專利名稱:一種利用海藻酸鈣法固定化植物乳桿菌發(fā)酵生產(chǎn)l-乳酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明屬于發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及一種利用海藻酸鈣法固定化植物乳桿菌發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的方法。
背景技術(shù):
L-乳酸是21世紀(jì)最具應(yīng)用潛力的有機酸之一。L-乳酸及其衍生物既是重要的有機化工原料,又是重要的精細(xì)化學(xué)品,被廣泛應(yīng)用于食品、農(nóng)業(yè)、環(huán)保、醫(yī)藥、飼料、日用品、化工等領(lǐng)域。發(fā)酵法生產(chǎn)L 乳酸的菌種主要有乳酸桿菌屬和根霉屬{Rhizopus)。用根霉發(fā)酵生產(chǎn)L 乳酸為好氧發(fā)酵,存在工藝能耗大、糖利用率低等缺點。 采用乳酸菌發(fā)酵生產(chǎn)L乳酸具有糖利用率高、不耗氧、能耗低、設(shè)備簡單、操作方便等優(yōu)點,在乳酸工業(yè)中具有廣闊的發(fā)展前景。細(xì)胞固定化技術(shù),是利用物理或化學(xué)手段,將游離的微物(細(xì)胞)或酶定位于限定的空間區(qū)域,并使其保持活性能反復(fù)利用的一項技術(shù),大致可分成吸附法、共價結(jié)合法、交聯(lián)法、包埋法等四大類。包埋法是將生物催化劑用物理或化學(xué)的方法包埋在各種載體中實現(xiàn)固定化的方法,是近年來發(fā)展迅速的一種新興細(xì)胞固定化技術(shù),具有操作簡單、對細(xì)胞活性影響較小、效率高等特點,是目前細(xì)胞固定化研究和應(yīng)用最廣泛的方法,也是食品的生產(chǎn)中最常用的固定化方法。包埋法常用載體主要有聚丙烯酰胺、瓊脂、明膠、k_卡拉膠、海藻酸鈉等。海藻酸鈉是一類天然高分子多糖類,對微生物無毒害作用,而且價格低廉,是包埋中常用的載體。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種利用海藻酸鈣法固定化植物乳桿菌發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的方法,本發(fā)明以植物乳桿菌為出發(fā)菌株,采用海藻酸鈉作為固定化材料包埋植物乳桿菌發(fā)酵生產(chǎn)乳酸,通過單因素實驗確定了最適合乳酸發(fā)酵的固定化細(xì)胞制作條件。I. 一種利用海藻酸鈣法固定化植物乳桿菌發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的方法,其特征在于發(fā)酵時,將增殖后的固定化細(xì)胞接入發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵,一定時間取樣,進行乳酸產(chǎn)量分析。2.其中,發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):玉米淀粉糖化液140、玉米漿75、碳酸鈣30。3.固定化細(xì)胞增殖培養(yǎng)將固定化細(xì)胞按10%的接種量接入增殖培養(yǎng)基中,于37°C培養(yǎng)20 ho增殖培養(yǎng)完畢用無菌生理鹽水洗滌3次,留作發(fā)酵實驗。4.增殖培養(yǎng)基,葡萄糖3%、蛋白胨1%、酵母膏I. 5%、K2HPO 0. 5%、碳酸鈣3%,pH 6. O05.細(xì)胞固定化方法采用海藻酸鈣法,將菌種移入種子培養(yǎng)基,于37°C下靜置培養(yǎng)20 h,取一定量菌液,離心10 min,收集菌體后加到海藻酸鈉溶液中,再攪拌均勻,用注射器將此混合液滴人到CaCl2溶液中,將形成的海藻酸鈣凝膠珠置于4°C冰箱中,繼續(xù)固化4 h。
6. MRS種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20、蛋白胨10、牛肉膏10、酵母膏5、乙酸鈉5、吐溫 80 ImL、檸檬酸二銨 2、K2HPO4 2、MgS04.7H20 0. 58、MnSO4 4H20 0.25、滅菌前 pH 6.5。7 海藻酸鈉的最佳濃度為I. 5%。8.選擇0. 5 mm作為固定化顆粒直徑。9.選擇2. 0%為最佳的氯化鈣濃度。10.最佳增殖時間為25 h。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明采用海藻酸鈉作為固定化材料包埋植物乳桿菌發(fā)酵生產(chǎn)乳酸,通過單因素實驗確定了最適合乳酸發(fā)酵的固定化細(xì)胞制作條件。
圖I海藻酸鈉濃度對固定化發(fā)酵的影響。圖2凝膠顆粒大小對固定化發(fā)酵的影響。圖3不同CaCl2濃度對固定化發(fā)酵的影響。圖4增殖時間對固定化發(fā)酵的影響。
具體實施例方式下面的實施例對本發(fā)明作詳細(xì)說明,但對本發(fā)明沒有限制。本發(fā)明所用的菌株為植物乳桿菌,購買于ACCC,編號為ACCC11118。實施例I
本實施案例說明海藻酸鈉濃度對固定化發(fā)酵的影響,在乳酸菌的固定化過程中,海藻酸鈉濃度決定著膠珠的成型和反應(yīng)性能。濃度太低不能成珠;濃度過高擠珠閑難,還會使得壁材過厚,降低菌種與外界發(fā)酵的靈敏度。結(jié)果如圖I所示。由圖I可看出,海藻酸鈉濃度存0. 5% 2. 0%之間時,乳酸產(chǎn)量差別不大;濃度在
