對照。弓丨物組I中外引物和內(nèi)引物的添加摩爾比為1:8;所述引物組2中外引物和內(nèi)引物的添加摩爾比為1:8。LAMP 反應液，由 O. 2 mol/L Mg2SO4,25 mmol/L dNTPUOXBst buffer,5 mol/L甜菜堿按I :4 :10 20的比例配比而成。染色劑為SYBR Green。內(nèi)對照為含有玉米內(nèi)參照基因zSSIIb (SEQ ID N0:9)的重組質(zhì)粒；陽性對照為含有轉(zhuǎn)基因玉米Btl76轉(zhuǎn)化體特異性序列(SEQ ID NO: 10)的重組質(zhì)粒。內(nèi)對照和陽性對照的重組質(zhì)粒的載體為PMD18-T載體。利用上述試劑盒檢測轉(zhuǎn)基因玉米Btl76及其加工品的方法，包括如下步驟
(1)提取純化待檢樣品DNA；
(2)LAMP法檢測；
Φ LAMP法檢測玉米內(nèi)參照基因zSSIIb :設(shè)置樣品管(加樣品DNA)、內(nèi)對照(加含有
zSSIIb基因的重組質(zhì)粒DNA)、空白對照(加滅菌去離子水)，25 μ L反應體系含有引物組I外引物對O. 2 μ mol/L，內(nèi)引物對I. 6 μ mol/L，Bst DNA聚合酶0. 32U/μ L，LAMP反應液9 μ L，待檢樣品DNA50ng，用滅菌去離子水補齊到25 μ I。將配制好的反應管混勻后離心，并于65°C反應50min，并在80°C持續(xù)IOmin ;反應完畢后，往反應管中加入染色劑，混勻，根據(jù)顯色結(jié)果來判斷待檢樣品中是否含有zSSIIb基因；
LAMP法檢測轉(zhuǎn)基因玉米Bt176轉(zhuǎn)化體特異性序列設(shè)置樣品管(樣品DNA)、陽性對
照(含有轉(zhuǎn)基因玉米Btl76轉(zhuǎn)化體特異性序列的重組質(zhì)粒DNA)、空白對照(滅菌去離子水)，25 μ L反應體系含有引物組2外引物對0.2 μ mol/L，內(nèi)引物對I. 6 μ mol/L ,Bst DNA聚合酶0. 32U/ μ L，反應液9 μ L，待檢樣品DNA50ng，用滅菌去離子水補齊到25 μ I。將配制好的反應管混勻后離心，并于65°C反應50min，并在80°C持續(xù)IOmin ;反應結(jié)束后，往反應管中加入染色劑，混勻，根據(jù)顯色結(jié)果來判斷待檢樣品中是否含有轉(zhuǎn)基因玉米Btl76轉(zhuǎn)化體特異性序列；
(3)結(jié)果判斷如果步驟(2)中內(nèi)對照、陽性對照呈陽性，空白對照呈陰性，而樣品zSSIIb基因檢測呈陽性、轉(zhuǎn)基因玉米Bt 176轉(zhuǎn)化體特異性序列檢測呈陽性，則表明待檢樣品含有轉(zhuǎn)基因玉米Btl76成分。本發(fā)明的有益效果在于
I、本發(fā)明設(shè)計了 2對LAMP引物組，引物組I檢測內(nèi)參照基因zSSIIb，可檢出樣品中的玉米成分，同時可排除假陰性結(jié)果；引物組2檢測Btl76的轉(zhuǎn)化體特異性序列，該序列為插入的外源基因與植物基因組連接的邊界序列，具有高度特異性，可有效檢出Btl76轉(zhuǎn)基因 玉米成分。2、本發(fā)明所述的試劑盒自行研制了陽性對照物和內(nèi)對照物，用于樣品檢測分析時分別設(shè)置了陽性對照、空白對照和內(nèi)對照，可避免假陽性和假陰性的產(chǎn)生。3、本發(fā)明的檢測試劑盒是在恒溫下進行擴增檢測，一臺恒溫水浴鍋就能滿足實驗要求，不需要特殊的設(shè)備，檢測成本低；檢測結(jié)果通過反應液的顏色變化通過肉眼觀察即可進行判定，鑒定簡便，結(jié)果可視化；適用于現(xiàn)場快速檢測及基層大樣本量的篩查，易于大范圍的推廣應用。


圖I是本發(fā)明檢測方法的顯色結(jié)果示意圖(1，綠色，陽性；2，橙色，陰性)；
