專利名稱：利用苜蓿作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)天蠶素抗菌肽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物領(lǐng)域，確切地說，涉及利用苜蓿作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)抗菌肽天蠶素 B (Cecropin B，CB)的方法。
背景技術(shù)：
抗菌肽(antibacterial peptide,ABP)是廣泛存在于生物體內(nèi)具有抵抗外界微生物侵害，消除體內(nèi)突變細(xì)胞的ー類小分子多肽，由20 60個氨基酸殘基組成。這類活性多肽多數(shù)具有強(qiáng)堿性、熱穩(wěn)定性以及廣譜抗菌等特點(diǎn)，是生物天然免疫防御系統(tǒng)的重要組成部分。天蠶素抗菌肽(cecropins)是第一個被發(fā)現(xiàn)目前研究比較清楚的抗菌肽,在動物中廣泛存在，是最具潛カ的抗生素替代品之一。天蠶素(cecropins)對革蘭氏陽性菌、部分·革蘭氏陰性菌具有很強(qiáng)的殺傷力，構(gòu)成宿主防御細(xì)菌、真菌等入侵的重要分子屏障，而對真菌和真核細(xì)胞沒有毒性。研究發(fā)現(xiàn)，cecropins能夠通過抑制大腸桿菌細(xì)胞外膜蛋白相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致細(xì)胞的通透性增加，從而抑制細(xì)菌生長。cecropins也能通過抑制細(xì)胞的呼吸作用殺滅細(xì)菌。有些cecropins通過干擾信號傳導(dǎo)通路而間接發(fā)生，影響病毒基因轉(zhuǎn)錄。cecropins可以對煙草花葉病毒(TMV)、皰疹病毒(HSV-I)、I型人免疫缺陷病毒(HIV-I)的復(fù)制全過程進(jìn)行干擾。目前，抗菌肽要廣泛使用，目前還需要解決ー些問題。首先是來源問題。由于昆蟲抗菌肽的天然資源有限，化學(xué)合成和基因工程便成為獲取抗菌肽的主要手段?；瘜W(xué)合成肽類，成本較高。而在微生物中直接表達(dá)抗菌肽基因，可能造成宿主微生物自殺而不能獲得表達(dá)產(chǎn)物。所以，非常有必要再尋找一條新的、能夠降低抗菌肽生產(chǎn)成本的途徑。近年來，隨著植物分子生物學(xué)的飛速發(fā)展以及植物遺傳分析和遺傳工程技術(shù)的不斷革新，轉(zhuǎn)基因植物在基礎(chǔ)研究和生產(chǎn)實(shí)踐上都具有其重要意義。利用轉(zhuǎn)基因植物作為生物反應(yīng)器的研究和開發(fā)也在快速的發(fā)展，近年越來越受到人們的關(guān)注。轉(zhuǎn)基因植物生物反應(yīng)器的研究使植物以極低的費(fèi)用大量生產(chǎn)外源蛋白，具有極大的商業(yè)價值；利用轉(zhuǎn)基因植物作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)藥用蛋白不僅可以大大降低生產(chǎn)成本，而且簡化了它們的貯存運(yùn)輸和使用的方式；用植物作為生物反應(yīng)器，可以使外源基因以農(nóng)桿菌或植物病毒為載體介導(dǎo)的在其中表達(dá)，因為植物體只表達(dá)病原菌的部分免疫蛋白，不含致病微生物，對人畜相對較安全，提高了其表達(dá)產(chǎn)物的生物安全性。由于紫花苜蓿具有抗逆性強(qiáng)，適應(yīng)范圍廣，利用年限長，再生性強(qiáng)的特點(diǎn)，毎年可以收獲多次，而且苜蓿本身能固氮，需肥量少，和其他植物相比投入少、生物量大，所以我們能在低成本的情況下大量生產(chǎn)有抑菌活性的蛋白，有利于植物系統(tǒng)表達(dá)外源蛋白的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。目前抗菌肽的實(shí)際開發(fā)和應(yīng)用也有了諸多的實(shí)例。用途主要集中在養(yǎng)殖、植物抗病和應(yīng)用劑型等方面。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用于表達(dá)生產(chǎn)雜合抗菌肽天蠶素B的植物表達(dá)載體。ー種植物表達(dá)載體，它是在植物表達(dá)體pCAMBIA1390中插入了 CaMV35S啟動子，命名為pCAMBIA1390R ;在pCAMBIA1390R中插入其堿基序列如序列表SEQ ID NO. 3、2或I的基因，分別命名為 pCAMBIA1390RCB3、pCAMBIA1390RCB2 和 pCAMBIA1390RCB?！N雜合抗菌妝天香素B的基因，其喊基序列如序列表SEQ ID NO. 3所不；
