專利名稱：：外切特異性的淀粉酶多肽、編碼那些多肽的核酸及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及淀粉酶多肽和編碼所述多肽的核酸及其應(yīng)用。本發(fā)明的淀粉酶被設(shè)計(jì)為，具有更多的有益性質(zhì)。具體來說，本發(fā)明的淀粉酶顯示了改變的外切特異性(exospecifity)。
背景技術(shù)：
：改進(jìn)的淀粉酶可以改善在某些過程如烘焙中的內(nèi)在問題。在烘焙后數(shù)天，在淀粉顆粒中發(fā)生支鏈淀粉的結(jié)晶，這導(dǎo)致面包的堅(jiān)硬性增加，并引起面包變得不新鮮(staling)。當(dāng)面包不新鮮時(shí),面包喪失了面包屑(crumb)的軟度和面包屑的濕度。結(jié)果是，面包屑變得彈性降低，面包變?yōu)閳?jiān)韌的干面包片。支鏈淀粉側(cè)鏈的酶促水解(例如，通過淀粉酶)可以減少結(jié)晶并增強(qiáng)保鮮能力。結(jié)晶取決于支鏈淀粉側(cè)鏈的長(zhǎng)度側(cè)鏈越長(zhǎng)，結(jié)晶越多。大多數(shù)淀粉顆粒是由兩種聚合物的混合物組成的支鏈淀粉和直鏈淀粉，其中大約75%是支鏈淀粉。支鏈淀粉是非常大的分支的分子，由通過(1-4)鍵連接的a-D-吡喃葡萄糖基單位構(gòu)成的鏈組成，其中鏈通過a-(1-6)鍵進(jìn)行連接，從而形成分支。直鏈淀粉是(1-4)鍵接的a-D-吡喃葡萄糖基單位構(gòu)成的線性鏈，幾乎不帶有a-(1-6)分支。烘焙含淀粉面包產(chǎn)品如白面包、由篩選的黑麥粉和小麥粉制成的面包以及面包卷，是通過烘焙面團(tuán)完成的，爐溫為180至250°C，持續(xù)大約15至60分鐘。在烘焙過程中，急驟的溫度梯度(200—120°C)遍及面團(tuán)外層，此時(shí)，烘焙產(chǎn)品的硬皮生成。然而，由于蒸氣，在烘焙過程的末期，面包屑的溫度僅為大約100°C。在高于大約85°C的溫度，可能發(fā)生酶的失活，酶將不具有保鮮特性。因此，只有熱穩(wěn)定的淀粉酶能夠在烘焙期間有效地修飾淀粉。由于支鏈糊精的積累會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生粘性的或膠粘的面包屑，內(nèi)切淀粉酶活性會(huì)對(duì)最終面包產(chǎn)品的質(zhì)量產(chǎn)生負(fù)面影響。外切淀粉酶活性是優(yōu)選的，因?yàn)槠渫瓿闪似谕牡矸坌揎?，所述修飾?dǎo)致老化(不新鮮化)的延遲，而與內(nèi)切淀粉酶活性相關(guān)的負(fù)面效應(yīng)則較少。內(nèi)切淀粉酶活性的降低可以導(dǎo)致更高的外切特異性，這可以減少支鏈糊精并產(chǎn)更高質(zhì)量的面包。本發(fā)明涉及具有改變的外切特異性的多肽。
發(fā)明內(nèi)容在第一方面，本發(fā)明提供了包括PS4變異體的多肽，PS4變異體衍生自親代多肽(parentpolypeptide)。親代酶可以優(yōu)選地是嗜糖假單胞菌(Pseudomonassaccharophila)的非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶(non-maltogenicexoamylase),如具有SEQIDNO:1或SEQIDNO:5中列出的氨基酸序列的外切淀粉酶。親代酶可以優(yōu)選地是施氏假單胞菌(Pseudomonasstutzeri)的非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶，如具有SEQIDNO:7或SEQIDNOll中列出的氨基酸序列的多肽。PS4家族的其它成員可以被用作親代酶。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，親代多肽是來自嗜糖假單胞菌的非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶，其具有SEQIDNO:1或SEQIDNO:5中列出的氨基酸序列。在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，親代多肽是來自施氏假單胞菌的非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶，其具有SEQIDNO:7或SEQIDN0:11中列出的氨基酸序列。在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，PS4變異體通過包含氨基酸取代而不同于親代多肽，取代所處的位置包括選自下列的至少一個(gè)位置4、9、13、33、34、42、70、71、87、99、100、108、113、121、131、134、135、141、153、157、158、160、161、166、170、171、178、179、184、188、198、199、221、223、238、270、277、290、307、315、334、335、342、343、372、392、398、399、405、415、425，其中對(duì)位置所進(jìn)行的編號(hào)是參照SEQIDNO:I列出的嗜糖假單胞菌序列。在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，PS4變異體通過包含氨基酸取代而不同于親代多肽，所述取代所處的位置包括選自下列的至少一個(gè)位置:4、33、34、70、71、87、99、108、113、121、131、134、141、157、158、171、178、179、188、198、199、223、290、307、315、334、343、399和405，其中位置編號(hào)是參照SEQIDNO:I列出的嗜糖假單胞菌序列。優(yōu)選地，所述位置是選自下列的至少一個(gè)位置:33、34、71、87、121、134、141、157、178、179、223、307、334和343。優(yōu)選地，PS4變異體包括至少一個(gè)取代，其選自:N33Y、D34N、K71R、G87S、G121D、G134R、A141P、L178F、A179T、G223A、H307L、S334P和D343E。在另一種實(shí)施方案中，所述外切淀粉酶還包括至少一個(gè)另外的取代，位置選自108、158、171和188。優(yōu)選地，PS4變異體包括選自下列的至少一個(gè)取代:K108R、G158D、Y171S和G188A。優(yōu)選地，PS4變異體包括選自下列的至少一個(gè)取代G4D、N33Y、D34N、G70D、K71R、G87S、A99V、K108R、V113I、G121D、G134R、A141P、I157L、G158D、Y171S、L178F、A179T、G188A、Y198F、Y198L、A199V、G223A、V290I、H307L、I315V、S334P、D343E、S399P、A405F和A405E。優(yōu)選地，PS4變異體包括下列取代N33Y、D34N、G134R、A141P、I157L、G223A、H307L和S334P，帶有至少一個(gè)另外的取代L178F或A179T。優(yōu)選地，PS4變異體包括下列取代中的至少一個(gè)N33Y、D34N、I157L、L178F、A179T、G223A或H307L。優(yōu)選地，PS4變異體包括下列取代中的至少一個(gè)G87S、G134R、A141P或S334P。在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，PS4變異多肽包括選自下列的組合G134R,A141PI157LG223AH307LS334PD343EG121D；G134RA141PI157LG223AH307LS334PD343EN33YG121D；G134RA141PI157LG223AH307LS334PD343EN33Y；G134R，A141PI157LG23AH307LS334PD343EN33YD34NK71RL178FA179TG87SG121DS214NT375A；G134R,A141PI157LG223AH307LS334PD343EN33YD34NK71RL178FA179TG121DY171SG188AN138D；G134R,A141PI157LG223AH307LS334PD343EN33YD34NK71RL178FA179TG121D；G87SG121DG134R,A141PI157LG223AH307LS334PD343EN33YD34NK71RL178FA179T；G87SG121DG134R,A141PI157LG223AH307LS334PD343EN33YD34NK71RL178FA179TG188A；G134R,A141PI157LG223AH307LS334PK71RL178FA179T；G134R,A141PI157LG223AH307LS334PL178FA179T；G134R，A141PI157LG223AH307LS334PN33YD34NL178FA179T;G134R，A141PI157LG223AH307LS334PL178FA179TG87SG121D；G134R,A141PI157LG223AH307LS334PL178FA179TG121D；G134R,A141PI157LG223AH307LS334PD343EN33YD34NK71RL178FA179TG121DE343D；G87SG121DG134R,A141PI157LG223AH307LS334PD343EN33YD34NK71RL178FA179T；G87SG121DG134R,A141PI157LG223AH307LS334PD343EN33YD34NK71RL178FA179TY33NN34DE343D；G134R,A141PI157LG223AH307LS334PD343EN33YD34NK71RL178FA179TG121D；G134R，A141PI157LG223AH307LS334PK71RL178FA179TG121D；G87S,V113I,G134R,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E；113F,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E；A99V,V113I,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E；Vl131，1157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343EV113I,G134R,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E；A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E；A199V,D343E,V113I,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P；V113I,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,S334P,D343E；V113I,G121D,G134R,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E；V113I,G121D,G134R,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E；V113I,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E；V113I,A141P,Y198F,G223A,V290I,H307L；V113I,A141P,Y198F,G223A,V290I,S334P,D343E；Vl131，A141P，Y198F,G223A,A268P,V290I,S399PV113I,A141P,Y198F,G223A,V290I,S399P；V113I,A141P,Y198W,G223A,V290I；V113I,A141P,Y198F,G223A,V290I；Y198F,G223A,V290I；Y198W,G223A,V290I；V113I,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