專利名稱：一種端基為熒光基團(tuán)芘的水溶性陽(yáng)離子聚電解質(zhì)及其制備方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種熒光高分子聚合物及其制備方法，尤其涉及一種端基為熒光基團(tuán)芘的水溶性陽(yáng)離子聚電解質(zhì)及制備方法，并通過(guò)與DNA相互作用后的熒光性能變化實(shí)現(xiàn)對(duì)核酸分子堿基序列結(jié)構(gòu)的高效、穩(wěn)定、特異性識(shí)別，屬于功能高分子，材料及熒光傳感等技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
核酸分子堿基序列的定量分析和特異識(shí)別對(duì)生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展具有重要意義。 核酸的檢測(cè)方法多種多樣，其中，熒光檢測(cè)系統(tǒng)因其選擇性好、靈敏度高而被廣泛應(yīng)用。特別是熒光高分子在檢測(cè)生物大分子方面的研究已引起國(guó)內(nèi)外科學(xué)工作者的密切關(guān)注。芘由于能通過(guò)多種方式進(jìn)行化學(xué)修飾，熒光量子產(chǎn)率較高以及其熒光強(qiáng)度受環(huán)境因素如溶劑，核酸堿基等影響較大而被廣泛應(yīng)用到核酸檢測(cè)中。熒光基團(tuán)芘以共價(jià)鍵連接的核酸分子探針由于其在與堿基序列互補(bǔ)的核酸分子雜化形成復(fù)鏈后熒光性能發(fā)生改變而被用于熒光探針特異性識(shí)別核酸分子。同時(shí)它也能克服一些小分子熒光染料如吖啶、菲啶類染料和菁類染料對(duì)核酸分子的序列不能特異識(shí)別的不足。比利時(shí)魯汶大學(xué)研究人員設(shè)計(jì)合成了一類新型熒光探針，芘修飾的以HNA、RNA和DNA為骨架的寡核苷酸熒光探針，探針?lè)肿优c靶向分子雜化后，芘的單體態(tài)熒光(380nm)大大增強(qiáng)而激基復(fù)合物熒光(480nm)消失 (ChemBioChem. 2009, 10, 1175-1185)。美國(guó)Hrdlicka教授等研發(fā)的芘修飾的寡核苷酸熒光探針，可通過(guò)雜化誘導(dǎo)熒光增強(qiáng)和特異性鳥苷酸熒光淬滅機(jī)制有效地來(lái)識(shí)別單核苷酸多態(tài)性(Chem. Commun. 2010, 46，4929-4931)。日本 Yamana 等合成了一種芘修飾的 RNA 和 DNA 熒光探針，發(fā)現(xiàn)RNA探針在與靶向RNA雜化后熒光大大增強(qiáng)，而DNA熒光探針在與靶向DNA雜化后熒光并未有明顯的變化(Nucleic Acids Res. 2005，33，5887-5895)。還有一類發(fā)夾式熒光探針，其分子具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)，熒光功能基團(tuán)A和B位于探針?lè)肿拥膬啥耍窗l(fā)夾結(jié)構(gòu)分子的莖部。美國(guó)佛羅里達(dá)大學(xué)的Tan等對(duì)發(fā)夾式分子信標(biāo)檢測(cè)DNA/RNA核酸分子進(jìn)行了廣 泛深入研究。但是這些標(biāo)記型熒光探針需要將熒光基團(tuán)通過(guò)共價(jià)鍵連結(jié)到寡聚核酸分子鏈上以實(shí)現(xiàn)特異性識(shí)別核酸分子，其中的合成與操作較繁雜，花費(fèi)較高。
近年來(lái)，共軛聚電解質(zhì)作為熒光探針檢測(cè)蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子的研究倍受青睞。這種共軛聚電解質(zhì)可與生物大分子形成靜電組裝體，通過(guò)熒光共振能量轉(zhuǎn)移或電子轉(zhuǎn)移等機(jī)制使其熒光性能改變，進(jìn)而對(duì)生物大分子進(jìn)行檢測(cè)。加州大學(xué)的Bazan教授，中國(guó)科學(xué)院化學(xué)研究所，中國(guó)科學(xué)院長(zhǎng)春應(yīng)用化學(xué)研究所的研究人員對(duì)共軛聚電解質(zhì)熒光檢測(cè)生物大分子進(jìn)行了深入研究，取得了重要科研成果。