I.5%時達到最大;濃度大于3. 0%時,乳酸產(chǎn)量明顯下降,這是由于凝膠的孔徑縮小,增加了物質(zhì)的傳質(zhì)阻力所致。實施例2
本實施案例說明凝膠顆粒大小對固定化發(fā)酵的影響,由圖2可以看出,隨著顆粒粒徑的增大,乳酸的產(chǎn)量呈下降趨勢。這是由于凝膠小球直徑越大,越不利于傳質(zhì),造成凝膠小球內(nèi)部的細(xì)胞營養(yǎng)供給不足,代謝產(chǎn)物累積過多,小球內(nèi)部環(huán)境惡化,不利于發(fā)酵的進行。顆粒直徑在0. 5 2. 5 mm時,乳酸產(chǎn)量差別很小,說明此范圍內(nèi)固定化顆粒的大小對乳酸產(chǎn)量影響不大。因此,選擇0.5 mm作為固定化顆粒直徑。實施例3
本實施案例說明不同CaCl2濃度對固定化發(fā)酵的影響,由圖3可看出,氯化鈣濃度對乳酸的產(chǎn)量影響不大,但是氯化鈣濃度對固定化細(xì)胞的性質(zhì)影響較大,濃度過低,凝膠顆粒較軟,在發(fā)酵過程中易損壞,影響持續(xù)發(fā)酵的穩(wěn)定性。在實驗過程中,發(fā)現(xiàn)CaCl2濃度在2. 0%時,所制作的同定化細(xì)胞形狀均勻,軟硬適中,具有彈性。所以,為使固定化細(xì)胞適應(yīng)于連續(xù)發(fā)酵,選擇2. 0%為最佳的氯化鈣濃度。實施例4
本實施案例說明增殖時間對固定化發(fā)酵的影響,增殖時間的長短直接影響發(fā)酵初始時固定化顆粒內(nèi)的含菌量,進而影響乳酸產(chǎn)量。由圖4可看出,增殖時間對固定化發(fā)酵的影響顯著,在增殖時間為25 h時,所 得的乳酸產(chǎn)量最大。
權(quán)利要求
1.一種利用海藻酸鈣法固定化植物乳桿菌發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的方法,其特征在于發(fā)酵時,將增殖后的海藻酸鈣法固定化細(xì)胞接入發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵,一定時間取樣,進行乳酸產(chǎn)量分析。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法,其特征在于,發(fā)酵培養(yǎng)基玉米淀粉糖化液140g/L、玉米漿75 g/L、碳酸鈣30 g/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法,其特征在于,固定化細(xì)胞增殖培養(yǎng)將固定化細(xì)胞按10%的接種量接入增殖培養(yǎng)基中,于37°C培養(yǎng)20 h ;增殖培養(yǎng)完畢用無菌生理鹽水洗滌3次,留作發(fā)酵。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法,其特征在于,增殖培養(yǎng)基為葡萄糖3%、蛋白胨1%、酵母膏 I. 5%、K2HPO 0. 5%、碳酸鈣 3%,pH 6. O。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法,其特征在于,細(xì)胞固定化方法采用海藻酸鈣法,將菌種移入種子培養(yǎng)基,于37°C下靜置培養(yǎng)20 h,取一定量菌液,離心10 min,收集菌體后加到海藻酸鈉溶液中,再攪拌均勻,用注射器將此混合液滴人到CaCl2溶液中,將形成的海藻酸鈣凝膠珠置于4°C冰箱中,繼續(xù)固化4 h。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法,其特征在于增殖時間為25h。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法,其特征在于,MRS種子培養(yǎng)基葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏10 g/L、酵母膏5 g/L、乙酸鈉5 g/L、吐溫80 I mL、檸檬酸二銨2 g/L、K2HPO42g/L、MgSO4 7H20 0. 58 g/L、MnSO4 4H20 0. 25 g/L、滅菌前 pH 6. 5。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法,其特征在于,海藻酸鈉的濃度為1.5%。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法,其特征在于選擇0.5mm作為固定化顆粒直徑。
10.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法,其特征在于選擇2.0%為氯化鈣濃度。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種利用海藻酸鈣法固定化植物乳桿菌發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的方法,本發(fā)明以植物乳桿菌為出發(fā)菌株,采用海藻酸鈉作為固定化材料包埋植物乳桿菌發(fā)酵生產(chǎn)乳酸,通過單因素實驗確定了最適合乳酸發(fā)酵的固定化細(xì)胞制作條件。
文檔編號C12N11/10GK102719492SQ20121025304
公開日2012年10月10日 申請日期2012年7月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月21日
發(fā)明者金雅新 申請人:太倉市茂通化建有限公司