I；V113M；V113A；V113I,G134R,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E；V113I,G134R,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,I315V,S334P,D343E；D34N,V113I,G134R,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E；V113I,G134R,A141P,I157L,G188S,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E；K71R,V113I,G134R,A141P,I157L,L178L,Y198F,G223A,V290I,H307L,G313G,S334P,D343E；D34N,V113I,G134R,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,G313G,S334P,D343E；V113I,G134R,A141P,I157L,A179V,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E；V113I,G134R,A141P,I157L,11701，Y198F,G223A,V290I,H307L,G313G,S334P,D343EV113I,G134R,A141P,I157L,A179V,Y198F,G223A,V290I,H307L,G313G,S334P,D343E；G87S,V113I,G134R,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E；V113I,G134R,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E,A405E；V113I,G134R,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E,A405V；A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E；V113I,G134R,A141P,I157L,Y198L,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E；V113I,G134R,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E；K71R,V113I,G134R,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E；K108R,V113I,G134R,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E；D34G,V113I,G134R,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E；G4D,V113I,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E;和A141P,G134R,G223A,H307L,I157L,V113I,V290I,Y198F,G188A；在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，PS4變異體多肽包括選自下列的組合G134R,A141P,1157L,G223A,H307L和S334P；G121D,G134R,A141P,I157L,G223A,H307L和S334；G87S,G121D,G134R,A141P,I157L,G223A,H307L和S334P；G134R,A141P,I157L,L178F,A179T,G223A，H307L和S334P;G87S,G121D,G134R,A141P,I157L,L178F,A179T,G223A,H307L和S334P；G121D,G134R,A141P,I157L,L178F,A179T,G223A,H307L和S334P；N33Y,D34N,G134R,A141P,I157L,L178F,A179T,G223A,H307L和S334P；N33Y,D34N,G121D,G134R,A141P,I157L,L178F,A179T,G223A,H307L和S334P;和N33Y,D34N,G87S,G121D,G134R,A141P,I157L,L178F,A179T,G223A,H307L和S334P。在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，PS4變異體多肽包括選自下列的組合N33Y,D34N,G134R,A141P,I157L,L178F,A179T,G223A,H307L和S334P；N33Y,D34N,G87S,G121D,G134R,A141P,I157L,L178F,A179T,G223A,H307L和S334P;和N33Y,D34N,G87S,G121D,G134R,A141P,I157L,L178F,A179T,G223A,H307L和S334P在優(yōu)選的實(shí)施方案中，PS4變異體是包含在SEQIDNO2；SEQIDNO3；SEQIDNO4；SEQIDNO:13，SEQIDNO:14，SEQIDNO:15，SEQIDNO:8，SEQIDNO9或SEQIDNO10中列出的序列的氨基酸。PS4變異體可以是源自假單胞菌(Pseudomonassp)。在一種實(shí)施方案中，假單胞菌某種是選自嗜糖假單胞菌和施氏假單胞菌。PS4變異多肽可以包括除上面列出的那些突變之外的一種或多種突變。也可以包括其它突變，例如在一個(gè)或多個(gè)其它位點(diǎn)的刪除、插入、取代、顛換、轉(zhuǎn)換和倒位(inversions)。同樣地,多肽可以缺失上面列出的取代的至少一個(gè)。在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，多肽被截短。截短(truncation)可以在N末端或C末端。親代酶或PS4變異體可以缺少一個(gè)或多個(gè)部分,例如子序列(sub-sequences)、信號(hào)序列、結(jié)構(gòu)域或部分(moieties)，不論其是有活性或是沒有活性的。例如，如本文所描述，親代酶或PS4變異體多肽可以缺乏信號(hào)序列。作為選擇地，或者附加地，親代酶或PS4變異體可以缺乏一個(gè)或多個(gè)催化結(jié)構(gòu)域或結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，親代酶或PS4變異體可以缺乏存在于非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶中的一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)域，如淀粉結(jié)合結(jié)構(gòu)域。例如，PS4多肽可以僅具有直至位置429的序列，這是相對(duì)于SEQIDNO1中列出的嗜糖假單胞菌非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶的編號(hào)而言的。在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，提供了PS4變異體pSac-d34(SEQIDNO:15，圖8c)、pSac_D20(SEQIDNO:13，圖8a)和pSac_D14(SEQIDNO:14，圖8b)，所述變異體具有如圖中列出的氨基酸序列。PS4變異體也可以包括同源序列。同源序列包括核苷酸序列，其與編碼PS4變異體多肽酶的核苷酸序列有至少75%、80%、85%或90%是相同的(indentical)，優(yōu)選地有至少95%、96%、97%、98%或99%是相同的。優(yōu)選的實(shí)施方案也包括功能上的等價(jià)物(functionalequivalents)。本文中描述的PS4變異多肽來源于優(yōu)選地顯示出非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶活性的多肽或者是優(yōu)選地顯示出非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶活性的多肽的變異體。優(yōu)選地，親代酶本身是非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶。優(yōu)選實(shí)施方案中的PS4變異多肽也顯示出非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶活性。本文描述的PS4變異體將優(yōu)選地具有外切特異性，例如，由本文所描述的外切特異性指數(shù)(exospecificityindices)所量度的,這和它們是外切淀粉酶相一致。而且,與親代酶或它們的起源多肽相比較，它們優(yōu)選地具有更高的或增加的外切特異性。因此，例如，PS4變異多肽可以具有20或更大的外切特異性指數(shù)，即，其總淀粉酶活性(包括外切淀粉酶活性)比其內(nèi)切淀粉酶活性多20倍或更多。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，外切淀粉酶的外切特異性指數(shù)是30或更多、40或更多、50或更多、60或更多、70或更多、80或更多、90或更多、或100或更多。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，外切特異性指數(shù)是150或更多、200或更多、300或更多、或400或更多。優(yōu)選地，PS4變異體將比親代更加熱穩(wěn)定。優(yōu)選地，PS4變異多肽能夠在從大約55°C至大約80°C或更高的溫度下降解淀粉。優(yōu)選地，PS4變異體在暴露于高達(dá)大約95°C的溫度后保持其活性。本文描述的PS4變異多肽相對(duì)于親代酶，具有延長(zhǎng)的半衰期，優(yōu)選地延長(zhǎng)10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%或更多，這優(yōu)選地在從55°C至大約95°C或更高的高溫下，優(yōu)選地在大約80°C發(fā)生。優(yōu)選地，將樣品在80°C或更高溫度下加熱1-10分鐘。優(yōu)選地，PS4變異多肽是更加pH穩(wěn)定的。優(yōu)選地，它比其同源親代多肽的pH穩(wěn)定性高。優(yōu)選地，PS4變異多肽能夠在pH從大約5至大約10.5時(shí)降解淀粉。在相同的pH條件下，和它們的親代多肽相比較時(shí)，PS4變異多肽可以具有多出10%、20%、30%、40%、50%、60%,70%,80%,90%,100%,200%或更長(zhǎng)的半衰期。在另一種實(shí)施方案中，可以通過測(cè)定酶在特定PH條件下的活性或比活性來分析pH穩(wěn)定性的程度。特定的pH條件可以是從pH5至pH10.5的任何pH。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，功能上的等價(jià)物將和PS4家族成員中的至少一個(gè)具有序列同源性。功能上的等價(jià)物將和上面提及的嗜糖假單胞菌和施氏假單胞菌非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶中的任一個(gè)具有序列同源性，優(yōu)選地，和兩者都具有序列同源性。功能上的等價(jià)物也可以和SEQIDNOs:1至12中所示序列的任一個(gè)，優(yōu)選地和SEQIDNO:1或SEQIDNO7或兩者具有序列同源性。序列同源性優(yōu)選地至少是60%、優(yōu)選地是65%或更多、優(yōu)選地是75%或更多、優(yōu)選地是80%或更多、優(yōu)選地是85%或更多、優(yōu)選地是90%或更多、優(yōu)選地是95%或更多。序列同源性可以通過本文列出的任何程序或所有程序生成。在其它的實(shí)施方案中，功能性等價(jià)物將能夠特異地和上面列出的任何序列雜交。在第二方面，本發(fā)明提供了核酸，該核酸編碼包括PS4變異體的多肽，多肽可以從親代多肽得到，如上所述。