專利名稱：一種高表達(dá)安絲菌素p-3的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種從珍貴橙色束絲放線菌制備安絲菌素P-3的方法。
背景技術(shù)：
安絲菌素(Ansamitocin)是一種微管蛋白抑制劑。它通過(guò)與微管蛋白的結(jié)合從而拮抗微管蛋白組裝，其作用位點(diǎn)與長(zhǎng)春花堿相同。他的細(xì)胞毒性傳統(tǒng)化療藥物長(zhǎng)春新堿、甲氨蝶呤和柔紅霉素的100-1000倍。安絲菌素的母核是大環(huán)內(nèi)酯類美登醇，其同系物包括植物來(lái)源的美登素和美登普林等。已發(fā)現(xiàn)幾種放線菌可以表達(dá)安絲菌素，包括珍貴橙色束絲放線菌，主要產(chǎn)物為6 種安絲菌素同系物，包括安絲菌素P-0、P-l、P-2、P-3、P-3’、P-4、P-4’，結(jié)構(gòu)如下式所示
權(quán)利要求
1.一種珍貴橙色束絲放線菌發(fā)酵產(chǎn)生安絲菌素P-3的方法，包括如下步驟 用珍貴橙色束絲放線菌CPCC 260982在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，液體發(fā)酵培養(yǎng)基中含有2-10%的碳源、1-5%的氮源和0. 1-2%的短鏈脂肪醇；發(fā)酵過(guò)程的pH值為6. 5-7. 5 ;溫度為26-30 0C ;溶氧控制20%以上； 所述的碳源選自葡萄糖、果糖、淀粉、蔗糖、麥芽糖、麥芽提取物或甘油中的一種或兩種以上； 所述的氮源選自蛋白胨、牛肉湯、酵母提取物、KNO3、大豆粉、大豆胨、玉米漿、棉籽餅粉或棉籽餅浸出粉中的一種或兩種以上； 所述的短鏈脂肪醇選自正丙醇、異丙醇、正丁醇或異丁醇。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種珍貴橙色束絲放線菌發(fā)酵產(chǎn)生安絲菌素P-3的方法，其、特征在于所述的在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件是通氣浸沒(méi)培養(yǎng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種珍貴橙色束絲放線菌發(fā)酵產(chǎn)生安絲菌素P-3的方法，其特征在于pH值為7.0。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種珍貴橙色束絲放線菌發(fā)酵產(chǎn)生安絲菌素P-3的方法，其特征在于溫度為28°C。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種珍貴橙色束絲放線菌發(fā)酵產(chǎn)生安絲菌素P-3的方法，其特征在于溶氧優(yōu)選控制30%以上。
6.根據(jù)權(quán)利要求I至5任一所述的一種珍貴橙色束絲放線菌發(fā)酵產(chǎn)生安絲菌素P-3的方法，其特征在于所述的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中還含有0. 01-0. 2%的微量元素，所述的微量元素選自CoCl2、FeSO4或MgSO4中的一種或兩種以上。
7.根據(jù)權(quán)利要求I至5任一所述的一種珍貴橙色束絲放線菌發(fā)酵產(chǎn)生安絲菌素P-3的方法，其特征在于所述的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中含有0. 5-1. 5%的酵母提取物、1-5%的可溶性淀粉、0. 5-1. 5%葡萄糖、0. 1-1%的果糖、0. 5-4%的麥芽提取物、0. 5-3%的大豆粉、0. 05-0. 2%的K2HP04、0. 5% 的碳酸鈣、0. 0005-0. 005% 的 FeSO4 7H20、0. 01-0. 1% 的 MgSO4 .7H20、0. 1-2% 的異丁醇、0. 005-0. 05%的酪氨酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求I至5任一所述的一種珍貴橙色束絲放線菌發(fā)酵產(chǎn)生安絲菌素P-3的方法，其特征在于所述的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中含有0. 5%的酵母提取物、2%的可溶性淀粉、0.5%的葡萄糖、0. 5%的果糖、1%的麥芽提取物、2%的大豆粉、0. 05%的K2HP04、0. 5%的碳酸鈣、0. 001% 的 FeSO4 7H20、0. 05% 的 MgSO4 7H20、0. 3% 的異丁醇，pH7. O。