圖2是轉(zhuǎn)化體特異性序列的敏感性分析結(jié)果(I 2copies/ μ 1,2 20copies/ μ I,3 200copies/μ 1,4 2000copies/μ 1,5 20000copies/μ 1,6 200000copies/μ 1,7 2000000copies/μ I)。圖3是特異性分析結(jié)果(Α引物組I檢測結(jié)果1.轉(zhuǎn)基因玉米Btl76，2.非轉(zhuǎn)基因玉米，3.轉(zhuǎn)基因水稻TT51-1，4.轉(zhuǎn)基因油菜RT73，5.轉(zhuǎn)基因甜菜H7_l，6.轉(zhuǎn)基因玉米M0N810，7.抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆，8.內(nèi)對照，9.空白對照；B引物組2檢測結(jié)果1.轉(zhuǎn)基因玉米Btl76，2.非轉(zhuǎn)基因玉米，3.轉(zhuǎn)基因水稻TT51-1，4.轉(zhuǎn)基因油菜RT73，5.轉(zhuǎn)基因甜菜H7-l,6.轉(zhuǎn)基因玉米M0N810，7.抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆，8.陽性對照，9.空白對照)。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件操作，例如Sambrook等編著的分子克隆實驗室手冊(New York Cold Spring HarborLaboratory Press, 2001)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。實施例I :轉(zhuǎn)基因玉米Btl76檢測試劑盒的研制
本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因玉米Btl76檢測試劑盒由(I) Bst DNA聚合酶；(2)引物組I ;(3)引物組2 ;(4)反應液；(5)染色劑(SYBR Green) ； (6)內(nèi)對照；(7)陽性對照組成，其中BstDNA聚合酶、反應液、顯色液等可由相應公司購買，而檢測引物組、內(nèi)對照和陽性對照物為自行研制。
一、實驗材料
轉(zhuǎn)基因玉米Btl76 二、試劑
Bst DNA聚合酶、IOXifei buffer購自美國New England Biolabs公司；甜菜喊購自美國Sigma公司；dNTP、MgS04分析純、Premix Taq DNA聚合酶、pMD18_T載體、DNA分子量Marker、轉(zhuǎn)基因基因組DNA提取試劑盒(GMO DetectionVer. 2. O)購自寶生物工程(大連)有限公司；質(zhì)粒小提試劑盒購自O(shè)MEGA公司；DH5a菌株為本實驗室保存；引物由上海英濰捷基生物工程技術(shù)服務有限公司合成。三、主要儀器設(shè)備
ClOOO 型 PCR 儀(Bio-Rad Laboratories,Inc.)
Gel 型凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad Laboratories, Inc.)
Biophotometer plus 紫外分光光度計(Eppendorf, Inc.)
其他儀器包括恒溫水浴鍋，離心機，恒溫培養(yǎng)箱，電子天平，微量移液器等。四、實驗方法和過程
I、引物組的設(shè)計
通過GenBank查詢和檢索相關(guān)國內(nèi)外文獻資料獲得轉(zhuǎn)基因玉米Btl76的內(nèi)參照基因zSS II b (GenBank AF019297)和轉(zhuǎn)化體特異性序列(GenBank AJ878607. I)。根據(jù)獲得的序列信息，利用在線 http://primerexplorer. jp/e/PrimerExploerV4 軟件分別設(shè)計了 2 組引物，分別用于擴增zSSII b基因和轉(zhuǎn)基因玉米Btl76轉(zhuǎn)化體特異性序列。zSSll b基因擴
增引物包括外引物zSS II b-F3、zSSn b-B3和內(nèi)引物zSS II b_FIP、zSS II b-BIP ;轉(zhuǎn)化體
特異性序列擴增引物由外引物Btl76-F3、Btl76-B3和內(nèi)引物Btl76_FIP、Btl76_BIP組成。引物序列見表I.
