專利名稱：三種細菌的pcr檢測引物及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及PCR引物，具體地，涉及三種細菌的PCR檢測引物。
背景技術：
多重PCR的主要用于多種病原微生物的同時檢測或鑒定和病原微生物，某些遺傳病及癌基因的分型鑒定。多種病原微生物的同時檢測或鑒定，是在同一 PCR反應管中同時加上多種病原微生物的特異性 引物，進行PCR擴增?？捎糜谕瑫r檢測多種病原體或鑒定出是那一型病原體感染，可系統組合的有①肝炎病毒的感染，在同一病人或同一供血者體內，有時存在多種肝炎病毒重疊感染，有時是甲乙丙型肝炎病毒重疊；有時可能是甲乙型肝炎病毒重疊；有時是乙丙型肝炎病毒重疊。②腸道致病性細菌的檢測，如傷寒，痢疾和霍舌L有時具有較相同的腸道癥狀，有時痢疾霍亂同存一病人并同時發(fā)病。③性病的檢測，如梅毒，淋病及艾滋病的診斷。④戰(zhàn)傷細菌及生物戰(zhàn)劑細菌的檢測，如破傷風桿菌，產氣莢膜桿菌，炭疽桿菌，鼠疫桿菌等偵檢。⑤需特殊培養(yǎng)的無芽胞厭氧菌，如脆弱類桿菌、艱難桿菌的鑒定等。多重PCR的特點有①高效性，在同一 PCR反應管內同時檢出多種病原微生物，或對有多個型別的目的基因進行分型，特別是用一滴血就可檢測多種病原體。②系統性，多重PCR很適宜于成組病原體的檢測，如肝炎病毒，腸道致病性細菌，性病，無芽胞厭氧菌，戰(zhàn)傷感染細菌及細菌戰(zhàn)劑的同時偵檢。③經濟簡便性，多種病原體在同一反應管內同時檢出，將大大的節(jié)省時間，節(jié)省試劑，節(jié)約經費開支，為臨床提供更多更準確的診斷信息。在多重PCR反應體系中，引物之間的相互作用嚴重影響著多重PCR的結果，故在多重PCR建立之初需要明確引物之間存在怎樣的相互影響。除引物之間的相互影響外，引物的濃度對多重PCR的穩(wěn)定性和靈敏度也有重要影響。目前國內還未出現針對脂環(huán)酸芽孢桿菌、大腸埃希氏菌、沙門氏菌的多重PCR檢測引物及檢測方法。

發(fā)明內容
本發(fā)明要解決的技術問題是克服現有的缺陷，提供了一種針對脂環(huán)酸芽孢桿菌、大腸埃希氏菌、沙門氏菌同時進行檢測的多重PCR檢測引物，本發(fā)明建立的多重PCR檢測方法的最大優(yōu)勢就是實現了 “一管三檢”，不僅提高了檢測效率，還降低了檢測過程中因操作導致的誤差。本發(fā)明提供了如下的技術方案
三種細菌的PCR檢測引物，其中，三種細菌為脂環(huán)酸芽孢桿菌、大腸埃希氏菌、沙門氏菌，包括以下3對引物
脂環(huán)酸芽孢桿菌的檢測引物
上游引物 SEQ ID NO. I :5’-AAAACGGCAAGAAAAAGCAG-3’
下游引物 SEQ ID NO. 2 :5’ -ACGCGTGGTTACAGTCTTGCG-3’大腸埃希氏菌的檢測引物
上游引物 SEQ ID NO. 3 :5’ -AAAACGGCAAGAAAAAGCAG-3’
下游引物 SEQ ID NO. 4 :5’-ACGCGTGGTTACAGTCTTGCG-3’
沙門氏菌的檢測引物
上游引物 SEQ ID NO. 5 :5’ -TACTTAACAGTGCTCGITTAC-3’
下游引物 SEQ ID NO. 6 :5’ -ATAAACTTCATCGCACCGTCA-3’
三種細菌的PCR檢測弓I物在脂環(huán)酸芽孢桿菌、大腸埃希氏菌、沙門氏菌PCR檢測中的應用。本發(fā)明具有以下有益效果
本研究嘗試用多重PCR檢測脂環(huán)酸芽孢桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和大腸埃希氏菌。由于沒有果汁中細菌多重PCR檢測方法的相關報道，故與常規(guī)方法比較后發(fā)現，本研究建立的三重PCR檢測方法有相同的靈敏度，并能實現一個反應檢測3種污染菌，大大提高了檢測效率。在人工模擬試驗中，建立的三重PCR檢測方法能夠在小于100個菌體每毫升的染菌量下擴增出特異性條帶，說明該檢測方法符合實際檢測要求。另外，當前用于果汁污染菌檢測的PCR技術由于受到不能區(qū)分病原菌的死活而在實際應用中受到限制，而本試驗對樣品先進行預增菌，再取增菌液進行檢測，檢測的是活的菌體。這雖然較直接從樣品中提取基因組進行檢測多耗費時間，但增菌過程在大大的提高了多重PCR檢測敏感性的同時，還避免了果汁中其他成分對DNA提取的影響以及DNA污染所帶來的假陽性結果。本試驗建立的三重PCR檢測試劑盒，通過實驗表明其有良好的特異性、敏感性和穩(wěn)定性，能夠滿足果汁生產過程和日常衛(wèi)生監(jiān)測的需要。