所述的雜合抗菌肽天蠶素B的基因為人工合成。本發(fā)明另ー個目的是，提供ー種轉(zhuǎn)基因植物的生產(chǎn)方法，pCAMBIA1390RCB3、pCAMBIA1390RCB2或pCAMBIA1390RCB通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)，轉(zhuǎn)化至苜蓿中，獲得含抗菌肽天蠶素B的轉(zhuǎn)基因苜蓿。 本發(fā)明的又ー個目的是，提供ー種利用苜蓿作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)天蠶素抗菌肽B的方法。利用苜蓿作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)天蠶素抗菌肽B的方法，種植上述方法獲得的含抗菌肽天蠶素B的轉(zhuǎn)基因苜蓿，提取抗菌肽天蠶素B。本發(fā)明提供了抗菌肽天蠶素B (CB)及雜合抗菌肽天蠶素B (CB2、CB3)，在植物表達(dá)體 PCAMBIA1390 中插入了 CaMV35S 啟動子，命名為 pCAMBIA1390R ;在 pCAMBIA1390R中分別插入CB、CB2、CB3基因，獲得植物表達(dá)載體pCAMBIA1390RCB、pCAMBIA1390RCB2和pCAMBIA1390RCB3O通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化至苜蓿中，獲得了轉(zhuǎn)基因苜蓿。通過實(shí)驗證明，CB、CB2, CB3基因已整合到苜蓿的基因組中，轉(zhuǎn)基因苜蓿對金黃色葡萄球菌、沙門桿菌有抑制活性，而野生型苜蓿沒有抑制活性，CB3-基因植株的抑菌活性最高。苜蓿本身就具有抗逆性強(qiáng)、適應(yīng)范圍廣、利用年限長、再生性強(qiáng)及每年可以收獲多次的特點(diǎn)；而由于轉(zhuǎn)基因苜蓿轉(zhuǎn)入了抗菌肽基因，更加提高了其抗病能力，利用轉(zhuǎn)基因苜蓿作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)抗菌肽天蠶素B，可以更大地降低了生產(chǎn)抗菌肽天蠶素B的成本。


圖I為植物表達(dá)體pCAMBIA1390R質(zhì)粒圖譜；
圖2為植物表達(dá)體pCAMBIA1390R-CB結(jié)構(gòu)示意圖
圖3為pCAMBIA1390R- CB的酶切鑒定電泳圖，其中第一泳道為marker，第二泳道為質(zhì)粒酶切后片段；
圖4為植物表達(dá)體pCAMBIA1390RCB的PCR鑒定農(nóng)桿菌陽性克隆圖，其中第一泳道為marker ;第二泳道為陰性對照；3_7泳道PCR鑒定LBA4404的菌落。圖5為Puc-T-CB2的PCR鑒定農(nóng)桿菌陽性克隆圖，其中第一泳道為marker ;2_3為PCR鑒定LBA4404的菌落
圖6是Puc-T-CB2的酶切鑒定電泳圖，其中第一泳道為marker，第二，三泳道為質(zhì)粒酶切后片段；
圖7為植物表達(dá)體pCAMBIA1390R-CB2結(jié)構(gòu)示意圖
圖8是pCAMBIA1390R- CB2的酶切鑒定電泳圖，其中第一泳道為marker，第二，三泳道為質(zhì)粒酶切后片段；
圖9是pCAMBIA1390R-CB2的PCR鑒定農(nóng)桿菌陽性克隆圖，其中第一泳道為marker ； 1，2為PCR鑒定LBA4404的菌落
圖10為植物表達(dá)體pCAMBIA1390R-CB3結(jié)構(gòu)示意圖