親代酶可以優(yōu)選地是SEQIDNO1中列出的或SEQIDNO:5中列出的嗜糖假單胞菌非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶。親代酶可以優(yōu)選地是SEQIDNO:7列出的或SEQIDNO:11中列出的施氏假單胞菌非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶。PS4家族的其它成員可以被用作親代酶。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，親代多肽是來自嗜糖假單胞菌非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶的非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶，其具有如SEQIDNO:I列出的或SEQIDNO5列出的序列。在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，親代多肽包括來自施氏假單胞菌的非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶，其具有如SEQIDNO:7列出的或SEQIDNO:11列出的序列。在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，編碼PS4變異體的核酸通過編碼氨基酸取代而不同于親代核酸，所述取代所處的位置包括至少一個(gè)位置，其選自:4、9、13、33、34、42、70、71、87、99、100、108、113、121、131、134、135、141、153、157、158、160、161、166、170、171、178、179、184、188、198、199、221、223、238、270、277、290、307、315、334、335、342、343、372、392、398、399、405、415、425，其中對(duì)位置所作的編號(hào)是參照SEQIDN01列出的嗜糖假單胞菌序列。優(yōu)選地，所述位置選自下列的至少一個(gè)位置33、34、87、121、134、141、157、178、179、223、307和334。優(yōu)選地，編碼PS4變異體的核酸包括編碼多肽中至少一個(gè)取代的核酸，所述取代選自:N33Y、D34N、G87S、G121D、G134R、A141P、I157L、L178F、A179T、G223A、H307L^PS334P。優(yōu)選地，編碼PS4變異體的核酸包括下列取代N33Y、D34N、G134R、A141P、I157L、G223A、H307L和S334P，并帶有至少一個(gè)另加的L178F或A179T取代。優(yōu)選地，編碼PS4變異體的核酸包括下列取代中的一個(gè)N33Y、D34N、I157L、L178F、A179T、G223A*H307L。優(yōu)選地，編碼PS4變異體的核酸包括下列取代中的一個(gè)G87S、G134R、A141P或S334P。在另一種實(shí)施方案中，編碼PS4變異體的核酸包括編碼下列取代中的至少一個(gè)的核酸K71R、K108R、G158D、Y171S、G188A和D343E。在另一種實(shí)施方案中，編碼PS4變異體的核酸包括這樣的核酸，其編碼下列的至少一個(gè)組合G134R,A141PI157LG223AH307LS334PD343EG121D；G134RA141PI157LG223AH307LS334PD343EN33YG121D；G134RA141PI157LG223AH307LS334PD343EN33Y；G134R,A141PI157LG223AH307LS334PD343EN33YD34NK71RL178FA179TG87SG121DS214NT375A；G134R,A141PI157LG223AH307LS334PD343EN33YD34NK71RL178FA179TG121DY171SG188AN138D；G134R,A141PI157LG223AH307LS334PD343EN33YD34NK71RL178FA179TG121D；G87SG121DG134R,A141PI157LG223AH307LS334PD343EN33YD34NK71RL178FA179T；G87SG121DG134R,A141PI157LG223AH307LS334PD343EN33YD34NK71RL178FA179TG188A；G134R,A141PI157LG223AH307LS334PK71RL178FA179T；G134R,A141PI157LG223AH307LS334PL178FA179T；G134R，A141PI157LG223AH307LS334PN33YD34NL178FA179T;G134R，A141PI157LG223AH307LS334PL178FA179TG87SG121D；G134R,A141PI157LG223AH307LS334PL178FA179TG121D；G134R,A141PI157LG223AH307LS334PD343EN33YD34NK71RL178FA179TG121DE343D；G87SG121DG134R,A141PI157LG223AH307LS334PD343EN33YD34NK71RL178FA179T；G87SG121DG134R,A141PI157LG223AH307LS334PD343EN33YD34NK71RL178FA179TY33NN34DE343D；G134R,A141PI157LG223AH307LS334PD343EN33YD34NK71RL178FA179TG121D；G134R，A141PI157LG223AH307LS334PK71RL178FA179TG121D；G87S,V113I,G134R,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E；113F,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E；A99V,V113I,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E；V113I,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343EV113I,G134R,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E；A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E；A199V,D343E,V113I,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P；V113I,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,S334P,D343E；V113I,G121D,G134R,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E；V113I,G121D,G134R,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E；V113I,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E；V113I,A141P,Y198F,G223A,V290I,H307L；V113I,A141P,Y198F,G223A,V290I,S334P,D343E；V113I,A141P,Y198F,G223A,A268P,V290I,S399PV113I,A141P,Y198F,G223A,V290I,S399P；V113I,A141P,Y198W,G223A,V290I；V113I,A141P,Y198F,G223A,V290I；Y198F,G223A,V290I；Y198W,G223A,V290I；V113I,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I；V113M；V113A；V113I,G134R,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E；V113I,G134R,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,I315V,S334P,D343E；D34N,V113I,G134R,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E；V113I,G134R,A141P,I157L,G188S,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E；K71R,V113I,G134R,A141P,I157L,L178L,Y198F,G223A,V290I,H307L,G313G,S334P,D343E；D34N,V113I,G134R,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,G313G,S334P,D343E；V113I,G134R,A141P,I157L,A179V,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E；V113I,G134R,A141P,I157L,11701，Y198F,G223A,V290I,H307L,G313G,S334P,D343EV113I,G134R,A141P,I157L,A179V,Y198F,G223A,V290I,H307L,G313G,S334P,D343E；G87S,V113I,G134R,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E；V113I,G134R,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E,A405E；V113I,G134R,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E,A405V；A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E；V113I,G134R,A141P,I157L,Y198L,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E；V113I,G134R,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E；K71R,V113I,G134R,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E；K108R,V113I,G134R,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E；D34G,V113I,G134R,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E；G4D,V113I,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E;和A141P,G134R,G223A,H307L,I157L,V113I,V290I,Y198F,G188A；G134R,A141P,I157L,G223A,H307L和S334P；G121D,G134R,A141P,I157L,G223A,H307L和S334；G87S,G121D,G134R,A141P,I157L,G223A,H307L和S334P；G134R,A141P,I157L,L178F,A179T,G223A，H307L和S334P;G87S,G121D,G134R,A141P,I157L,L178F,A179T,G223A,H307L和S334P；G121D,G134R,A141P,I157L,L178F,A179T,G223A,H307L和S334P；N33Y,D34N,G134R,A141P,I157L,L178F,A179T,G223A,H307L和S334P；N33Y,D34N,G121D,G134R,A141P,I157L,L178F,A179T,G223A,H307L和S334P;和N33Y,D34N,G87S,G121D,G134R,A141P,I157L,L178F,A179T,G223A,H307L和S334P；N33Y,D34N,G134R,A141P,I157L,L178F,A179T,G223A,H307L和S334P；N33Y,D34N,G87S,G121D,G134R,A141P,I157L,L178F,A179T,G223A,H307L和S334P;和N33Y,D34N,G87S,G121D,G134R,A141P,I157L,L178F,A179T,G223A,H307L和S334P。