專利名稱：一種胚胎干細胞培養(yǎng)基及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種胚胎干細胞培養(yǎng)基及其應用。
背景技術：
胚胎干細胞的培養(yǎng)一直在生物學醫(yī)藥學和農業(yè)生物技術中占有極其顯著的位置，近來由于轉基因技術和組織再生醫(yī)學的迫切需求，使得這一領域的研究呈現出蓬勃強勁的態(tài)勢。已經建立并完善了小鼠和人類的胚胎干細胞系，并已投入實際研究和治療應用。但轉基因生物反應器所迫切需求的畜禽類胚胎干細胞系卻至今尚未見報道。轉基因動物技術和轉基因動物制藥是近年來研究最熱門、發(fā)展最快的領域之一。將目的外源基因導入到動物體內并與動物基因組整合在一起，隨著細胞的分裂和增殖，夕卜源基因在動物體內表達蛋白并在動物世代間穩(wěn)定遺傳。轉基因動物打破了自然繁殖中的種 間隔離，使基因能在種系關系很遠的機體間流動，實現了動物種間遺傳物質的交換與重組，這不僅為遺傳物質的研究提供了新的手段，豐富了物種的基因庫，而且擴大了生命科學的視野。1980年，Gordon等首次育成轉基因小鼠，目前除轉基因小鼠外，轉基因兔、轉基因綿羊、轉基因豬、轉基因牛、轉基因山羊、轉基因雞、轉基因大鼠、轉基因猴等陸續(xù)育成，在生物學基礎研究、醫(yī)學、農業(yè)及生物工程等領域，均具有極高的科研和經濟價值。制作轉基因動物的方法主要有顯微注射法、逆轉錄病毒法、胚胎干細胞法、體細胞移植技術、腺病毒載體法和精子頭與轉移基因共注射法等。胚胎干細胞最早從早期的小鼠胚胎內細胞團分離出來，在正確的培養(yǎng)體系中的能夠在體外長期傳代并且保持高速增殖和維持類似癌細胞的無限繁殖和向外、中、內3個胚層高度分化的潛能，在體內能參與包括生殖系在內的各個組織器官的發(fā)育形成嵌合體。通過隨機插入或者同源重組將外源基因整合到胚胎干細胞的基因組中，獲得穩(wěn)定表達的轉基因細胞，通過抗性標記篩選富集被轉染的細胞并建立胚胎干細胞系。再以顯微注射法把這種轉基因胚胎干細胞植入正常發(fā)育的受體囊胚中并將受體囊胚到受體動物的子宮內得到的轉基因動物個體。胚胎干細胞介導法是一條極具魅力的轉基因動物技術路線。與其它幾種方法相比，基于系穩(wěn)定成熟的胚胎干細胞系的胚胎干細胞介導法具有以下優(yōu)點(1)外源重組基因在受體染色體上的準確整合；(2)可在胚胎植入前篩選出合適的穩(wěn)定傳代細胞系；(3)可對細胞進行遺傳修飾，外源基因調控表達，基因自身失活等操作；(4)可以通過基因打靶基因剔除建立基因缺失的畜禽品種和動物模型。但由于缺乏成熟的胚胎干細胞系，使這一技術僅僅局限于小鼠上的應用，嚴重限制這一先進技術在諸多領域里優(yōu)勢潛能的發(fā)揮。誘導多能干細胞(iPS細胞)是近年來干細胞研究領域一項突破性的進展，其劃時代的意義不僅在于為再生醫(yī)學及相關的治療研究提供了一種豐富的多能性干細胞材料來源，更重要的是將對干細胞多能性維持及體細胞重編程去分化機制的研究從誘導培養(yǎng)的細胞水平直接引入到了基因調控的分子水平。禽類由于其獨特地生理特性，在醫(yī)藥動物模型、生命科學基礎研究和藥物生產上占有極其顯著的地位。家禽一直是人類最主要的肉類和蛋類蛋白質來源，另外家禽的輸卵管相比哺乳動物的乳腺更具有成為生物反應器的價值，家禽易于飼養(yǎng)管理和大規(guī)模繁殖，卵類蛋白成份簡單且易于純化，卵類蛋白糖基化更接近于人類。