圖11是Puc-T-CB3的PCR鑒定農(nóng)桿菌陽性克隆圖，其中第一泳道為marker ; 1，2為PCR鑒定的菌落
圖12是Puc-T-CB3的酶切鑒定電泳圖，其中第一泳道為marker，第二，三泳道為質(zhì)粒酶切后片段；
圖13是pCAMBIA1390R-CB3的酶切鑒定電泳圖，其中第一泳道為marker，第二，三泳道為質(zhì)粒酶切后片段；
圖14是pCAMBIA1390R-CB3的PCR鑒定農(nóng)桿菌陽性克隆圖，其中第一泳道為marker ；1，2為PCR鑒定LBA4404的菌落
圖15是潮霉素對苜蓿愈傷組織生長的抗性篩選
圖16為PCAMBIAlSgOR-CB1轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR檢測圖，其中第一泳道為marker DL2000 ；第二泳道為為陰性對照；2-5泳道為轉(zhuǎn)基因植株
圖17是pCAMBIA1390R-CB2_基因植株的PCR檢測圖，其中第一泳道為marker，2_5泳道為轉(zhuǎn)化的苜蓿；
圖18為pCAMBIA1390R-CB3_基因植株的PCR檢測圖，其中第一泳道為marker DL2000 ；第二泳道為陽性質(zhì)粒pCAMBIA1390R-CB3 ;第三泳道為陰性對照；4_7泳道為轉(zhuǎn)基因植株圖19為pCAMBIAl 3901^ 轉(zhuǎn)基因植株RT-PCR檢測圖，其中第一泳道為markerDL2000 ;第二泳道為陽性質(zhì)粒pCAMBIA1390R-CB3 ;第3泳道為陰性對照，4-11泳道為轉(zhuǎn)基因植株
圖20是轉(zhuǎn)基因植株的Southern Blot檢測圖，其中第一泳道為沿/ dIIIDNA sizemarker，第二泳道為陽性質(zhì)粒對照；第三泳道為野生型苜蓿基因組；第五泳道為PCAMBIA1390RCB轉(zhuǎn)基因植株.六，七泳道為pCAMBIA1390RCB2轉(zhuǎn)基因植株.ノV，九泳道為pCAMBIA1390RCB3轉(zhuǎn)基因植株
圖21是瓊脂糖擴(kuò)散法測抑菌活性檢測圖，其中A為金黃色葡萄球菌；B為沙門桿菌；I為pCAMBIA1390R-CB轉(zhuǎn)基因植株提取的蛋白；2為pCAMBIA1390R_CB2轉(zhuǎn)基因植株提取的蛋白；3，4為pCAMBIA1390-CB3.基因植株提取的蛋白，其中，3為人工合成的CB3,4為按照同尾酶的的方法串聯(lián)的CB3; — :為陰性對照。圖22為瓊脂糖擴(kuò)散法測抑菌活性檢測的抑菌活性柱形圖，其中A為金黃色葡萄球菌；B為沙門桿菌；I為PCAMBIA1390R-CB轉(zhuǎn)基因植株提取的蛋白；2為pCAMBIA1390R-CB2轉(zhuǎn)基因植株提取的蛋白；3，4為pCAMBIA1390_CB3轉(zhuǎn)基因植株提取的蛋白，其中，3為人工合成的CB3,4為按照同尾酶的的方法串聯(lián)的CB3。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I植物雙元表達(dá)載體PCAMBIA1390R的構(gòu)建
PCAMBIA1390R質(zhì)粒為本實(shí)驗室構(gòu)建，是以植物表達(dá)載體pCAMBIA1390為基本骨架，用內(nèi)切與Bgll進(jìn)行酶切，回收得載體大片段；與體外合成的花椰菜花葉病毒CaMV35S啟動子進(jìn)行連接，獲得了含有CaMV35S啟動子的植物表達(dá)載體，命名為pCAMBIA1390R。PCAMBIA1390R質(zhì)粒圖譜見圖I。
實(shí)施例2植物表達(dá)載體pCAMBIA1390R-CB構(gòu)建及轉(zhuǎn)化
I、根據(jù)GenBank上登錄的CecropinB堿基序列，應(yīng)用Primer Premier 5. 0軟件按照植物偏好密碼子將CB堿基序列重新改造，人工合成單基因CB，其堿基序列如序列表SEQ IDNO. I所示。設(shè)計引物
PlCGG GGTACC ATGAACTTCGCGAAGATCCT