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，編碼PS4變異體的核酸編碼氨基酸序列，所述氨基酸序列包括SEQIDNO2；SEQIDNO3；SEQIDNO4；SEQIDNO:13；SEQIDNO:14；SEQIDNO15；SEQIDNO8,SEQIDNO:9或SEQIDNO:10。在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，核酸編碼截短的多肽。截短可以在N末端或C末端。親代酶或PS4變異體可以缺少一個(gè)或多個(gè)部分，如子序列、信號(hào)序列、結(jié)構(gòu)域或部分(moieties)，不論是有活性的或是沒有活性的。例如，親代酶或PS4變異多肽可以缺乏信號(hào)序列。替代地，或附加地，親代酶或PS4變異體可以缺乏一個(gè)或多個(gè)催化結(jié)構(gòu)域或結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，親代酶或PS4變異體可以缺乏存在于非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶中的一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)域，如淀粉結(jié)合結(jié)構(gòu)域。例如，PS4多肽可以具有僅至位置429的序列，這是相對(duì)于SEQIDNO:1中顯示的嗜糖假單胞菌非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶的編號(hào)而言的。在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，核酸編碼如圖中列出的PS4變異體pSac-d34、pSac-D20和pSac_D14。編碼PS4變異多肽的核酸可以包括除上面列出的那些突變之外的一個(gè)或多個(gè)突變。也可以包括其它突變，例如在一個(gè)或多個(gè)其它位置的刪除、插入、取代、顛換、轉(zhuǎn)換和倒位。同樣地，核酸編碼的多肽可以缺少至少一個(gè)在上面列出的取代。編碼PS4變異體的核酸也可以包括同源序列。同源序列包括核苷酸序列，其與編碼PS4變異多肽酶的序列是至少75%、80%、85%或90%相同的，優(yōu)選的是至少95%、96%、97%、98%或99%相同的。優(yōu)選的實(shí)施方案也包括編碼多肽的核酸，所述多肽是PS4變異體的功能上的等價(jià)物。編碼本文中描述的PS4變異多肽的核酸衍生自這樣的核酸或是這樣的核酸的變異體，所述核酸優(yōu)選地編碼具有非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶活性的酶。優(yōu)選地，由核酸編碼的親代酶本身是非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶。優(yōu)選實(shí)施方案中由核酸編碼的PS4變異多肽也顯示出非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶活性。如本文描述，由核酸編碼的PS4變異體將優(yōu)選地具有外切特異性，例如，由外切特異性指數(shù)所量度的。而且，優(yōu)選地，在相同條件下，與親代酶或它們的起源多肽相比較，它們優(yōu)選地具有更高的或增加的外切特異性。因此，例如，PS4變異多肽可以具有10%、20%、30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%,100%,200%或更高的外切特異性指數(shù)。優(yōu)選地在相同條件下，當(dāng)和它們的親代多肽相比較時(shí)，它們具有I.5x或更高、2x或更高、5x或更高、IOx或更高、50x或更高、IOOx或更高的外切特異性。優(yōu)選地，由核酸編碼的PS4變異體將比親代更加熱穩(wěn)定。優(yōu)選地，PS4變異多肽能夠在從大約55°C至大約80°C或更高的溫度下降解淀粉。優(yōu)選地，PS4變異體在暴露于高達(dá)大約95°C的溫度后保持其活性。本文描述的PS4變異多肽相對(duì)于親代酶，具有延長(zhǎng)的半衰期，優(yōu)選地延長(zhǎng)10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%或更多，這優(yōu)選地在從55°C至大約95°C或更高的高溫下，優(yōu)選地在大約80°C發(fā)生。優(yōu)選地，將樣品在80°C或更高的溫度下加熱1-10分鐘。優(yōu)選地，由核酸編碼的PS4變異多肽是pH穩(wěn)定的。優(yōu)選地，它比其親代多肽的pH穩(wěn)定性高。優(yōu)選地，PS4變異多肽能夠在pH從大約5至大約10.5時(shí)降解淀粉。具體的pH條件可以是從PH5至pH10.5的任何pH。在相同的條件下，和親代多肽相比較時(shí)，該核酸編碼的PS4變異多肽可以具有更長(zhǎng)的半衰期或更高的活性(取決于分析方法)。在相同的pH條件下，和親代多肽相比較時(shí)，PS4變異多肽可以有10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、200%或更長(zhǎng)的半衰期。替代地，或附加地，在相同的pH條件下，和親代多肽相比較時(shí)，它們可以具有更高的活性。在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，該核酸編碼的功能上的等價(jià)物將和PS4家族成員中的至少一個(gè)具有序列同源性。功能上的等價(jià)物將和上面提及的嗜糖假單胞菌和施氏假單胞菌非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶中的任一個(gè)具有序列同源性，在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，優(yōu)選地和兩者都具有序列同源性。功能上的等價(jià)物也可以和SEQIDNOs:1至12中的任何一個(gè)，優(yōu)選地和SEQIDNO:1或SEQIDNO:7或兩者具有序列同源性。序列同源性優(yōu)選地至少是60%、優(yōu)選地是65%或更多、優(yōu)選地是75%或更多、優(yōu)選地是80%或更多、優(yōu)選地是85%或更多、優(yōu)選地是90%或更多、優(yōu)選地是95%或更多。在其它實(shí)施方案中，提供了核酸，所述核酸和編碼本文列出的任意PS4變異體的核酸互補(bǔ)。此外，提供了能夠和該互補(bǔ)序列雜交的核酸。在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，編碼功能上等價(jià)物的核酸將能夠特異地和上面列出的任意序列雜交，它和它的互補(bǔ)物提供于此。在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，用于本文描述的方法和組合物的序列是合成序列。其包括但不限于，利用宿主生物體的最佳密碼子使用所形成的序列，宿主生物體如甲基營(yíng)養(yǎng)酵母畢赤酵母(Pichia)和漢遜酵母(Hansenula)。本發(fā)明的第三方面提供了組合物，其包括至少一種PS4變異多肽和另一組分。另一組分可以是酶，其選自氧化還原酶、水解酶、脂肪酶、酯酶、糖苷酶、淀粉酶、支鏈淀粉酶、木聚糖酶、纖維素酶、半纖維素酶、淀粉降解酶、蛋白酶和脂加氧酶。在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，組合物包括至少一種PS4變異體和來自桿菌的產(chǎn)麥芽淀粉酶，如W091/04669中所公開的。優(yōu)選的實(shí)施方案包括PS4變異體和面粉。另外的酶可以和任何面團(tuán)成分共同加入，面團(tuán)成分包括面粉、水或任選的其它組分或添加劑或面團(tuán)改良組合物(doughimprovingcomposition)?？梢栽诿娣?、水或任選的其它組分或添加劑或面團(tuán)改良組合物之前或之后加入另外的酶。另外的酶可以是液體制備物，或干燥組合物的形式。第四方面提供了包括PS4變異多肽的載體、包括PS4變異多肽的細(xì)胞和表達(dá)PS4變異多肽的方法。在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及重組的可復(fù)制載體，其帶有編碼PS4變異多肽的核酸。載體可以附加地包括本文列出的任何兀素。另一種優(yōu)選的實(shí)施方案提供了宿主細(xì)胞，其包含編碼PS4變異體的核酸。宿主細(xì)胞可以是本文列出的任何細(xì)菌、真菌或酵母細(xì)胞。在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，如本文所提供，本發(fā)明涉及表達(dá)PS4多肽的方法。本發(fā)明的其它方面可以在相關(guān)申請(qǐng)中找到，其律師案卷編號(hào)為674510-2007和GC806P，它們?cè)诖瞬⑷胱鳛閰⒖?，包括任何圖表、參考文獻(xiàn)和附圖。圖I顯示了PS4變異體的熱穩(wěn)定性改善。PS4ccl是表達(dá)的對(duì)照酶，其來自嗜糖假單胞菌，不帶有信號(hào)序列并缺乏淀粉結(jié)合結(jié)構(gòu)域。對(duì)PS4ccl、pSac-D3、pSac-D20和pSac_D14，以半衰期對(duì)溫度作圖，半衰期以分鐘表示，溫度以攝氏度表示。圖2顯不了在模型面團(tuán)體系試驗(yàn)(modeldoughsystemtrial)中，PSac_D34的劑量效應(yīng)。面包屑的固體含量是通過NMR測(cè)定的。對(duì)于對(duì)照、D340.5、l、2ppm，以通過固體含量來量度的堅(jiān)硬度對(duì)烘焙后的天數(shù)作圖。圖3顯示了烘焙試驗(yàn)(bakingtrial)的結(jié)果,結(jié)果顯示了以每kg面粉Img的劑量加入PSac_D3和Psac_D14時(shí)，降低的堅(jiān)硬性和堅(jiān)硬速度。對(duì)對(duì)照組，以通過hPa量度的堅(jiān)硬性對(duì)烘焙后的天數(shù)作圖。圖4顯示了烘焙試驗(yàn)，顯示了相比于不帶有N33Y、D34N、K71R、L178F、A179T的PSac-D3,PSac-D3(G134R、A141P、I157L、G223A、A307L、S334P、K71R、D343E、N33Y、D34N、L178F、A179T)的增加軟化的效應(yīng)，在75C時(shí)，和PSac_D3的9，3分鐘相比，其t1/2_75是3，6。圖5顯示了PS4(SEQIDNO1)參照序列，來自嗜糖假單胞菌麥芽四糖水解酶氨基酸序列。圖6顯示了PS4變異體的序列(SEQIDNO2);嗜糖假單胞菌麥芽四糖水解酶氨基酸序列，其帶有G134R、A141P、I157L、G223A、H307L、S334P、N33Y、D34N、L178F和A179T取代。圖I顯示了PS4變異體的序列(SEQIDNO3);嗜糖假單胞菌麥芽四糖水解酶氨基酸序列，其帶有G134R、A141P、I157L、G223A、H307L、S334P、N33Y、D34N、L178F、A179T和G121D取代。圖8A顯示了PS4變異體的序列(SEQIDNO4);嗜糖假單胞菌麥芽四糖水解酶氨基酸序列，其帶有G134R、A141P、1157L、G223A、H307L、S334P、N33Y、D34N、L178F、A179T、G121D和G87S取代。圖8B顯示了PSac_D20序列(SEQIDNO13);嗜糖假單胞菌麥芽四糖水解酶氨基酸序列，其帶有13個(gè)取代和淀粉結(jié)合結(jié)構(gòu)域的刪除。