獲得一個穩(wěn)定，增長迅速，具有多分化潛能的禽類胚胎干細胞系，一直是科研人員所迫切希望和努力追求的，也是禽類轉基因領域和其它基礎研究和應用技術發(fā)展厄需解決的瓶頸?，F有的禽類胚胎干細胞培養(yǎng)體系是基于對小鼠的胚胎干細胞培養(yǎng)體系的模仿，大都存在增長緩慢、穩(wěn)定性差的缺點，而且實驗結果多不能重復。而禽類特殊的繁殖生理體系使得禽類的胚胎干細胞從獲得到培養(yǎng)都和模式生物小鼠相差很遠，使得在小鼠上很成熟的胚胎干細胞培養(yǎng)體系很難應用到禽類胚胎干細胞培養(yǎng)體系的開發(fā)上。不止家禽，其它物種的胚胎干細胞的研究也都難以獲得小鼠胚胎干細胞的效果，可見現有的小鼠的成熟胚胎干細胞培養(yǎng)體系，很難應用的其他動物的胚胎干細胞培養(yǎng)之中。這一方面是由于物種之間的差距，另一方面可能是由于作為胚胎干細胞來源的內細胞團細胞和胚盤細胞在細胞特性和多能性及自我更新的調控網絡上不適合外源細胞因子的干預。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種胚胎干細胞培養(yǎng)基及其應用。 本發(fā)明還提供的胚胎干細胞培養(yǎng)基，包括如下組分含有S0X2蛋白的蛋白甲、含有POUV蛋白的蛋白乙、含有Nanog蛋白的蛋白丙、含有CLIN28蛋白的蛋白丁、細胞因子LIF、細胞因子SCF和細胞因子bFGF。所述蛋白甲為序列表的序列5所不的S0X2蛋白。所述蛋白乙為序列表的序列7所不的POUV蛋白。所述蛋白丙為序列表的序列9所不的Nanog蛋白。所述蛋白丁為序列表的序列11所不的cLIN28蛋白。所述蛋白甲包括如下兀件序列表的序列5所不的S0X2蛋白和序列表的序列3所不的精氣酸短妝。所述蛋白乙包括如下兀件序列表的序列7所不的POUV蛋白和序列表的序列3所不的精氣酸短妝。所述蛋白丙包括如下兀件序列表的序列9所不的Nanog蛋白和序列表的序列3所示的精氨酸短肽。所述蛋白丁包括如下元件序列表的序列11所示的CLIN28蛋白和序列表的序列3所示的精氨酸短肽。所述胚胎干細胞培養(yǎng)基還可包括如下組分丙酮酸鈉和雞血清。所述胚胎干細胞培養(yǎng)基具體可由DMEM培養(yǎng)基(如高糖DMEM培養(yǎng)基)和溶質組成；所述溶質及其在所述胚胎干細胞傳代培養(yǎng)基中的濃度如下丙酮酸鈉4-6mM(如5mM)、細胞因子 LIF 1-2Χ1(Γ2μ g/ml (如 L 5X 1(Γ2 μ g/ml)、細胞因子 SCF O. 5-1. 5ng/ml (如 lng/ml)、細胞因子 bFGF O. 5-1. 5ng/ml (如 lng/ml)、所述蛋白甲 30_35mg/L (如 33. 75mg/L)、所述蛋白乙25_30mg/L(如27. 75mg/L)、所述蛋白丙35_40mg/L(如37. 5mg/L)、所述蛋白丁30-40mg/L (如 36mg/L 或 31. 5mg/L)和離體雞血清 80_120mL/L (如 100mL/L)。所述蛋白甲具體可以以蛋白液的形式加入，所述蛋白液具體可為蛋白濃度為O. 45mg/ml的蛋白液,每升胚胎干細胞培養(yǎng)基中具體加入了 75mL。所述蛋白乙具體可以以蛋白液的形式加入，所述蛋白液具體可為蛋白濃度為O. 37mg/ml的蛋白液，每升胚胎干細胞培養(yǎng)基中具體加入了 75mL。所述蛋白丙具體可以以蛋白液的形式加入，所述蛋白液具體可為蛋白濃度為O. 