Bazan等利用堿基序列互補(bǔ)的DNA核酸分子與固定在基片上的電中性肽核酸靶向雜化形成復(fù)鏈，陽(yáng)離子共軛聚電解質(zhì)通過(guò)靜電吸附連結(jié)到核酸復(fù)鏈，從而使基片顯示共軛聚電解質(zhì)的熒光(Chem. Commun. 2004，2508-2509)。這種技術(shù)為無(wú)標(biāo)記熒光探針特異性識(shí)別核酸分子開辟了新的研究方向。但這項(xiàng)技術(shù)的制備較復(fù)雜，且被固定的肽核酸是單分子膜，會(huì)限制雜化復(fù)鏈吸附熒光聚電解質(zhì)的數(shù)量，從而使檢測(cè)的熒光強(qiáng)度受限
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種端基為熒光基團(tuán)芘的水溶性陽(yáng)離子聚電解質(zhì)，其結(jié)構(gòu)通式如下
權(quán)利要求
1.一種端基為熒光基團(tuán)芘的水溶性陽(yáng)離子聚電解質(zhì)的制備方法，所述的方法步驟包括 (1)合成原子轉(zhuǎn)移自由基聚合引發(fā)劑的溴代反應(yīng) 將芘甲醇溶于干燥THF和三乙胺，并置于反應(yīng)容器中，冰水浴中冷卻到0-5攝氏度；逐滴加入1-2當(dāng)量的2-溴-異丁酰溴和四氫呋喃的混合溶液，在室溫下回流反應(yīng)8個(gè)小時(shí)；反應(yīng)完成后，兩次抽濾掉不溶物溴胺鹽，旋蒸除去大部分的四氫呋喃溶劑，剩余物質(zhì)用二氯甲烷稀釋，并用飽和碳酸鉀溶液萃取，有機(jī)相通過(guò)無(wú)水硫酸鎂干燥過(guò)濾后旋蒸得到粗產(chǎn)物，用無(wú)水甲醇重結(jié)晶，真空干燥得淡黃色固體； (2)采用原子轉(zhuǎn)移自由基聚合制備端基為熒光基團(tuán)芘的聚(甲基)丙烯酸二甲氨乙酯 將步驟(I)中得到的原子轉(zhuǎn)移自由基聚合引發(fā)劑置于四氫呋喃溶劑中；再加入催化齊U，配位劑，聚合單體，在70攝氏度下進(jìn)行原子轉(zhuǎn)移自由基聚合1. 5小時(shí)，用中性氧化鋁柱層析提純，旋蒸除去溶劑，并用冷正己烷沉淀，真空干燥得白色固體； (3)端基為熒光基團(tuán)芘的聚(甲基)丙烯酸二甲氨乙酯的季銨鹽反應(yīng) 將步驟(2)中得到的端基為芘熒光基團(tuán)的聚(甲基)丙烯酸二甲氨乙酯置于乙醇溶劑中，逐滴加入6當(dāng)量的季胺化小分子,在85攝氏度下回流反應(yīng)24個(gè)小時(shí)；用四氫呋喃沉淀出產(chǎn)物，并索氏提取12個(gè)小時(shí)，四氫呋喃作提取劑，真空干燥得白色固體。
2.按照權(quán)利要求1所述端基為芘熒光基團(tuán)的新型水溶性陽(yáng)離子聚電解質(zhì)的制備方法，其特征在于所述步驟(2)中，所用的聚合單體為丙烯酸芘甲酯、甲基丙烯酸二甲氨基乙酯或它們的任意混合物。
3.按照權(quán)利要求1所述端基為芘熒光基團(tuán)的新型水溶性陽(yáng)離子聚電解質(zhì)的制備方法，其特征在于所述步驟(2)中，聚合所用的催化劑為氯化亞銅、溴化亞銅或是碘化亞銅；所用的配位劑為1，1,4, 7，10，10-六甲基三亞乙基四胺或是N，N，N，N，N-五甲基二亞乙基三胺。
4.按照權(quán)利要求1所述端基為芘熒光基團(tuán)的新型水溶性陽(yáng)離子聚電解質(zhì)的制備方法，其特征在于所述步驟(3)中，所用的季胺化小分子為鹵代烷烴包括溴代丁烷、碘甲烷。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法制備的一種端基為熒光基團(tuán)芘的水溶性陽(yáng)離子聚電解質(zhì)，其結(jié)構(gòu)通式如下