圖8C顯示了PSac_D14序列(SEQIDNO:14);嗜糖假單胞菌麥芽四糖水解酶氨基酸序列，其帶有14個(gè)取代和淀粉結(jié)合結(jié)構(gòu)域的刪除。圖8D顯示了PSac_D34序列的序列(SEQIDNO15);嗜糖假單胞菌麥芽四糖水解酶氨基酸序列，其帶有11個(gè)取代和淀粉結(jié)合結(jié)構(gòu)域的刪除。圖9顯示了嗜糖假單胞菌麥芽四糖水解酶的氨基酸序列(SEQIDNO:5)。嗜糖假單胞菌葡聚糖l，4-a-麥芽四糖水解酶前體(EC3.2.I.60)(G4-淀粉酶)(麥芽四糖形成淀粉酶)(外切麥芽四糖水解酶)(麥芽四糖形成外切淀粉酶)。SWISS-PROT登記號(hào)(accessionnumber)是P22963。圖IOA和IOB顯示了嗜糖假單胞菌麥芽四糖水解酶的核酸序列(SEQIDNO6)。編碼麥芽四糖水解酶的嗜糖假單胞菌mta基因(EC登記號(hào)=3.2.I.60)。GenBank登記號(hào)是X16732。圖11顯示了施氏假單胞菌麥芽四糖水解酶的氨基酸序列(SEQIDNO7)。圖12顯示了PStu-D34的序列(SEQIDNO8);施氏假單胞菌麥芽四糖水解酶的氨基酸序列，其帶有G134R、A141P、I157L、G223A、H307L、S334P、N33Y、D34N取代。圖13顯示了PStu-D20的序列(SEQIDNO9);施氏假單胞菌麥芽四糖水解酶的氨基酸序列，其帶有G134R、A141P、I157L、G223A、H307L、S334P、N33Y、D34N和G121D。圖14顯示了PStu_D14的序列(SEQIDNO10);施氏假單胞菌麥芽四糖水解酶的氨基酸序列，其帶有G134R、A141P、I157L、G223A、H307L、S334P、N33Y、D34N、G121D和G87S。圖15顯不了施氏假單胞菌(Pseudomonasperfectomarina)的序列(SEQIDNO:11)。葡聚糖1，4-a-麥芽四糖水解酶前體(EC3.2.1.60)(G4-淀粉酶)(麥芽四糖形成淀粉酶)(外切麥芽四糖水解酶)(麥芽四糖形成外切淀粉酶)。SWISS-PR0T登記號(hào)P13507。圖16顯示了施氏假單胞菌麥芽四糖水解酶核酸序列的序列。施氏假單胞菌麥芽四糖形成淀粉酶(_yP)基因的全長(zhǎng)編碼序列(completecds.)GenBank登記號(hào)M24516(SEQIDNO:12)。具體實(shí)施例方式如無其它指明，本發(fā)明的實(shí)踐將采用常規(guī)的化學(xué)、分子生物學(xué)、微生物學(xué)、重組DNA和免疫學(xué)技術(shù)，這些都包含在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。這些技術(shù)在文獻(xiàn)中得到闡述。參見，例如，J.Sambrook,E.F.Fritsch,和T.Maniatis,1989,MolecularCloningALaboratoryManual,SecondEdition,Books1-3,ColdSpringHarborLaboratoryPress；Ausubel,F.M.等(1995和定期增刊；CurrentProtocolsinMolecularBiology,ch.9,13,和16,JohnWiley&Sons,NewYork,N.Y.);B.Roe,J.Crabtree,和A.Kahn,1996,DNAIsolationandSequencingEssentialTechniques,JohnWiley&Sons；J.M.Polak和James0'D.McGee,1990,InSituHybridization!PrinciplesandPractice；OxfordUniversityPress；M.J.Gait(編者)，1984,OligonucleotideSynthesisAPracticalApproach,IrlPress；D.M.J.Lilley和J.E.Dahlberg,1992,MethodsofEnzymologyDNAStructurePartASynthesisandPhysicalAnalysisofDNAMethodsinEnzymology,AcademicPress；UsingAntibodiesALaboratoryManualPortableProtocolNO.I,作者是EdwardHarlow,DavidLane,EdHarlow(1999,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ISBN0-87969-544-7)；AntibodiesALaboratoryManual,作者是EdHarlow(Editor),DavidLane(Editor)(1988,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ISBN0-87969-314-2),1855,Lars-IngeLarsson"ImmunocytochernistryTheoryandPractice",CRCPressinc.,BacaRaton,Florida,1988,ISBN0-8493-6078-1,JohnD.Pound(ed)；"ImmunochemicalProtocols,vol80"，來自系列"MethodsinMolecularBiology",HumanaPress,Totowa,NewJersey,1998,ISBN0-89603-493-3,HandbookofDrugScreening,由RamakrishnaSeethala,PrabhavathiB.Fernandes編輯(2001，NewYork,NY,MarcelDekker,ISBN0-8247-0562-9)JPLabRefAHandbookofRecipes,Reagents,andOtherReferenceToolsforUseattheBench,JaneRoskams和LindaRodgers,2002,ColdSpringHarborLaboratory,ISBN0-87969-630-3。這些普通文獻(xiàn)中的每一個(gè)在此并入，作為參考。如本文所應(yīng)用，“PS4”是指有關(guān)嗜糖假單胞菌非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶或施氏假單胞菌非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶的家族成員，或與嗜糖假單胞菌非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶或施氏假單胞菌非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶具有序列同源性或功能上同源性的家族成員，嗜糖假單胞菌非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶如具有SEQIDNO1或SEQIDNO5列出的氨基酸序列的外切淀粉酶，施氏假單胞菌非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶如具有SEQIDNO:7或SEQIDNO:11列出的氨基酸序列的多肽。其它的家族成員在表I中列出。對(duì)來源于嗜糖假單胞菌外切淀粉酶的PS4變異體的位置編號(hào)是參照SEQIDN01IDQAGKSPAGVRYHGGDEIILQGFHWNVVREAPNDffYNILRQQASTIAADGFSAIWMPVPff61RDFSSffTDGGKSGGGEGYFffHDFNKNGRYGSDAQLRQAAGALGGAGVKVLYDVVPNHMNR121GYPDKEINLPAGQGFffRNDCADPGNYPNDCDD⑶RFIGGESDLNTGHPQIYGMFRDELAN181LRSGYGAGGFRFDFVRGYAPERVDSWMSDSADSSFCVGELWKGPSEYPSffDffRNTASffQQ241IIKDffSDRAKCPVFDFALKERMQNGSVADffKHGLNGNPDPRffREVAVTFVDNHDTGYSPG301QNGGQHHWALQDGLIRQAYAYILTSPGTPVVYffSHMYDffGYGDFIRQLIQVRRTAGVRAD361SAISFHSGYSGLVATVSGSQQTLVVALNSDLANPGQVASGSFSEAVNASNGQYRVffRSGS421⑶GGGNDGGEGGLVNVNFRCDNGVTQMGDSVYAVGNVSQLGNWSPASAVRLTDTSSYPTff481KGSIALPDGQNVEffKCLIRNEADATLVRQffQSGGNNQVQAAAGASTSGSF參照序列來自嗜糖假單胞菌序列，其SWISS-PR0T登記號(hào)是P22963，但是沒有信號(hào)序列MSHILRAAVLAAVLLPFPALA。盡管是用特定的序列作為基本參照點(diǎn)，但該編號(hào)系統(tǒng)也可以適用于所有相關(guān)的同源序列。例如，該位置編號(hào)可以被用于來自其它假單胞菌種的同源序列，或來自其它細(xì)菌的同源序列。優(yōu)選地，這種同源序列有60%或更多的同源性，例如70%或更多、80%或更多、90%或更多或95%或更多的同源性，這是相對(duì)于參照序列SEQIDNO:1而言的?？梢杂帽疚拿枋龅墓穆?lián)配程序和雜交技術(shù)確認(rèn)蛋白之間的序列同源性。對(duì)來源于施氏假單胞菌的PS4變異體的位置進(jìn)行的編號(hào)是參照SEQIDNO7IDQAGKSPNAVRYHGGDEIILQGFHWNVVREAPNDffYNILRQQAATIAADGFSAIWMPVPff61RDFSSffSDGSKSGGGEGYFffHDFNKNGRYGSDAQLRQAASALGGAGVKVLYDVVPNHMNR121GYPDKEINLPAGQGFffRNDCADPGNYPNDCDD⑶RFIGGDADLNTGHPQVYGMFRDEFTN181LRSQYGAGGFRFDFVRGYAPERVNSWMTDSADNSFCVGELWKGPSEYPNWDffRNTASffQQ241IIKDffSDRAKCPVFDFALKERMQNGSIADffKHGLNGNPDPRffREVAVTFVDNHDTGYSPG301QNGGQHHWALQDGLIRQAYAYILTSPGTPVVYffSHMYDffGYGDFIRQLIQVRRAAGVRAD361SAISFHSGYSGLVATVSGSQQTLVVALNSDLGNPGQVASGSFSEAVNASNGQVRVffRSGT421GSGGGEPGALVSVSFRCDNGATQMGDSVYAVGNVSQLGNWSPAAALRLTDTSGYPTffKGS481IALPAGONEEWKCLIRNEANATQVRQffQGGANNSLTPSEGATTVGRL如本文所應(yīng)用，“PS4變異核酸”(PS4variantnucleicacids)是指編碼PS4多肽的核酸，所述多肽是PS4家族成員的變異體。如本文所應(yīng)用，“PS4變異多肽”(PS4variantpolypeptides)或“PS4變異體”(PS4variant)是指多肽，所述多肽是PS4家族成員的變異體。如本文所應(yīng)用，“親代酶”(parentenzymes)、“親代序列”(parentsequence)、“親代多肽”(parentpolypeptide)、“親代多肽”(parentpolypeptides)是指酶和多肽，PS4變異多肽是基于所述的酶和多肽。親代酶可以是前體酶(即，實(shí)際上被突變的酶)或其可以被從頭制備。親代酶可以是野生型的酶。如此處所應(yīng)用，“變異體”(variant)意味著衍生自親代分子的分子。變異體將包括多肽以及核酸。其中，變異體將包括在一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)處的取代、插入、顛換和倒位。變異體也將包括截短。變異體將包括親代分子的同源衍生物和功能衍生物。變異體還包括這樣的序列，其與能夠雜交于本文列出的核苷酸序列的序列互補(bǔ)。例如，變異體序列互補(bǔ)于這樣的序列，所述序列能夠在嚴(yán)緊條件下(例如50°C和0.2xSSC{lxSSC=0.15MNaCl，0.015M檸檬酸三鈉pH7.0})和本文出現(xiàn)的核苷酸序列雜交。