Hnf1b基因突變檢測特異性引物和液相芯片的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種HNF1B基因突變檢測液相芯片和特異性引物，該液相芯片主要包括有：每種由5’端的tag序列和3’端針對目的基因突變位點的特異性引物序列組成的ASPE引物，所述特異性引物序列為：針對A12057G位點的SEQ?ID?NO.11及SEQ?ID?NO.12，針對C8941T位點的SEQ?ID?NO.13及SEQ?ID?NO.14，針對G35118A位點的SEQ?ID?NO.15及SEQ?ID?NO.16，針對C3784A位點的SEQ?ID?NO.17及SEQ?ID?NO.18；和/或針對G13582A位點的SEQ?ID?NO.19及SEQ?ID?NO.20；有anti-tag序列包被的微球；擴(kuò)增引物。本發(fā)明所提供的檢測液相芯片的檢測結(jié)果與測序法的吻合率高達(dá)100％，能實現(xiàn)多個突變位點的野生型和突變型單獨和并行檢測。
【專利說明】HNF1B基因突變檢測特異性引物和液相芯片
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)，具體的是涉及一種HNFlB基因突變檢測特異性引物和液相芯片。
【背景技術(shù)】
[0002]肝細(xì)胞核因子I β (hepatocyte nuclear factor I β , HNFI B),也稱轉(zhuǎn)錄因子
2(transcription factor2，TCF2)。該基因位于 17 號染色體 17ql2 上，位于 36046433到36105095堿基對之間。HNFlB基因在腎發(fā)育中發(fā)揮著作用，對胚胎胰腺的發(fā)育有調(diào)節(jié)作用，是對胰腺細(xì)胞形成和維持血糖穩(wěn)態(tài)具有重要作用的轉(zhuǎn)錄因子。目前大量研究表明，HNFlB基因突變將導(dǎo)致腎囊和糖尿病綜合癥，即第五型青少年起病的成年型糖尿病(maturity-onset diabetes of theyoung5, M0DY5),表現(xiàn)為早發(fā)糖尿病、腎臟、胰腺和生殖管等各種組織器官發(fā)育異常。HNFlB基因的突變也會導(dǎo)致非胰島素依賴型糖尿病和11型遺傳前列腺癌的發(fā)生，在其它類型的癌癥中，也發(fā)現(xiàn)了這個基因的表達(dá)發(fā)生了改變。
[0003]目前，HNFlB基因突變檢測方法主要有=Illumina光纖微珠芯片技術(shù)、熒光定量PCR技術(shù)、SNPlex Genotyping System技術(shù)和基質(zhì)輔助激光解析電離時間飛行質(zhì)譜技術(shù)(MALD1-TOF-MS ),雖然Illumina光纖微珠芯片技術(shù)是高靈敏度和精確性的高通量檢測系統(tǒng)，但是自動化程度低，手工操作比較多，難以滿足實際應(yīng)用的需要，熒光定量PCR技術(shù)具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、自動化程度高的特點，但也存在樣品易污染、假陽性率高的缺點，且每次只能檢測一種突變類型，SNPlexTM System技術(shù)對單核苷酸多態(tài)性位點(SNPs)所在序列特異性要求較高，不能隨意地分析所選擇的SNPs，難以應(yīng)用于臨床檢測診斷，而且該方法操作比較復(fù)雜，不能滿足實際應(yīng)用的需要?；|(zhì)輔助激光解析電離時間飛行質(zhì)譜技術(shù)是一種軟電離技術(shù)，在蛋白質(zhì)等生物大分子的檢測中有著強(qiáng)大而成熟的功能，但是在核酸檢測領(lǐng)域，由于核酸分子本身的特殊性，檢測受到一定的限制。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的之一是提供HNFlB基因突變檢測液相芯片，該液相芯片可用于單獨或并行檢測HNFlB基因五種常見基因型A12057G、C8941T、G35118A、C3784A和G13582A的野生型和突變型。
[0005]實現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下:
[0006]一種HNFlB基因突變檢測液相芯片，包括有:
[0007](A).針對HNFlB基因不同突變位點分別設(shè)計的野生型和突變型的ASPE引物對:每條ASPE引物由5’端的tag序列和3’端針對目的基因突變位點的特異性引物序列組成，所述特異性引物序列為:針對A12057G位點的SEQ ID N0.11及SEQ ID N0.12，針對C8941T位點的SEQ ID N0.13及SEQ ID N0.14，針對G35118A位點的SEQ ID N0.15及SEQ ID N0.16，針對 C3784A 位點的 SEQ ID N0.17 及 SEQ ID N0.18 ;和 / 或針對 G13582A 位點的 SEQ IDN0.19 及 SEQ ID N0.20 ;所述 tag 序列選自 SEQ ID N0.1 ~SEQ ID N0.10 ；[0008](B).有ant1-tag序列包被的、具有不同顏色編碼的微球,所述ant1-tag序列與微球連接中間還設(shè)有間隔臂序列；所述ant1-tag序列選自SEQ ID N0.21~SEQ ID N0.30，且所述ant1-tag序列能相應(yīng)地與(A)中所選的tag序列互補(bǔ)配對；