相比常規(guī)方法而言，該試劑盒的檢測在保證準確性的前提下，將7個工作日的檢測時間縮減為I晝夜，大大提高了檢測效率。PCR本身的檢測成本較常規(guī)方法低，故在經濟上也存在優(yōu)勢。相比單重PCR，本研究建立的多重PCR檢測方法的最大優(yōu)勢就是實現了“一管三檢”，不僅提高了檢測效率，還降低了檢測過程中因操作導致的誤差。另外，由于試劑盒內的試劑為預混裝，在簡化了操作步驟的同時，也減少了操作失誤和外界污染的概率。隨著PCR方法的不斷改進和優(yōu)化，多重PCR檢測試劑盒也將廣泛應用于各種臨床檢測和生產質控。


附圖用來提供對本發(fā)明的進一步理解，并且構成說明書的一部分，與本發(fā)明的實施例一起用于解釋本發(fā)明，并不構成對本發(fā)明的限制。在附圖中
圖I是不同退火溫度對大腸埃希氏菌PCR擴增的影響的電泳 圖2是不同退火溫度對脂環(huán)酸芽孢桿菌PCR擴增的電泳 圖3是不同退火溫度對沙門氏菌PCR擴增的影響的電泳 圖4是引物濃度對脂環(huán)酸芽孢桿菌PCR的影響的電泳 圖5是引物濃度對大腸埃希氏菌PCR的影響的電泳 圖6是引物濃度對沙門氏菌PCR的影響的電泳 圖7是兩種多重PCR檢測的敏感性的電泳 圖8是在不同濃度的重組質粒條件下三重PCR的電泳 圖9是針對沙門氏菌、脂環(huán)酸芽孢桿菌和大腸埃希氏菌的三重PCR檢測試劑盒的穩(wěn)定性檢測電泳圖。在附圖中，給出以下附圖標記
圖I中，M 2000bp DNA分子質量標準(從上往下依次為2000bp、IOOObp、750bp、500bp、250bp 和 IOObp ) ; I 8 依次為退火溫度 60 V、59°C、58 V、57°C、56 V、55°C、54°C和 53°C 下的大腸埃希氏菌PCR產物(147bp)；圖2中，M 2000bp DNA分子質量標準(從上往下依次為2000bp、IOOObp、750bp、500bp、250bp 和 IOObp ) ; I 8 依次為退火溫度 530C、54°C、55°C、56°C、57°C、58 V、59 V和 60 V 下的脂環(huán)酸芽孢桿菌PCR產物(298bp )；
圖3中，M 2000bp DNA分子質量標準(從上往下依次為2000bp、IOOObp、750bp、500bp、250bp 和 IOObp ) ; I 8 依次為退火溫度 530C、54°C、55°C、56°C、57°C、58 °C、59 V和 60 V 下的沙門氏菌PCR產物(570bp)；
圖4中，M 2000bp DNA分子質量標準(從上往下依次為2000bp、IOOObp、750bp、500bp、250bp 和 IOObp) ;1 8 :引物濃度為 I. 0 u M,0. 5 u M,0. 25uM,0. 125uM,62. 5nM、31. 25nM、15. 625nM和I. 8125nM下的脂環(huán)酸芽孢桿菌PCR產物(298bp)；
圖5中，M 2000bp DNA分子質量標準(從上往下依次為2000bp、IOOObp、750bp、500bp、250bp 和 IOObp) ;1 8 :引物濃度為 I. 0 u M,0. 5 u M,0. 25uM,0. 125uM,62. 5nM、31. 25nM、15. 625nM和7. 8125nM下的大腸埃希氏菌PCR產物(147bp)；
圖6中，M 2000bp DNA分子質量標準(從上往下依次為2000bp、IOOObp、750bp、500bp、250bp 和 IOObp) ;1 8 :引物濃度為 I. 0 u M,0. 5 u M,0. 25uM,0. 125uM,62. 5nM、31. 25nM、15. 625nM和7. 8125nM下的沙門氏菌PCR產物(570bp)；
圖 7 中，M:2000bp DNA 分子標準(從上往下依次為 2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp);7 為陰性對照；1 6 依次為 107CFU/mL、106CFU/mL、105CFU/mL、104CFU/mL、103CFU/mL、102CFU/mL濃度下沙門氏菌、脂環(huán)酸芽孢桿菌和大腸埃希氏菌混合模板的三重PCR產物；