更優(yōu)選地，術(shù)語(yǔ)變異體包括互補(bǔ)于下述序列的序列，其能夠在高度嚴(yán)緊的條件下(例如，65°C和0.IxSSC{lxSSC=0.15MNaCl，0.015M檸檬酸三鈉pH7.0})和本文出現(xiàn)的核苷酸序列雜交。如本文所應(yīng)用，“前體”(precursor)是指用于產(chǎn)生修飾的酶的酶。前體可以是通過突變被修飾的酶。同樣地，前體可以是野生型的酶、變異的野生型酶或已經(jīng)突變的酶。如本文所應(yīng)用，親代酶的“功能上的等價(jià)物"(functionalequivalent)是指,和親代分子有相似或相同功能的分子。親代分子可以是嗜糖假單胞菌非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶或施氏假單胞菌非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶或從其它來源得到的多肽。功能上等價(jià)的酶可以有不同的氨基酸序列但具有非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶活性。本文描述了確定功能的分析的實(shí)例，這對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員是已知的。如本文所應(yīng)用，“分離的”(isolated)是指，序列至少基本上游離于至少一種其它組分，所述組分是與所述序列天然聯(lián)系的并在天然中發(fā)現(xiàn)的。如本文所應(yīng)用，“純化的”(purified)是指，序列處于相對(duì)純的狀態(tài)——例如，至少大約90%純度，或至少大約95%純度或至少大約98%純度。如本文所應(yīng)用，“淀粉酶”(amylase)是指這樣的酶，其尤其能夠催化淀粉的降解。淀粉酶是水解酶，其切割淀粉中的a-D_(l—4)0-糖苷鍵。通常地，a-淀粉酶(E.C.3.2.I.I,a-D-(I—4)-葡聚糖葡聚糖水解酶)被定義為，以隨機(jī)方式切割淀粉分子中的a-D-(l—4)0-糖苷鍵的內(nèi)作用酶(endo-actingenzymes)。與之對(duì)照,外作用淀粉分解酶(exo-actingamylolyticenzymes)如3-淀粉酶(E.C.3.2.I.2,a-D-(I—4)-葡聚糖麥芽水解酶)和一些產(chǎn)物特異性淀粉酶如產(chǎn)麥芽a-淀粉酶(E.C.3.2.I.133)，從底物的非還原末端切割淀粉分子。P-淀粉酶、a-葡萄糖苷酶(E.C.3.2.I.20,a-D-葡糖苷葡糖水解酶)、葡糖淀粉酶(E.C.3.2.I.3，a-D-(I—4)-葡聚糖葡糖水解酶)，和產(chǎn)物特異性淀粉酶可以從淀粉產(chǎn)生特定長(zhǎng)度的麥芽寡糖。如本文所應(yīng)用，“非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶”(non-maltogenicexoamylaseenzyme)是指這樣的酶，其起初并不降解淀粉為實(shí)質(zhì)量的麥芽糖。用于實(shí)施這種確認(rèn)的分析方法提供于本文。如本文所應(yīng)用，“線性的麥芽寡糖”(linearmalto-oligosaccharide)是指，由a-(I-4)鍵連接的2-20個(gè)單位的a-D-吡喃型葡萄糖。如本文所應(yīng)用，“熱穩(wěn)定的"(thermostable)涉及酶暴露于升高的溫度之后保持活性的能力。酶如非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶的熱穩(wěn)定性是通過其半衰期來測(cè)定的。半衰期(t1/2)是以分鐘表示的時(shí)間，在此時(shí)間期間內(nèi)，在限定的條件下，酶活性的一半喪失。半衰期值是通過測(cè)定殘留的淀粉酶活性而計(jì)算的。半衰期分析如實(shí)施例中更詳細(xì)的描述而進(jìn)行。如本文所應(yīng)用，“pH穩(wěn)定的”(pHstable)是指酶在寬范圍的pHs下保持活性的能力。PH分析如實(shí)施例所描述而進(jìn)行。如本文所應(yīng)用，“外切特異性的”(exo-specific)涉及改進(jìn)的，例如，增加的“外切特異性指數(shù)”(exo-specificityindex),如與未取代的外切淀粉酶的外切特異性比率相比較時(shí)。如本文所應(yīng)用，“外切特異性指數(shù)”(exo-specificityindex)是指總淀粉酶活性與總內(nèi)切淀粉酶活性的比率。測(cè)定淀粉酶和內(nèi)切淀粉酶活性的分析方法提供于本文。如本文所應(yīng)用，“食物”將包括制備好的食物以及食物的成分，如面粉。如本文所應(yīng)用，“食物成分”(foodingredient)將包括配方(制劑)，其可以是功能食品(functionalfoods)或食品原料(foodstuffs)或可以被加入功能食品或食品原料，并包括以低水平應(yīng)用于寬范圍產(chǎn)品中的配方，所述產(chǎn)品需要例如酸化或乳化。食物成分可以是溶液的形式或固體形式——這取決于用途和/或應(yīng)用的方式和/或給予的方式。如本文所應(yīng)用，“功能食品”是指這樣的食品，其不僅能夠提供營(yíng)養(yǎng)效果和/或味覺上的滿足，也可以向消費(fèi)者傳遞進(jìn)一步的有益效果。如本文所應(yīng)用，“氨基酸序列”和術(shù)語(yǔ)“多肽”和/或術(shù)語(yǔ)“蛋白質(zhì)”同義。在一些情況下，術(shù)語(yǔ)“氨基酸序列”和術(shù)語(yǔ)“肽”同義。在一些情況下，術(shù)語(yǔ)“氨基酸序列”和術(shù)語(yǔ)“酶”同義。如本文所應(yīng)用，“類肽形式”(peptoidform)是指變異的氨基酸殘基，其中a-碳取代基是在殘基的氮原子上而不是在a-碳上。制備類肽衍生物形式的肽的方法在本領(lǐng)域中是已知的，例如，SimonRJetal.，PNAS(1992)89(20)，9367-9371和HorwellDC,TrendsBiotechnol.(1995)13(4)，132-134。如本文所應(yīng)用，“核苷酸序列”或“核酸序列”是指寡核苷酸序列或多核苷酸序列，及其變異體，同源物，片段和衍生物(如其部分)。核苷酸序列可以是基因組來源或合成來源或重組來源，其可以是雙鏈或單鏈，不論代表正義鏈或反義鏈。如此處所應(yīng)用，術(shù)語(yǔ)核苷酸序列包括基因組DNA、cDNA、合成的DNA和RNA。優(yōu)選地，它是指DNA，更優(yōu)選地，是編碼PS4變異多肽的cDNA序列。如本文所應(yīng)用，“淀粉”是指淀粉本身或其組分，特別是支鏈淀粉。術(shù)語(yǔ)“淀粉介質(zhì)”(starchmedium)是指包括淀粉的任何合適的介質(zhì)。術(shù)語(yǔ)“淀粉產(chǎn)物”(starchproduct)是指包含淀粉或基于淀粉或來自淀粉的任何產(chǎn)物。優(yōu)選地，淀粉產(chǎn)物包含或基于或來自從小麥粉得到的淀粉。如本文所應(yīng)用，“面粉”是指小麥或其它谷物的細(xì)磨粉末(finely-groundmeal)。例如，面粉可以從小麥本身而不是從其它谷物得到。小麥粉一般指小麥粉本身以及存在于介質(zhì)如面團(tuán)中的小麥粉。如本文所應(yīng)用，“烘焙的含淀粉的面包產(chǎn)品”(bakedfarinaceousbreadproduct)是指基于面團(tuán)的任何烘焙產(chǎn)品，所述面團(tuán)可以在形成面團(tuán)的條件下，通過混合面粉、水和發(fā)酵劑得到。可以向面團(tuán)混合物中加入其它的成分。如本文所應(yīng)用，“同源物”(homologue)和“同源”(homology)是指這樣的實(shí)體,它和目標(biāo)氨基酸序列(subjectaminoacidsequence)和目標(biāo)核苷酸序列有一定程度的同一性(identity)。同源序列被認(rèn)為包括與目標(biāo)序列有至少75%、80%、85%或90%同一性的氨基酸序列，優(yōu)選地有至少95%、96%、97%、98%或99%是同一的。典型地，同源物將包括和目標(biāo)氨基酸序列相同的活性位點(diǎn)。如本文所應(yīng)用，“雜交”將包括核酸鏈通過堿基配對(duì)與互補(bǔ)鏈結(jié)合的過程以及如在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)中進(jìn)行的擴(kuò)增過程。PS4核酸可以作為單鏈或雙鏈DNA或RNA、RNA/DNA異源雙鏈或RNA/DNA共聚物而存在。如本文所應(yīng)用，“共聚物”(copolymer)是指這樣的單條核酸鏈，其包括核糖核苷酸和脫氧核糖核苷酸。PS4核酸甚至可以是被密碼子最優(yōu)化以進(jìn)一步增加表達(dá)。如本文所應(yīng)用，“合成的”是指通過體外化學(xué)合成或酶合成產(chǎn)生的物質(zhì)。它包括但不限于由宿主生物體如甲基營(yíng)養(yǎng)酵母畢赤酵母和漢遜酵母的最佳密碼子使用而生成的PS4核酸。如本文所應(yīng)用，“轉(zhuǎn)化的細(xì)胞”包括應(yīng)用重組DNA技術(shù)被轉(zhuǎn)化了的細(xì)胞。轉(zhuǎn)化通常通過向細(xì)胞內(nèi)插入一個(gè)或多個(gè)核苷酸序列而發(fā)生。插入的核苷酸序列可以是異源核苷酸序列(即，該序列對(duì)于欲被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞不是天然的)。此外，或替代地，插入的核苷酸序列可以是同源核苷酸序列(即，該序列對(duì)于欲被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞是天然的)。由此細(xì)胞接受一個(gè)或多個(gè)額外的核苷酸序列拷貝，所述序列已存在于細(xì)胞內(nèi)。如本文所應(yīng)用可操作地連接的”(operablylinked)是指,所描述的組分處于一種關(guān)聯(lián)中，所述關(guān)聯(lián)允許它們以其所期望的方式起作用?？刹僮鞯剡B接于編碼序列的調(diào)節(jié)序列以這樣的方式被連接在和該調(diào)控序列相容的條件下，編碼序列的表達(dá)被實(shí)現(xiàn)。如本文所應(yīng)用生物學(xué)上有活性”(biologicallyactive)是指這樣的序列，它和天然發(fā)生的序列具有相似的結(jié)構(gòu)功能(但是不一定是相同的程度)，和/或相似的調(diào)節(jié)功能(但是不一定是相同的程度)，和/或相似的生物化學(xué)功能(但是不一定是相同的程度)。I.對(duì)本發(fā)明多肽的詳述在第一方面，本發(fā)明通提供了包括PS4變異體的多肽，PS4變異體來自親代多肽。親代酶可以優(yōu)選地是非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶，優(yōu)選地是細(xì)菌非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶。親代酶可以優(yōu)選地是顯示出非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶活性的多肽。親代酶可以是嗜糖假單胞菌非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶，如SEQIDNO:1或SEQIDNO5列出的外切淀粉酶。親代酶可以是施氏假單胞菌非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶，如SEQIDN0:7或SEQIDNO:11列出的多肽。PS4家族的其它成員可以被用作親代酶，如下面的表I所列出。優(yōu)選地，PS4家族成員將通常地和SEQIDNOUSEQIDNO:5、SEQIDNO:7或SEQIDNO:11列出的外切淀粉酶相似、同源或功能上等價(jià)，并可以用標(biāo)準(zhǔn)方法鑒定，如用探針對(duì)合適的文庫(kù)進(jìn)行雜交篩選，或用基因組測(cè)序分析。鑒定方法如下列出。權(quán)利要求1.