9.根據(jù)權(quán)利要求I至5任一所述的一種珍貴橙色束絲放線菌發(fā)酵產(chǎn)生安絲菌素P-3的方法，其特征在于所述的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中含有0. 5%的酵母提取物、2%的可溶性淀粉、0.5%的葡萄糖、1%的麥芽提取物、1%的大豆粉、0. 05%的K2HP04、0. 5%的碳酸鈣、0. 001%的FeSO4 7H20、0. 05% 的 MgS047H20、0. 3% 的異丁醇、pH7. O。
10.根據(jù)權(quán)利要求I至5任一所述的一種珍貴橙色束絲放線菌發(fā)酵產(chǎn)生安絲菌素P-3的方法，其特征在于該方法，還包括如下步驟 發(fā)酵前培養(yǎng)配制種子培養(yǎng)基，采用甘油融化接種于種子培養(yǎng)基并進(jìn)行培養(yǎng)操作，獲得一級(jí)種子，經(jīng)二次培養(yǎng)得到二級(jí)種子，二級(jí)種子接種到液體發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵； 所述的種子培養(yǎng)基的組分及重量百分比為甘油1%;葡萄糖1%;蛋白胨1%;酵母提取物 0. 5% ；pH 7. 2 ；所述的甘油融化接種是指_70°C保存的甘油種經(jīng)融化后接種于種子培養(yǎng)基； 所述的培養(yǎng)操作是指在26-32°C環(huán)境下培養(yǎng)24-72h ； 所述的二次培養(yǎng)是指取一級(jí)種子按0. 5-3. 0%的接種量接種于種子培養(yǎng)基并進(jìn)行培養(yǎng)操作。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的一種珍貴橙色束絲放線菌發(fā)酵產(chǎn)生安絲菌素P-3的方法，其特征在于當(dāng)二級(jí)接種后培養(yǎng)24h至48h后補(bǔ)加葡萄糖、蛋白質(zhì)類營(yíng)養(yǎng)物、醇類或醛類，直至發(fā)酵結(jié)束。
12.根據(jù)權(quán)利要求I至5任一所述的一種珍貴橙色束絲放線菌發(fā)酵產(chǎn)生安絲菌素P-3的方法，其特征在于珍貴橙色束絲放線菌以2-5%的菌密度接種到所述的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中。
13.根據(jù)權(quán)利要求I至5任一所述的一種珍貴橙色束絲放線菌發(fā)酵產(chǎn)生安絲菌素P-3的方法，其特征在于該方法，還包括如下步驟 從發(fā)酵液中純化安絲菌素P-3 :體積比為1:1 3:1的乙酸乙酯和乙酸丁酯混合對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行萃取，萃取比例為1: 1，濃縮萃取安絲菌素的有機(jī)溶劑層，重結(jié)晶，用硅膠或氧化鋁吸附層析后蒸餾得到安絲菌素P-3。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種高表達(dá)安絲菌素P-3的方法，屬于微生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域。通過(guò)珍貴橙色束絲放線菌表達(dá)的安絲菌素總量一般在10-50mg/L，AP-3一般占比不到50%。本發(fā)明的目的在于提供一種珍貴橙色束絲放線菌發(fā)酵產(chǎn)生安絲菌素的方法，該方法可以高表達(dá)安絲菌素P-3。本發(fā)明通過(guò)合理的發(fā)酵培養(yǎng)基成分的配比、發(fā)酵溫度、溶氧和pH的控制實(shí)現(xiàn)安絲菌素的高表達(dá)和單一成分安絲菌素P-3占比的提升，使安絲菌素P-3的表達(dá)量達(dá)到100mg/L以上，其中安絲菌素P-3占全部安絲菌素比例在70%以上。
文檔編號(hào)C12R1/01GK102732581SQ20121024940
公開(kāi)日2012年10月17日 申請(qǐng)日期2012年7月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月18日
發(fā)明者劉彥君, 王群 申請(qǐng)人:上海交聯(lián)藥物研發(fā)有限公司, 蘇州康聚生物科技有限公司