5mg/ml的蛋白液,每升胚胎干細胞培養(yǎng)基中具體加入了 75mL。所述蛋白丁具體可以以蛋白液的形式加入，所述蛋白液具體可為蛋白濃度為O. 48mg/ml或O. 42mg/ml的蛋白液，每升胚胎干細胞培養(yǎng)基中具體加入了 75mL。所述蛋白甲的蛋白液的制備方法具體如下(I)將S0X2蛋白表達質粒導入293FT細胞，得到重組細胞；(2)將所述重組細胞37°C培養(yǎng)12小時，離心收集細胞；(3)將步驟(2)收集的細胞進行超聲波破碎(超聲參數具體可為450Hz，每次超聲7s停9s，44次)，然后收集分子量小于IOKD的蛋白液，即為S0X2蛋白的蛋白液。所述蛋白甲的蛋白液的制備方法具體還可如下(I)將S0X2蛋白表達質粒用Bgl II酶切，得到線性化質粒；(2)將所述線性化質粒通過導入CHO細胞,得到重組細胞。 (3)將所述重組細胞37°C培養(yǎng)12小時，離心(離心參數具體可為3000rpm，3min)收集上清，然后收集分子量小于IOKD的蛋白液，即為S0X2蛋白的蛋白液。所述蛋白乙的蛋白液的制備方法具體如下(I)將POUV蛋白表達質粒導入293FT細胞，得到重組細胞；(2)將所述重組細胞37°C培養(yǎng)12小時，離心收集細胞；(3)將步驟(2)收集的細胞進行超聲波破碎(超聲參數具體可為450Hz，每次超聲7s停9s，44次)，然后收集分子量小于IOKD的蛋白液，即為POUV蛋白的蛋白液。所述蛋白乙的蛋白液的制備方法具體還可如下(I)將POUV蛋白表達質粒用Bgl II酶切，得到線性化質粒；(2)將所述線性化質粒通過導入CHO細胞,得到重組細胞。(3)將所述重組細胞37°C培養(yǎng)12小時，離心(離心參數具體可為3000rpm，3min)收集上清，然后采用分子量小于IOKD的蛋白液，即為POUV蛋白的蛋白液。所述蛋白丙的蛋白液的制備方法具體如下(I)將Nanog蛋白表達質粒導入293FT細胞，得到重組細胞；(2)將所述重組細胞37°C培養(yǎng)12小時，離心收集細胞；(3)將步驟(2)收集的細胞進行超聲波破碎(超聲參數具體可為450Hz，每次超聲7s停9s，44次)，然后收集分子量小于IOKD的蛋白液，即為Nanog蛋白的蛋白液。所述蛋白丙的蛋白液的制備方法具體還可如下(I)將Nanog蛋白表達質粒用Bgl II酶切,得到線性化質粒；(2)將所述線性化質粒通過導入CHO細胞,得到重組細胞。(3)將所述重組細胞37°C培養(yǎng)12小時，離心(離心參數具體可為3000rpm，3min)收集上清，然后收集分子量小于IOKD的蛋白液，即為Nanog蛋白的蛋白液。所述蛋白丁的蛋白液的制備方法具體如下(I)將CLIN28蛋白表達質粒導入293FT細胞，得到重組細胞；(2)將所述重組細胞37°C培養(yǎng)12小時，離心收集細胞；(3)將步驟(2)收集的細胞進行超聲波破碎(超聲參數具體可為450Hz，每次超聲7s停9s，44次)，然后收集分子量小于IOKD的蛋白液，即為cLIN28蛋白的蛋白液。所述蛋白丁的蛋白液的制備方法具體還可如下(I)將CLIN28蛋白表達質粒用Bgl II酶切，得到線性化質粒；(2)將所述線性化質粒通過導入CHO細胞,得到重組細胞。