6.利用權(quán)利要求5所述的端基為芘熒光基團(tuán)的新型水溶性陽(yáng)離子聚電解質(zhì)的特異性識(shí)別核酸分子堿基序列結(jié)構(gòu)的應(yīng)用方法，所述方法步驟如下 (I)用磷酸鹽緩沖溶液將端基為熒光基團(tuán)芘的水溶性陽(yáng)離子聚電解質(zhì)配置成ιοΛιο /L的稀溶液； (2)將冷凍儲(chǔ)存的不同種類的DNA引物離心后溶解在適量磷酸鹽緩沖溶液配置成DNA稀溶液。所述的DNA引物種類及堿基序列如下 DNAl—發(fā)夾結(jié)構(gòu) DNAO^CA CAA ACA AGT AGA ATG TAT GTG C)； DNA2—與 DNA I 互補(bǔ)的直鏈 DNA (GCA CAT ACA TTC TAC TTG)； DNA3—與 DNA 2 互補(bǔ)的直鏈 DNA (GCA CAT ACA TTC TAC TTG)； DNAa—堿基全是 A 的直鏈 DNA (AAA AAA AAA AAA AAA AAA)； DNAc—堿基全是 C 的直鏈 DNA (CCC CCC CCC CCC CCC CCC)； DNAt—堿基全是 T 的直鏈 DNA (TTT TTT TTT TTT TTT TTT)； (3)取適量聚電解質(zhì)溶液、適量不同類型的DNA引物溶液和磷酸鹽緩沖液混配成樣品溶液。所述的樣品溶液可分為兩個(gè)系列 系列a (聚電解質(zhì)和發(fā)夾結(jié)構(gòu)DNA)聚電解質(zhì)、聚電解質(zhì)+DNA1、聚電解質(zhì)+DNA1+DNA2、聚電解質(zhì)+DNAI+DNAa、聚電解質(zhì)+DNAI+DNAc和聚電解質(zhì)+DNAI+DNAt樣品溶液； 系列b (聚電解質(zhì)和直鏈結(jié)構(gòu)DNA)聚電解質(zhì)、聚電解質(zhì)+DNA2、聚電解質(zhì)+DNA2+DNA3、聚電解質(zhì)+DNA2+DNAa、聚電解質(zhì)+DNA2+DNAc和聚電解質(zhì)+DNA2+DNAt樣品溶液； (4)對(duì)樣品溶液進(jìn)行加熱處理80攝氏度下加熱10分鐘后自然冷卻到室溫，測(cè)定樣品溶液的熒光發(fā)射光譜。根據(jù)熒光強(qiáng)度變化來(lái)識(shí)別靶向DNA的堿基序列。其中所用到的狹縫寬度是2. 5nm，激發(fā)波長(zhǎng)是344nm ； (5)將DNAl和DNA2互補(bǔ)的DNA雙鏈溶液1、DNA2和DNA3互補(bǔ)的DNA雙鏈溶液2和聚電解質(zhì)分別與DNAl和DNA2互補(bǔ)的DNA雙鏈及DNA2和DNA3互補(bǔ)的DNA雙鏈混配得到混合溶液3和4進(jìn)行如步驟(4)所屬的加熱處理，然后測(cè)定4種溶液的圓二色譜； (6)向步驟(3)混配得到的系列a和系列b樣品溶液中分別加入適量碘化鉀溶液，并在波長(zhǎng)為344nm的光激發(fā)下，測(cè)得各混合溶液的熒光發(fā)射光譜，得到不同樣品溶液的熒光淬滅效率。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種熒光高分子聚合物及其制備方法，尤其涉及一種端基為熒光基團(tuán)芘的水溶性陽(yáng)離子聚電解質(zhì)及制備方法，并應(yīng)用于檢測(cè)核酸分子堿基序列。這種端基為熒光基團(tuán)芘的水溶性陽(yáng)離子聚電解質(zhì)和單鏈寡聚核酸分子(發(fā)夾結(jié)構(gòu)DNA和直鏈結(jié)構(gòu)DNA)之間的靜電吸附和疏水作用使其形成一個(gè)新型復(fù)鏈熒光探針。當(dāng)遇到與之堿基序列結(jié)構(gòu)互補(bǔ)的核酸分子時(shí)，通過(guò)Watson-Crick堿基配對(duì)原則雜化，由于端基熒光基團(tuán)芘插入DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中，使得堿基對(duì)芘熒光的淬滅能力增強(qiáng)，導(dǎo)致其熒光強(qiáng)度相比于與非靶向核酸分子作用顯著降低；從而通過(guò)芘熒光聚電解質(zhì)的熒光性能差異實(shí)現(xiàn)對(duì)核酸分子堿基序列結(jié)構(gòu)的特異性識(shí)別。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103012639SQ201210245819
公開日2013年4月3日 申請(qǐng)日期2012年7月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月16日
發(fā)明者王國(guó)杰, 趙敏, 楊領(lǐng)葉, 張瑞辰 申請(qǐng)人:北京科技大學(xué)