[0009]( C).用于擴(kuò)增出需要檢測的、具有相應(yīng)突變位點的目標(biāo)序列的引物。
[0010]在其中一個實施例中，所述擴(kuò)增引物為:針對A12057G位點的SEQ ID N0.31及SEQIDN0.32，針對 C8941T 位點的 SEQ ID N0.33 及 SEQ ID N0.34，針對 G35118A 位點的 SEQ IDN0.35 及 SEQ ID N0.36，針對 C3784A 位點的 SEQ ID N0.37 及 SEQ ID N0.38 ;和 / 或針對G13582A 位點的 SEQ ID N0.39 及 SEQ ID N0.40。
[0011]在其中一個實施例中，所述ASPE弓丨物為:針對A12057G位點的由SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.11組成的序列及由SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.12組成的序列，針對C8941T位點的由SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.13組成的序列及由SEQ ID N0.4和SEQ ID N0.14組成的序列，針對G35118A位點的由SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.15組成的序列及由SEQ ID N0.6和SEQ ID N0.16組成的序列，針對C3784A位點的由SEQ ID N0.7和SEQ ID N0.17組成的序列及由SEQ ID N0.8和SEQ ID N0.18組成的序列；和/或針對G13582A位點的由SEQ IDN0.9和SEQ ID N0.19組成的序列及由SEQ ID N0.10和SEQ ID N0.20組成的序列。
[0012]本發(fā)明的另一目的是提供用于HNFlB基因突變檢測的特異性引物。
[0013]具體技術(shù)方案如下:
[0014]用于HNFlB基因突變檢測的特異性引物，所述特異性引物序列為:針對A12057G位點的 SEQ ID N0.11 及 SEQ ID N0.12，針對 C8941T 位點的 SEQ ID N0.13 及 SEQ ID N0.14，針對 G35118A 位點的 SEQ ID N0.15 及 SEQ ID N0.16，針對 C3784A 位點的 SEQ ID N0.17 及SEQ ID N0.18 ;和 / 或針對 G13582A 位點的 SEQ ID N0.19 及 SEQ ID N0.20。
[0015]本發(fā)明的主要優(yōu)點在于:
[0016]1.本發(fā)明所提供的HNFlB基因突變檢測液相芯片的檢測結(jié)果與測序法的吻合率高達(dá)100%，且檢測所需要的時間遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于常用的測序技術(shù)，特別符合實際應(yīng)用需要。所制備的HNFlB基因突變檢測液相芯片具有非常好的信號-噪聲比，并且所設(shè)計的探針以及ant1-tag序列之間基本上不存在交叉反應(yīng)，tag標(biāo)簽序列、ant1-tag標(biāo)簽序列的選取以及tag標(biāo)簽序列與具體ASPE引物的結(jié)合，能夠避免交叉反應(yīng)，實現(xiàn)多個突變位點的并行檢測。
[0017]2.本發(fā)明通過發(fā)明人長期積累的設(shè)計經(jīng)驗和大量的實驗操作，從眾多的特異性引物中選取了最優(yōu)的組合。本發(fā)明設(shè)計的ASPE引物特異性引物能夠靈敏特異地識別目標(biāo)檢測的突變位點，準(zhǔn)確區(qū)分各種型別的基因型；在同一個反應(yīng)體系中，不同的特異性引物之間、特異性引物與非目標(biāo)檢測的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物之間基本上不存在交叉反應(yīng)，檢測特異性好，交叉反應(yīng)率低于3% ;除了能夠檢測單個位點突變情況，也能夠同時并行檢測多個突變位點的突變情況，檢測效果一致。
[0018]3.本發(fā)明的檢測方法步驟簡單，5種突變位點檢測可通過一步PCR即可完成5條含有突變位點的目標(biāo)序列的擴(kuò)增，避免了反復(fù)多次PCR等復(fù)雜操作過程中存在的諸多不確定因素，因而可 大大提高檢測準(zhǔn)確率，體現(xiàn)了精確的同時定性、定量分析特征。
[0019]4.本發(fā)明不僅克服了傳統(tǒng)固相芯片敏感性不高，檢測結(jié)果的可重復(fù)性差的缺陷，同時對現(xiàn)有的液相芯片技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)，使得所制備微球能適用于不同的檢測項目，具有很強(qiáng)的拓展性。檢測的熒光信號值大大提高，從而使得檢測的靈敏度進(jìn)一步得到提高，信噪比增強(qiáng)，檢測結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠。