(3)將所述重組細胞37°C培養(yǎng)12小時，離心(離心參數具體可為3000rpm，3min)收集上清，然后收集分子量小于IOKD的蛋白液，即為CLIN28蛋白的蛋白液。以上任一所述S0X2蛋白表達質粒的制備方法具體如下在重組質粒PGSPF9R-IRES-EGFP的多克隆位點(如EcoR I和BamH I酶切位點之間)插入去除終止密碼子后的S0X2蛋白編碼基因(S0X2蛋白具體如序列表的序列5所不,其編碼基因具體如序列表的序列6所不)，得到S0X2蛋白表達質粒。以上任一所述POUV蛋白表達質粒的制備方法具體如下在重組質粒PGSPF9R-IRES-EGFP的多克隆位點(如EcoR I和Kpn I酶切位點之間)插入去除終止密碼子后的POUV蛋白編碼基因(P0UV蛋白具體如序列表的序列7所不，其編碼基因具體如序列表的序列8所不)，得到POUV蛋白表達質粒。
以上任一所述Nanog蛋白表達質粒的制備方法具體如下在重組質粒PGSPF9R-IRES-EGFP的多克隆位點(如EcoR I和BamH I酶切位點之間)插入去除終止密碼子后的Nanog蛋白編碼基因(Nanog蛋白具體如序列表的序列9所不，其編碼基因具體如序列表的序列10所示),得到Nanog蛋白表達質粒。以上任一所述CLIN28蛋白表達質粒的制備方法具體如下在重組質粒PGSPF9R-IRES-EGFP的多克隆位點(如Kpn I和BamH I酶切位點之間)插入去除終止密碼子后的cLIN28蛋白編碼基因(cLIN28蛋白具體如序列表的序列11所不，其編碼基因具體如序列表的序列12所不)，得到cLIN28蛋白表達質粒。以上任一所述重組質粒pGSPF9R-IRES-EGFP的制備如下以pIRES2_EGFP載體為骨架載體，在其多克隆位點甲(如Nhe I和Bgl II酶切位點之間)插入雞生長激素信號肽的編碼基因(雞生長激素信號肽具體如序列表的序列I所示，其編碼基因具體如序列表的序列2所示)，多克隆位點乙(如Sma I和BamH I酶切位點之間)插入精氨酸短肽的編碼基因(精氨酸短肽具體如序列表的序列3所示，其編碼基因具體如序列表的序列4所示)，得到重組質粒PGSPF9R-IRES-EGFP ;所述多克隆位點甲位于所述多克隆位點乙的上游。以上任一所述胚胎干細胞培養(yǎng)基可用于培養(yǎng)胚胎干細胞。所述胚胎干細胞具體可為雞胚胎干細胞(如壽光雞胚胎干細胞)。所述胚胎干細胞具體可為胚盤細胞。本發(fā)明還保護一種培養(yǎng)胚胎干細胞的方法，是采用以上任一所述的胚胎干細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)所述胚胎干細胞。所述胚胎干細胞具體可為雞胚胎干細胞(如壽光雞胚胎干細胞)。所述胚胎干細胞具體可為胚盤細胞。本發(fā)明還提供了含有S0X2蛋白的蛋白甲、含有POUV蛋白的蛋白乙、含有Nanog蛋白的蛋白丙、含有CLIN28蛋白的蛋白丁、細胞因子LIF、細胞因子SCF和細胞因子bFGF在制備胚胎干細胞培養(yǎng)基中的應用。所述蛋白甲為序列表的序列5所不的S0X2蛋白。所述蛋白乙為序列表的序列7所不的POUV蛋白。所述蛋白丙為序列表的序列9所不的Nanog蛋白。所述蛋白丁為序列表的序列11所不的cLIN28蛋白。所述蛋白甲包括如下兀件序列表的序列5所不的S0X2蛋白和序列表的序列3所不的精氣酸短妝。所述蛋白乙包括如下兀件序列表的序列7所不的POUV蛋白和序列表的序列3所不的精氣酸短妝。所述蛋白丙包括如下兀件序列表的序列9所不的Nanog蛋白和序列表的序列3所示的精氨酸短肽。所述蛋白丁包括如下元件序列表的序列11所示的CLIN28蛋白和序列表的序列3所示的精氨酸短肽。所述胚胎干細胞具體可為雞胚胎干細胞(如壽光雞胚胎干細胞)。