P2 AAAACTGCAG TCACTTCCCTATTGCTTTAG以人工合成單基因CB模板，PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件94. (TC預(yù)變性5min，94. (TC變性35s，65. (TC退火35s，72. (TC延伸35s，30個循環(huán)，72. (TC后延伸2min，4°C保存至結(jié)束。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測條帶正確且無非特異性條帶后，用PCR清潔回收試劑盒純化回收，回收單基因CB。將回收的單基因CB片段與Pucl9_T在16°C水浴下過夜連接，連接體系如下
表I連接反應(yīng)體系
權(quán)利要求
1.ー種植物表達(dá)載體，它是在植物表達(dá)體PCAMBIA1390中插入了 CaMV35S啟動子，命名為pCAMBIA1390R ;在pCAMBIA1390R中插入其堿基序列如序列表SEQ ID NO. 3、2或I的基因，分別命名為 pCAMBIA1390RCB3、pCAMBIA1390RCB2 和 pCAMBIA1390RCB。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的ー種植物表達(dá)載體，其特征在于所述的表達(dá)載體為pCAMBIA1390RCB3o
3.—種雜合抗菌妝天香素B的基因,其喊基序列如序列表SEQ ID NO. 3所不。
4.根椐權(quán)利要求3所述的ー種雜合抗菌肽天蠶素B的基因，所述的雜合抗菌肽天蠶素B的基因為人工合成。
5.ー種轉(zhuǎn)基因植物的生產(chǎn)方法，其特征在于權(quán)利要求I所述的植物表達(dá)載體通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)，轉(zhuǎn)化至苜蓿中，獲得含抗菌肽天蠶素B的轉(zhuǎn)基因苜蓿。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的ー種轉(zhuǎn)基因植物的生產(chǎn)方法,所述的植物表達(dá)載體為權(quán)利要求2所述的植物表達(dá)載體。
7.利用苜蓿作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)天蠶素抗菌肽B的方法，種植按權(quán)利要求5方法獲得的含抗菌肽天蠶素B的轉(zhuǎn)基因苜蓿，提取抗菌肽天蠶素B。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗菌肽天蠶素B(CB)及雜合抗菌肽天蠶素B(CB2、CB3)，在植物表達(dá)體pCAMBIA1390中插入了CaMV35S啟動子，獲得pCAMBIA1390R；分別插入CB、CB2、CB3基因，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化至苜蓿中，獲得了轉(zhuǎn)基因苜蓿。通過實(shí)驗證明，CB、CB2、CB3基因已整合到苜蓿的基因組中，轉(zhuǎn)基因苜蓿對金黃色葡萄球菌、沙門桿菌有抑制活性，而野生型苜蓿沒有抑制活性，CB3轉(zhuǎn)基因植株的抑菌活性最高。苜蓿本身就具有抗逆性強(qiáng)、適應(yīng)范圍廣、利用年限長、再生性強(qiáng)及每年可以收獲多次的特點(diǎn)；而由于轉(zhuǎn)基因苜蓿轉(zhuǎn)入了抗菌肽基因，更加提高了其抗病能力，利用轉(zhuǎn)基因苜蓿作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)抗菌肽天蠶素B，可以更大地降低了生產(chǎn)抗菌肽天蠶素B的成本。
文檔編號C12N15/82GK102776226SQ20121025425
公開日2012年11月14日 申請日期2012年7月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月23日
發(fā)明者萬秋, 劉秀明, 李校堃, 李海燕, 杜淑環(huán) 申請人:吉林農(nóng)業(yè)大學(xué), 溫州醫(yī)學(xué)院