具有淀粉酶活性的非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶，其選自以下組成的組(a)包含序列表SEQIDNO:15列出的氨基酸序列的具有淀粉酶活性的非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶；和(b)在(a)的氨基酸序列中經(jīng)過取代、缺失或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸的由(a)的非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶衍生的具有淀粉酶活性的非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶；其中與親本多肽或野生型多肽相比，所述非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶具有更高的熱穩(wěn)定性。2.具有淀粉酶活性的非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶，其選自以下組成的組(a)包含序列表SEQIDNO:15列出的氨基酸序列的具有淀粉酶活性的非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶；和(b)由以下核苷酸序列編碼的具有淀粉酶活性的非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶，其中所述核苷酸序列與能夠在嚴(yán)格條件(例如50°C和0.2xSSC{lxSSC=0.15MNaCl，0.015M檸檬酸三鈉pH7.0})下與編碼序列表SEQIDNO:15所示非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶的核苷酸序列雜交的核苷酸序列互補(bǔ)；其中與親本多肽或野生型多肽相比，所述非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶具有更高的熱穩(wěn)定性。3.非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶，(a)其中，所述非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶包含與SEQIDNos:24或1315之一至少90%是相同的氨基酸序列，并且包含157位點(diǎn)的取代，其中對(duì)位置所進(jìn)行的編號(hào)是參照SEQIDNO:I列出的嗜糖假單胞菌序列，且所述氨基酸序列具有157位點(diǎn)的I157L取代，并且其中與由SEQIDNO:1列出的氨基酸序列組成的親本多肽相比，所述非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶具有更高的熱穩(wěn)定性；或(b)其中，所述非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶包含與SEQIDNos810之一至少90%是相同的氨基酸序列，并且包含157位點(diǎn)的取代，其中對(duì)位置所進(jìn)行的編號(hào)是參照SEQIDN0:1列出的嗜糖假單胞菌序列，且所述氨基酸序列具有157位點(diǎn)的I157L取代，并且其中與由SEQIDNO7列出的氨基酸序列組成的親本多肽相比，所述非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶具有更高的熱穩(wěn)定性。4.如權(quán)利要求I或2所述的非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶，其中所述非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶(b)具有157位點(diǎn)的氨基酸取代，其中對(duì)位置所進(jìn)行的編號(hào)是參照SEQIDNO:1列出的嗜糖假單胞菌序列。5.如權(quán)利要求I或2所述的非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶，其中所述非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶(b)的157位氨基酸被L取代，其中對(duì)位置所進(jìn)行的編號(hào)是參照SEQIDNO1列出的嗜糖假單胞菌序列。6.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的外切淀粉酶，其還包含選自以下的至少ー個(gè)取代G4D、N33Y、D34N、G70D、K71R、G87S、A99V、K108R、V113I、G121D、G134R、A141P、G158D、Y171S、L178F、A179T、G188A、Y198F、A199V、G223A、V290I、H307L、I315V、S334P、D343E、S399P、A405F和A405E。7.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的外切淀粉酶，其還包括至少ー個(gè)另外的取代，位置選自:33、34、71、87、121、134、141、178、179、223、307、334和343。8.權(quán)利要求7所述的外切淀粉酶，其中所述至少ー個(gè)另外的取代選自N33Y、D34N、K71R、G87S、G121D、G134R、A141P、L178F、A179T、G223A、H307L、S334P和D343E。9.權(quán)利要求7所述的外切淀粉酶，其進(jìn)ー步包括至少ー個(gè)另外的取代，位置選自108、158,171和188。10.權(quán)利要求9所述的外切淀粉酶，其中所述至少ー個(gè)另外的取代選自K108R、G158D、Y171S和G188A。11.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的外切淀粉酶，其包含選自以下取代的組合G134R,A141P,I157L,G223A,H307L,S334P,D343E,G121D；G134R,A141P,I157L,G223A,H307L,S334P,D343E,N33Y,G121D；G134R,A141P,I157L,G223A,H307L,S334P,D343E,N33Y；G134R,A141P,I157L,G223A,H307L,S334P,D343E,N33Y,D34N,K71R,L178F,A179T,G87S,G121D,S214N,T375A；G134R,A141P,I157L,G223A,H307L,S334P,D343E,N33Y,D34N,K71R,L178F,A179T,G121D,Y171S,G188A,N138D；G134R,A141P,I157L,G223A,H307L,S334P,D343E,N33Y,D34N,K71R,L178F,A179T,G121D；G87S,G121D,G134R,A141P,I157L,G223A,H307L,S334P,D343E,N33Y,D34N,K71R,L178F,A179T；G87S,G121D,G134R,A141P,I157L,G223A,H307L,S334P,D343E,N33Y,D34N,K71R,L178F,A179T,G188A；G134R,A141P,I157L,G223A,H307L,S334P,K71R,L178F,A179T；G134R,A141P,I157L,G223A,H307L,S334P,L178F,A179T；G134R,A141P,I157L,G223A,H307L,S334P,N33Y,D34N,L178F,A179T；G134R,A141P,I157L,G223A,H307L,S334P,L178F,A179T,G87S,G121D；G134R,A141P,I157L,G223A,H307L,S334P,L178F,A179T,G121D；G134R,A141P,I157L,G223A,H307L,S334P,D343E,N33Y,D34N,K71R,L178F,A179T,G121D,E343D；G87S,G121D,G134R,A141P,I157L,G223A,H307L,S334P,D343E,N33Y,D34N,K71R,L178F,A179T；G87S,G121D,G134R,A141P,I157L,G223A,H307L,S334P,D343E,N33Y,D34N,K71R,L178F,A179T,Y33N,N34D,E343D；G134R,A141P,I157L,G223A,H307L,S334P,D343E,N33Y,D34N,K71R,L178F,A179T,G121D；G134R,A141P,I157L,G223A,H307L,S334P,K71R,L178F,A179T,G121D；G87S,V113I,G134R,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E；113F,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E；A99V,V113I,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E；V113I,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E；V113I,G134R,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E；A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E；A199V,D343E,V113I,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P；V113I,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,S334P,D343E；V113I,G121D,G134R,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E；V113I,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E；V113I,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I；V113I,G134R,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E；V113I,G134R,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,I315V,S334P,D343E；D34N,V113I,G134R,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E；V113I,G134R,A141P,I157L,G188S,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E；K71R,V113I,G134R,A141P,I157L,L178L,Y198F,G223A,V290I,H307L,G313G,S334P,D343E；D34N,V113I,G134R,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,G313G,S334P,D343E；V113I,G134R,A141P,I157L,A179V,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E；V113I，G134R，A141P,I157L,11701，Y198F，G223A,V290I，H307L，G313G,S334P,D343E；V113I，G134R，A141P,I157L,A179V,Y198F,G223A,V290I，H307L，G313G,S334P,D343E；G87S,V113I,G134R,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E；V113I,G134R,