所述胚胎干細胞具體可為胚盤細胞。采用本發(fā)明提供的胚胎干細胞培養(yǎng)基進行胚胎干細胞的培養(yǎng)，具有如有優(yōu)點可以使胚胎干細胞長期、大量擴增，并保持良好的全能性(全能性相關基因有效表達，可以形成胚樣體)以及自我更新能力(胚胎干細胞可長期傳代)；操作簡便，成本低廉。本發(fā)明可用于體外誘導分化、轉基因細胞系制備、干細胞核移植、轉基因干細胞核移植或嵌合體制備、還可以用于組織工程和細胞治療等多種胚胎干細胞功能的應用，對于生物醫(yī)學具有重大應用前景。


圖I為插入外源基因后的重組質粒pGSPF9R-IRES-EGFP的結構示意圖。
圖2為實施例3中實驗組的PO代、P6代和P7代細胞的表面標志檢測。圖3為實施例3中胚胎干細胞全能性相關基因表達。圖4為實施例3中第6代細胞通過三胚層聚集生長與分化后所形成的擬胚體。圖5為實施例3中嵌合體的照片。圖6為實施例3中嵌合體各個組織中的促乳素受體基因鑒定結果。圖7為實施例5中實驗組的PO代、P6代和P7代細胞的表面標志檢測。圖8為實施例5中胚胎干細胞全能性相關基因表達。
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。高糖DMEM培養(yǎng)基Gibco，貨號為12491-015。丙酮酸鈉美季生物有限公司，貨號為 A4859。細胞因子 LIF :CANTA CRUZ，貨號為 SC-4989。細胞因子 SCF:Cell Signaling，貨號為 #8925。細胞因子 bFGF Cell Sinaling，貨號為 #8910。pIRES2_EGFP載體=Ivitrogen,貨號為 CB5159815。293FT 細胞Ivitrogen，貨號為 R700-07。CHO 細胞Ivitrogen，貨號為2205-20-47。壽光雞種蛋中國農業(yè)大學動物科技學院教學實驗場。白來航蛋雞種蛋中國農業(yè)大學動物科技學院教學實驗場。實施例I、重組質粒的制備一、重組質粒 pGSPF9R-IRES-EGFP 的制備以pIRES2-EGFP載體為骨架載體，在其Nhe I和Bgl II酶切位點之間插入雞生長激素信號肽的編碼基因(雞生長激素信號肽如序列表的序列I所示，其編碼基因如序列表的序列2所示)，Sma I和BamH I酶切位點之間插入精氨酸短肽的編碼基因(精氨酸短肽如序列表的序列3所示，其編碼基因如序列表的序列4所示；縮寫為9XArg)，得到重組質粒PGSPF9R-IRES-EGFP。重組質粒pGSPF9R_IRES_EGFP中，雞生長激素信號肽的編碼基因和精氨酸短肽的編碼基因之間為多克隆位點，可以供外源基因插入，在細胞中表達兩個蛋白，其中一個蛋白為包括雞生長激素信號肽、外源蛋白和精氨酸短肽在內的融合蛋白，另一個蛋白為EGFP蛋白。出細胞時，雞生長激素信號肽被切除，形成包括外源蛋白和精氨酸短肽在內的融合蛋白。插入外源基因后的重組質粒pGSPF9R-IRES-EGFP的結構示意圖見圖I。二、雞源S0X2蛋白表達質粒的制備在重組質粒pGSPF9R-IRES-EGFP的EcoR I和BamH I酶切位點之間插入去除終止密碼子后的雞源S0X2蛋白編碼基因(雞源S0X2蛋白如序列表的序列5所示，其編碼基因如序列表的序列6所示),得到雞源S0X2蛋白表達質粒。表達包括如下元件的融合蛋白雞源S0X2蛋白和精氨酸短肽。