【具體實施方式】
[0020]實施例1HNFlB基因突變檢測液相芯片，主要包括有:
[0021]三、ASPE引物
[0022]針對HNFlB 基因五種常見基因型 A12057G、C8941T、G35118A、C3784A 和 G13582A 的野生型和突變型，分別設(shè)計特異性引物序列。ASPE引物由“tag序列+特異性引物序列”組成。ASPE引物序列如下表所示:
[0023]表1HNFlB基因的ASPE弓丨物序列(tag序列+特異性引物序列)
【權(quán)利要求】
1.一種HNFlB基因突變檢測液相芯片，其特征是，包括有: (A).針對HNFlB基因不同突變位點分別設(shè)計的野生型和突變型的ASPE引物對:每條ASPE引物由5’端的tag序列和3’端針對目的基因突變位點的特異性引物序列組成，所述特異性引物序列為:針對A12057G位點的SEQ ID N0.11及SEQ ID N0.12，針對C8941T位點的 SEQ ID N0.13 及 SEQ ID N0.14，針對 G35118A 位點的 SEQ ID N0.15 及 SEQ ID N0.16，針對 C3784A 位點的 SEQ ID N0.17 及 SEQ ID N0.18，和 / 或針對 G13582A 位點的 SEQ IDN0.19 及 SEQ ID N0.20 ;所述 tag 序列選自 SEQ ID N0.1 ~SEQ ID N0.10 ； (B).有ant1-tag序列包被的、具有不同顏色編碼的微球,所述ant1-tag序列與微球連接中間還設(shè)有間隔臂序列；所述ant1-tag序列選自SEQ ID N0.21~SEQ ID N0.30，且所述ant1-tag序列能相應(yīng)地與(A)中所選的tag序列互補(bǔ)配對； (C).用于擴(kuò)增出需要檢測的、具有相應(yīng)突變位點的目標(biāo)序列的引物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的HNFlB基因突變檢測液相芯片，其特征是，所述擴(kuò)增引物為:針對 A12057G 位點的 SEQ ID N0.31 及 SEQ ID N0.32，針對 C8941T 位點的 SEQ ID N0.33 及SEQ IDN0.34，針對G35118A位點的 SEQ ID N0.35 及 SEQ ID N0.36，針對C3784A位點的 SEQID N0.37 及 SEQ ID N0.38，和 / 或針對 G13582A 位點的 SEQ ID N0.39 及 SEQ ID N0.40。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的HNFlB基因突變檢測液相芯片，其特征是，所述ASPE引物為:針對A12057G位點的由SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.11組成的序列及由SEQ ID N0.2和SEQ IDN0.12組成的序列，針對C8941T位點的由SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.13組成的序列及由SEQ IDN0.4和SEQ ID N0.14組成的序列，針對G35118A位點的由SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.15組成的序列及由SEQ ID N0.6和SEQ ID N0.16組成的序列，針對C3784A位點的由SEQ ID N0.7和SEQ ID N0.17組成的序列及由SEQ ID N0.8和SEQ ID N0.18組成的序列，和/或針對G13582A位點的由SEQ ID N0.9和SEQ ID N0.19組成的序列及由SEQID N0.10和SEQ ID N0.20組成的序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的HNFlB基因突變檢測液相芯片，其特征是，所述間隔臂為5—10 個 To
5.用于HNFlB基因突變檢測的特異性引物，其特征是，所述特異性引物序列為針對A12057G 位點的 SEQ ID N0.11 R SEQ ID N0.12，針對 C8941T 位點的 SEQ ID N0.13 及 SEQID N0.14，針對G35118A位點的 SEQ ID N0.15 及 SEQ ID N0.16，針對C3784A位點的 SEQ IDN0.17 及 SEQ IDN0.18，和 / 或針對 G13582A 位點的 SEQ ID N0.19 及 SEQ ID N0.20。
【文檔編號】C12N15/11GK103571919SQ201210250245
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2012年7月18日 優(yōu)先權(quán)日:2012年7月18日
【發(fā)明者】許嘉森, 吳詩揚(yáng) 申請人:益善生物技術(shù)股份有限公司