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E,A405E；V113I,G134R,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E,A405V；A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E；V113I,G134R,A141P,I157L,Y198L,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E；V113I,G134R,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E；K71R,V113I,G134R,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E；K108R,V113I,G134R,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E；D34G,V113I,G134R,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E；G4D,V113I,A141P,I157L,Y198F,G223A,V290I,H307L,S334P,D343E；A141P,G134R,G223A,H307L,I157L,V113I,V290I,Y198F和G188A；G134R,A141P,I157L,G223A,H307L和S334P；G121D,G134R,A141P,I157L,G223A,H307L和S334P；G87S,G121D,G134R,A141P,I157L,G223A,H307L和S334P；N33Y,D34N,G121D,G134R,A141P,I157L,L178F,A179T,G223A,H307L和S334P;和N33Y,D34N,G87S,G121D,G134R,A141P,I157L,L178F,A179T,G223A,H307L和S334P。12.如權(quán)利要求I5中任一項(xiàng)所述的外切淀粉酶，其中所述淀粉酶包括選自SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:8、SEQIDNO9和SEQIDNO10的氨基酸序列。13.如前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶，其中所述外切淀粉酶具有選自下列的ー個(gè)或多個(gè)位置:4、33、34、70、71、87、99、108、113、121、134、141、157、158、171、178、179、188、198、199、223、290、307、315、334、343、399和405的氨基酸取代，其中位置編號(hào)是參照SEQIDNO1列出的嗜糖假單胞菌序列。14.如權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)所述的非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶，其缺乏存在于非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶中的一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)域。15.如權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)所述的非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶，其缺乏淀粉結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述淀粉結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)?yīng)于429位之后的氨基酸，其中的位置編號(hào)是參照SEQIDNOI列出的嗜糖假單胞菌序列。16.一種制備食物產(chǎn)品的方法，其包括(a)提供淀粉介質(zhì)；(b)向所述淀粉介質(zhì)中加入權(quán)利要求I15中任一項(xiàng)所述的外切淀粉酶。17.ー種食物產(chǎn)品，其由權(quán)利要求16所述的方法制備。18.—種非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶,其用于權(quán)利要求16所述的方法。19.一種制備面包產(chǎn)品的方法，包括(a)提供淀粉介質(zhì)；(b)向所述淀粉介質(zhì)加入權(quán)利要求I15中任一項(xiàng)所述的外切淀粉酶；和(c)在步驟(b)期間或之后向所述淀粉介質(zhì)施加熱，以產(chǎn)生面包產(chǎn)品。20.ー種面包產(chǎn)品，其由權(quán)利要求19所述的方法制備。21.—種非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶,其用于權(quán)利要求19所述的方法。22.—種延遲或阻止或減慢食物產(chǎn)品中淀粉的有害退化的方法，其中向面團(tuán)中添加權(quán)利要求I15中任一項(xiàng)所述的非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶、23.ー種食物產(chǎn)品，其由權(quán)利要求22所述的方法制備。24.—種非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶,其用于權(quán)利要求22所述的方法。25.權(quán)利要求I15、18、21或24所述的非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶用于增加烘焙產(chǎn)品的體積的應(yīng)用。26.權(quán)利要求I15、18、21或24所述的非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶用于食物產(chǎn)品以延遲或阻止或減慢淀粉的有害退化的應(yīng)用。27.如權(quán)利要求I15、18、21或24所述的非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶，其中在從55°C至95°C或更高的高溫下，所述非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶的半衰期相對(duì)于親代酶延長(zhǎng)10%或更多，延長(zhǎng)50%或更多，或延長(zhǎng)100%或更多。28.如權(quán)利要求27所述的非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶，其中高溫為80°C。29.如權(quán)利要求I15、18、21或24中任一項(xiàng)所述的非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶，其與親本多肽相比具有更高的PH穩(wěn)定性。30.如權(quán)利要求I15、18、21或24中任一項(xiàng)所述的非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶，其中在相同的PH條件下，與其親代多肽相比較時(shí)，所述非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶具有多出10%或更長(zhǎng)，多出50%或更長(zhǎng)，或多出100%或更長(zhǎng)的半衰期。31.如權(quán)利要求I15、18、21或24中任一項(xiàng)所述的非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶，其中與其親代酶相比較，所述非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶具有更高的外切特異性。32.如權(quán)利要求I15、18、21或24中任一項(xiàng)所述的非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶，其中在相同條件下，與其親代多肽相比較，所述非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶具有高出10%或更高，高出50%或更高，或高出100%或更高的外切特異性指數(shù)。33.核酸，其編碼權(quán)利要求I15、18、21或24中任一項(xiàng)所述的非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶。34.載體，其包含權(quán)利要求33所述的核酸。35.宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求34所述的載體。36.用于制備食品產(chǎn)物的組合物，其包含權(quán)利要求I15、18、21或24中任一項(xiàng)所述的非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶。37.如權(quán)利要求36所述的組合物，其包含另外的成分或另外的酶或兩者。38.如權(quán)利要求37所述的組合物，其中所述另外的酶選自以下組成的組氧化還原酶、水解酶、脂肪酶、酯酶、糖苷酶、淀粉酶、支鏈淀粉酶、木聚糖酶、纖維素酶、半纖維素酶、淀粉降解酶、蛋白酶和脂加氧酶。39.如權(quán)利要求37所述的組合物，其中所述酶是來自桿菌的產(chǎn)麥芽淀粉酶。40.如權(quán)利要求3739中任一項(xiàng)所述的組合物，其中所述非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶是EP120693中公開的來自桿菌的產(chǎn)麥芽a-淀粉酶，或其具有a-淀粉酶活性的變異體、同源物或突變體，或具有所述產(chǎn)麥芽a-淀粉酶或其具有a-淀粉酶活性的變異體、同源物或突變體的組合物。41.權(quán)利要求I15、18、21或24中任一項(xiàng)所述的非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶在制備食物產(chǎn)品或作為食品成分中的應(yīng)用。42.如權(quán)利要求41所述的應(yīng)用，其中所述食物產(chǎn)品包括面團(tuán)產(chǎn)品。43.如權(quán)利要求41或42所述的應(yīng)用，其中所述食物產(chǎn)品包括煎的、油炸的、烤的、烘焙的、蒸的和煮的面團(tuán)產(chǎn)品。44.如權(quán)利要求41所述的應(yīng)用，其中所述食物產(chǎn)品包括烘焙產(chǎn)品。45.面團(tuán)改良組合物，其包含權(quán)利要求I15、18、21或24中任一項(xiàng)所述的非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶和至少ー種其他面團(tuán)成分或面團(tuán)添加剤。46.—種表達(dá)權(quán)利要求I15、18、21或24中任一項(xiàng)所述的非產(chǎn)麥芽外切淀粉酶的方法,所述方法包括將權(quán)利要求34所述的載體導(dǎo)入相容性宿主細(xì)胞，并使所述宿主細(xì)胞在載體可復(fù)制的條件下生長(zhǎng)。全文摘要本發(fā)明涉及淀粉酶多肽和編碼所述多肽的核酸及其用途。本發(fā)明的淀粉酶被設(shè)計(jì)為具有更多的有益性質(zhì)。具體來說，本發(fā)明的淀粉酶顯示了改變的外切特異性。文檔編號(hào)C12N15/74GK102796717SQ201210244518公開日2012年11月28日申請(qǐng)日期2004年7月7日優(yōu)先權(quán)日2003年7月7日發(fā)明者C·T·貝爾格,K·博伊森,P·M·F·德克斯,C·費(fèi)奧雷西,G·赫里茲,K·M·克拉,W·劉,A·肖,C·R·索達(dá)爾申請(qǐng)人:金克克國(guó)際有限公司,杜邦營(yíng)養(yǎng)生物科學(xué)有限公司