三、雞源POUV蛋白表達質粒的制備在重組質粒pGSPF9R-IRES-EGFP的EcoR I和Kpn I酶切位點之間插入去除終止密碼子后的雞源POUV蛋白編碼基因(雞源POUV蛋白如序列表的序列7所示，其編碼基因如序列表的序列8所示),得到雞源POUV蛋白表達質粒。表達包括如下元件的融合蛋白雞源POUV蛋白和精氨酸短肽。四、雞源Nanog蛋白表達質粒的制備在重組質粒pGSPF9R-IRES-EGFP的EcoR I和BamH I酶切位點之間插入去除終止 密碼子后的雞源Nanog蛋白編碼基因(雞源Nanog蛋白如序列表的序列9所不，其編碼基因如序列表的序列10所示),得到雞源Nanog蛋白表達質粒。表達包括如下元件的融合蛋白雞源Nanog蛋白和精氨酸短肽。五、雞源CLIN28蛋白表達質粒的制備在重組質粒pGSPF9R-IRES-EGFP的Kpn I和BamH I酶切位點之間插入去除終止密碼子后的雞源CLIN28蛋白編碼基因(雞源CLIN28蛋白如序列表的序列11所示，其編碼基因如序列表的序列12所示),得到雞源cLIN28蛋白表達質粒。表達包括如下元件的融合蛋白雞源CLIN28蛋白和精氨酸短肽。實施例2、胚胎干細胞傳代培養(yǎng)基的制備一、分別將實施例I的步驟二至步驟五制備的蛋白表達質粒進行如下實驗I、將蛋白表達質粒通過磷酸鈣轉染法(描述磷酸鈣轉染法的參考文獻NANCYHSIUNG, RAYMOND S. ROGINSKI, PAULA HENTHORN, OLIVER SMITHIES, RAJU KUCHERLAPATI, ANDARTHUR I. SKOULTCHI，Introduction and expression of a fetal human globin gene inmouse fibroblasts，MOLECULAR AND CELLULAR BIOLOGY, Apr. 1982，p. 401-411)導入 293FT細胞中，72小時后通過觀察熒光強度篩選出表達EGFP的細胞。2、將步驟I篩選得到的細胞37°C培養(yǎng)12小時，離心收集細胞；3、將步驟2收集的細胞進行超聲波破碎(450Hz，每次超聲7s停9s，44次)，然后采用蛋白濃縮柱(Millipore UFC901024 Amicon Ultra-15 15ml/10KD,按說明書操作)過濾濃縮，收集分子量小于IOKD的蛋白液，-80度冷凍保存。分別得到雞源S0X2蛋白液(蛋白濃度為O. 45mg/ml)、雞源POUV蛋白液(蛋白濃度為O. 37mg/ml)、雞源Nanog蛋白液(蛋白濃度為O. 5mg/ml)、雞源cLIN28蛋白液(蛋白濃度為 O. 48mg/ml)。將重組質粒pGSPF9R-IRES-EGFP代替表達質粒進行步驟I至3，得到對照蛋白液甲。將293FT細胞進行步驟3，得到對照蛋白液乙。二、雞胚胎干細胞傳代培養(yǎng)基的制備雞胚胎干細胞傳代培養(yǎng)基由溶質和高糖DMEM培養(yǎng)基組成；所述溶質在所述雞胚胎干細胞傳代培養(yǎng)基中的濃度如下丙酮酸鈉5mM、細胞因子LIF I. 5X 10_2 μ g/ml、細胞因子SCF lng/ml、細胞因子bFGF lng/ml、步驟一制備的雞源S0X2蛋白液75mL/L、步驟一制備的雞源POUV蛋白液75mL/L、步驟一制備的雞源Nanog蛋白液75mL/L、步驟一制備的雞源CLIN28蛋白液75mL/L和雞血清100mL/L。