權(quán)利要求
1.轉(zhuǎn)基因玉米Bt176及其加工品的檢測引物組，包括引物組I和引物組2，其中，引物組 I 包括外引物 zSSIIb-F3、zSSIIb-B3 和內(nèi)引物 zSSIIb-FIP、zSSIIb-BIP，序列如下zSSIIb- F3 TGACCGTTAGCAATGGCTAC (SEQ ID NO:I)；zSSIIb- B3 AGCGTCTCGAACGTGTAGT (SEQ ID N0:2)；zSSIIb-FIP ATGCCCTGCAGCTTCCAGTCGGGGAGCTGAAGACTTCGGAA (SEQ ID NO:3);zSSIIb-BIP CGTGAACGGCATCGACATGAGCTGGTGTAGTCGTCGGAGTG (SEQ ID NO:4); 引物組2包括外引物Btl76-F3、Btl76-B3和內(nèi)引物Btl76_FIP、Btl76_BIP，序列如下Btl76-F3 CGGCTTCAAGCACGGGA (SEQ ID NO:5)；Btl76-B3 GAGGGAGAGAGAGGGAGC (SEQ ID N0:6)；Btl76-FIP AGGACCGGACGGGGCAGTACACTGGCATGACGTGGGTT (SEQ ID NO:7);Btl76- BIP TCTCCTCCATTGATGCACGCCGGGGGAAGGGAGAAACGG (SEQ ID N0:8)。
2.轉(zhuǎn)基因玉米Btl76及其加工品的檢測試劑盒，包括(1)權(quán)利要求I所述的引物組I ; (2)權(quán)利要求I所述的引物組2 ；(3)Bst DNA聚合酶；(4)LAMP反應液；(5)染色劑；(6)內(nèi)對照；(7)陽性對照。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測試劑盒，其特征在于，引物組I中外引物和內(nèi)引物的添加摩爾比為1:8 ;所述引物組2中外引物和內(nèi)引物的添加摩爾比為1:8。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述的LAMP反應液，由O.2 mol/L Mg2SO4,25 mmol/L dNTPUOXBst buffer,5 mol/L 甜菜堿按 I 4 10 20 的比例配比而成。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述染色劑為SYBRGreen0
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述的內(nèi)對照為含有玉米內(nèi)參照基因zSSIIb (SEQ ID N0:9)的重組質(zhì)粒；所述陽性對照為含有轉(zhuǎn)基因玉米Btl76轉(zhuǎn)化體特異性序列(SEQ ID NO: 10)的重組質(zhì)粒。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測試劑盒，其特征在于，內(nèi)對照和陽性對照的重組質(zhì)粒的載體為pMD18-T載體。
8.利用權(quán)利要求2的試劑盒檢測轉(zhuǎn)基因玉米Btl76及其加工品的方法，包括如下步驟 (1)提取純化待檢樣品DNA； (2)LAMP法檢測； 3 LAMP法檢測zSSIIb基因設(shè)置樣品管(加樣品DNA)、內(nèi)對照(加含有zSSIIb基因的重組質(zhì)粒DNA)、空白對照(加滅菌去離子水)，25 μ L反應體系含有引物組I外引物對O.2 μ mol/L，內(nèi)引物對 I. 6 μ mol/L ,Bst DNA 聚合酶 O. 32U/μ L，LAMP 反應液 9 μ L，待檢樣品DNA50ng，用滅菌去離子水補齊到25 μ I ;將配制好的反應管混勻后離心，并于65°C反應50min，并在80°C持續(xù)IOmin ;反應完畢后，往反應管中加入染色劑，混勻，根據(jù)顯色結(jié)果來判斷待檢樣品中是否含有zSSIIb基因； S LAMP法檢測轉(zhuǎn)基因玉米Btl76轉(zhuǎn)化體特異性序列設(shè)置樣品管(樣品DNA)、陽性對照(含有轉(zhuǎn)基因玉米Btl76轉(zhuǎn)化體特異性序列的重組質(zhì)粒DNA)、空白對照(滅菌去離子水)，25yL反應體系含有引物組2外引物對0.2ymol/L，內(nèi)引物對L6ymol/L ,Bst DNA聚合酶O. 32U/yL，反應液9yL，待檢樣品DNA50ng，用滅菌去離子水補齊到25 μ I ;將配制好的反應管混勻后離心，并于65°C反應50min，并在80°C持續(xù)IOmin ;反應結(jié)束后，往反應管中加入染色劑，混勻，根據(jù)顯色結(jié)果來判斷待檢樣品中是否含有轉(zhuǎn)基因玉米Btl76轉(zhuǎn)化體特異性序列； (3)結(jié)果判斷如果步驟(2)中內(nèi)對照、陽性對照呈陽性，空白對照呈陰性，而樣品zSSIIb基因檢測呈陽性、轉(zhuǎn)基因玉米Bt176轉(zhuǎn)化體特異性序列檢測呈陽性，則表明待檢樣品含有轉(zhuǎn)基因玉米Btl76成分。
全文摘要
本發(fā)明公開了用于檢測轉(zhuǎn)基因玉米Bt176轉(zhuǎn)化體特異性序列的引物組、試劑盒及方法。本發(fā)明設(shè)計了2對LAMP引物組，引物組1檢測內(nèi)參照基因zSSIIb，可檢出樣品中的玉米成分，同時可排除假陰性結(jié)果；引物組2檢測Bt176的轉(zhuǎn)化體特異性序列，該序列為插入的外源基因與植物基因組連接的邊界序列，具有高度特異性，可有效檢出Bt176轉(zhuǎn)基因玉米成分。本試劑盒用于樣品檢測分析時分別設(shè)置了陽性對照、空白對照和內(nèi)對照，可避免假陽性和假陰性的產(chǎn)生。檢測不需要特殊的設(shè)備，檢測成本低；檢測結(jié)果通過反應液的顏色變化用肉眼觀察即可進行判定，鑒定簡便，結(jié)果可視化，適用于現(xiàn)場快速檢測及基層大樣本量的篩查，易于大范圍的推廣應用。
文檔編號C12N15/11GK102766624SQ20121024240
公開日2012年11月7日 申請日期2012年7月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月12日
發(fā)明者佘之韻, 劉唐書, 周琳華, 張寶, 朱文亮, 梁宇斌, 肖維威 申請人:廣東產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院