三、對照傳代培養(yǎng)基甲的制備對照傳代培養(yǎng)基甲由溶質和高糖DMEM培養(yǎng)基組成；所述溶質在所述對照傳代培 養(yǎng)基甲中的濃度如下丙酮酸鈉5mM、細胞因子LIF I. 5X 10_2 μ g/ml、細胞因子SCF Ing/ml、細胞因子bFGF lng/ml、步驟一制備的對照蛋白液甲300mL/L和雞血清100mL/L。四、對照傳代培養(yǎng)基乙的制備對照傳代培養(yǎng)基乙由溶質和高糖DMEM培養(yǎng)基組成；所述溶質在所述對照傳代培養(yǎng)基乙中的濃度如下丙酮酸鈉5mM、細胞因子LIF I. 5X 10_2 μ g/ml、細胞因子SCF Ing/ml、細胞因子bFGF lng/ml、步驟一制備的對照蛋白液乙300mL/L和雞血清100mL/L。五、對照傳代培養(yǎng)基丙的制備對照傳代培養(yǎng)基丙由溶質和高糖DMEM培養(yǎng)基組成；所述溶質在所述對照傳代培養(yǎng)基丙中的濃度如下丙酮酸鈉5mM、細胞因子LIF I. 5X 10_2 μ g/ml、細胞因子SCF Ing/ml、步驟一制備的雞源S0X2蛋白液75mL/L、步驟一制備的雞源POUV蛋白液75mL/L、步驟一制備的雞源Nanog蛋白液75mL/L、步驟一制備的雞源cLIN28蛋白液75mL/L和雞血清100mL/L。六、對照傳代培養(yǎng)基丁的制備對照傳代培養(yǎng)基丁由溶質和高糖DMEM培養(yǎng)基組成；所述溶質在所述對照傳代培養(yǎng)基丁中的濃度如下丙酮酸鈉5mM、細胞因子SCF lng/ml、細胞因子bFGF lng/ml、步驟一制備的雞源S0X2蛋白液75mL/L、步驟一制備的雞源POUV蛋白液75mL/L、步驟一制備的雞源Nanog蛋白液75mL/L、步驟一制備的雞源cLIN28蛋白液75mL/L和雞血清100mL/L。實施例3、雞胚胎干細胞的培養(yǎng)一、胚盤細胞的獲取選擇新鮮孵化的種蛋(壽光雞)，取胚盤細胞。二、胚盤細胞的培養(yǎng)I、實驗組用實施例2的步驟二制備的雞胚胎干細胞傳代培養(yǎng)基培養(yǎng)胚盤細胞(PO代)，觀察細胞形態(tài)，細胞出現密集山峰狀細胞團塊時，進行消化并半量更換新的雞胚胎干細胞傳代培養(yǎng)基進行傳代，得到Pl代。采用上述方法持續(xù)進行傳代，依次為P2代、P3代、P4代、P5代、P6代、P7代。2、對照組甲用實施例2的步驟三制備的對照傳代培養(yǎng)基甲代替雞胚胎干細胞傳代培養(yǎng)基進行步驟I的實驗。
3、對照組乙用實施例2的步驟四制備的對照傳代培養(yǎng)基乙代替雞胚胎干細胞傳代培養(yǎng)基進行步驟I的實驗。4、對照組丙用實施例2的步驟五制備的對照傳代培養(yǎng)基丙代替雞胚胎干細胞傳代培養(yǎng)基進行步驟I的實驗。5、對照組丁用實施例2的步驟六制備的對照傳代培養(yǎng)基丁代替雞胚胎干細胞傳代培養(yǎng)基進行步驟I的實驗。三、細胞分化的鑒定1、P0代細胞的形態(tài)鑒定對照組甲和對照組乙中，PO代細胞在培養(yǎng)過程中形態(tài)如下細胞間結合緊密，難于用消化酶進行消化，細胞呈現了嚴重的聚集狀態(tài)。實驗組中，PO代細胞形態(tài)依然保持著山峰狀。2、傳代時間傳代時間是指培養(yǎng)的胚盤細胞出現山峰狀(細胞密度在I. 5-20D)后可進行傳代的所需時間。各組細胞的傳代時間(小時)見表I。表I各組細胞的傳代時間(小時)代表完全分化、沒有后續(xù)傳代)
權利要求
1.ー種胚胎干細胞培養(yǎng)基，包括如下組分含有S0X2蛋白的蛋白甲、含有POUV蛋白的蛋白こ、含有Nanog蛋白的蛋白丙、含有CLIN28蛋白的蛋白丁、細胞因子LIF、細胞因子SCF和細胞因子bFGF。
2.如權利要求I所述的胚胎干細胞培養(yǎng)基，其特征在于所述蛋白甲為序列表的序列5所不的S0X2蛋白；所述蛋白こ為序列表的序列7所不的POUV蛋白；所述蛋白丙為序列表的序列9所不的Nanog蛋白；所述蛋白丁為序列表的序列11所不的cLIN28蛋白。
3.如權利要求I所述的胚胎干細胞培養(yǎng)基，其特征在于所述蛋白甲包括如下元件 序列表的序列5所不的S0X2蛋白和序列表的序列3所不的精気酸短妝；所述蛋白こ包括如下兀件序列表的序列7所不的POUV蛋白和序列表的序列3所不的精気酸短妝；所述蛋白丙包括如下元件序列表的序列9所示的Nanog蛋白和序列表的序列3所示的精氨酸短肽；所述蛋白丁包括如下兀件序列表的序列11所不的cLIN28蛋白和序列表的序列3所不的精氨酸短肽。
4.如權利要求I至3中任一所述的胚胎干細胞培養(yǎng)基，其特征在于所述胚胎干細胞培養(yǎng)基還包括如下組分丙酮酸鈉和離體雞血清。
5.如權利要求4所述的胚胎干細胞培養(yǎng)基，其特征在于所述胚胎干細胞培養(yǎng)基由DMEM培養(yǎng)基和溶質組成；所述溶質及其在所述胚胎干細胞培養(yǎng)基中的濃度如下丙酮酸鈉 4-6mM、細胞因子 LIF 1-2X 1(Γ2 μ g/ml、細胞因子 SCF O. 5-1. 5ng/ml、細胞因子 bFGFO.5-1. 5ng/ml、所述蛋白甲30_35mg/L、所述蛋白乙25_30mg/L、所述蛋白丙35_40mg/L、所述蛋白丁 30_40mg/L和離體雞血清80_120mL/L。
6.權利要求I至5中任一所述的胚胎干細胞培養(yǎng)基在培養(yǎng)胚胎干細胞中的應用。
7.一種培養(yǎng)胚胎干細胞的方法，是采用權利要求I至5中任一所述的胚胎干細胞培養(yǎng)基，培養(yǎng)所述胚胎干細胞。
8.如權利要求6所述的應用或如權利要求7所述的方法，其特征在于所述胚胎干細胞為胚盤細胞。
9.含有S0X2蛋白的蛋白甲、含有POUV蛋白的蛋白こ、含有Nanog蛋白的蛋白丙、含有CLIN28蛋白的蛋白丁、細胞因子LIF、細胞因子SCF和細胞因子bFGF在制備胚胎干細胞培養(yǎng)基中的應用。
10.如權利要求9所述的應用，其特征在于所述胚胎干細胞為胚盤細胞。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種胚胎干細胞培養(yǎng)基及其應用。本發(fā)明提供的胚胎干細胞培養(yǎng)基，包括如下組分含有SOX2蛋白的蛋白甲、含有POUV蛋白的蛋白乙、含有Nanog蛋白的蛋白丙、含有cLIN28蛋白的蛋白丁、細胞因子LIF、細胞因子SCF和細胞因子bFGF。所述SOX2蛋白具體如序列5所示。所述POUV蛋白具體如序列7所示。所述Nanog蛋白具體如序列9所示。所述cLIN28蛋白具體如序列11所示。采用本發(fā)明提供的胚胎干細胞培養(yǎng)基進行胚胎干細胞的培養(yǎng)，可以使胚胎干細胞長期、大量擴增，并保持良好的全能性。
文檔編號C12N5/0735GK102732476SQ20121025144
公開日2012年10月17日 申請日期2012年7月19日 優(yōu)先權日2012年7月19日
發(fā)明者于淼瑛, 李寧, 連正興, 韓紅兵 申請人:中國農業(yè)大學