圖 8 中，M 2000bp DNA 分子標準(從上往下依次為 2000bp、IOOObp、750bp、500bp、250bp、100bp) ；8 和 9 為陰性對照;1 7 依次為 2X 105、2X 104、2X 103、200、100、50、5 個/UL質粒濃度下沙門氏菌、脂環(huán)酸芽孢桿菌和大腸埃希氏菌混合模板的三重PCR產物；
圖 9 中，M:2000bp DNA 分子標準(從上往下依次為 2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp);l :保存30d后試劑盒的PCR產物(從上往下依次為570bp、298bp和147bp);
2:保存90d后試劑盒的PCR產物(從上往下依次為570bp、298bp和147bp) ；3 :保存:180d后試劑盒的PCR產物(從上往下依次為570bp、298bp和147bp)。
具體實施例方式以下結合附圖對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進行說明，應當理解，此處所描述的優(yōu)選實施例僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。試驗材料 菌種
本試驗所用的腸炎沙門氏菌(本專利中簡稱為沙門氏菌，保藏編號和大腸埃希氏菌(保藏編號-ATCC25922)均購自美國模式培養(yǎng)物集存庫(ATCC)。脂環(huán)酸芽孢桿菌(保藏編號購自德國菌種保藏中心(DSM)。其他菌株棒狀桿菌、單核細胞增生李斯特氏桿菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏桿菌、綠膿桿菌、鼠疫耶爾森氏菌和多殺性巴氏桿菌等13種菌均購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。試劑
Taq DNA聚合酶、MgCl2、dNTP、10XPCR Buffer均購自北京天根生化科技公司；瓊脂糖購自Solarbio公司；DL_2000和500Marker購自TaKaRa (大連)公司產品。待檢樣品
(I)送檢樣品來自生產過程中的濃縮果汁樣品6份、鮮榨果汁·10份、商品果汁18份和過期的果汁樣品16份。(2)人工污染樣品采用雙盲方式人工將大腸埃希氏菌、沙門氏菌、志賀氏菌、脂環(huán)酸芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌分別污染已除菌的果汁中備用。通過相關文獻證明大腸埃希氏菌的WW基因、沙門氏菌的基因和脂環(huán)酸芽孢桿菌的WsrRNA基因均為高度保守基因，因此根據GenBank中提交的基因序列，參照已發(fā)表的針對3種菌的單PCR檢測引物，應用多重PCR特異性引物設計系統
5.O引物設計軟件，設計和修飾得到3對特異性引物(表I)。
權利要求
1.三種細菌的PCR檢測引物，其中，三種細菌為脂環(huán)酸芽孢桿菌、大腸埃希氏菌、沙門氏菌，其特征在于，包括以下3對引物 脂環(huán)酸芽孢桿菌的檢測引物 上游引物 SEQ ID NO. I :5’-AAAACGGCAAGAAAAAGCAG-3’ 下游引物 SEQ ID NO. 2 :5’-ACGCGTGGTTACAGTCTTGCG-3’ 大腸埃希氏菌的檢測引物 上游引物 SEQ ID NO. 3 :5’ -AAAACGGCAAGAAAAAGCAG-3’ 下游引物 SEQ ID NO. 4 :5’ -ACGCGTGGTTACAGTCTTGCG-3’ 沙門氏菌的檢測引物 上游引物 SEQ ID NO. 5 :5’-TACTTAACAGTGCTCGITTAC-3’ 下游引物 SEQ ID NO. 6 :5’ -ATAAACTTCATCGCACCGTCA-3’。
2.權利要求I所述的三種細菌的PCR檢測引物在脂環(huán)酸芽孢桿菌、大腸埃希氏菌、沙門氏菌PCR檢測中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了三種細菌的PCR檢測引物，三種細菌為脂環(huán)酸芽孢桿菌、大腸埃希氏菌、沙門氏菌，其中，脂環(huán)酸芽孢桿菌的檢測引物為上游引物SEQIDNO.1，下游引物SEQIDNO.2；大腸埃希氏菌的檢測引物為上游引物SEQIDNO.3，下游引物SEQIDNO.4；沙門氏菌的檢測引物為上游引物SEQIDNO.5，下游引物SEQIDNO.6。本發(fā)明建立的多重PCR檢測方法的最大優(yōu)勢就是實現了“一管三檢”，不僅提高了檢測效率，還降低了檢測過程中因操作導致的誤差。
文檔編號C12N15/11GK102747162SQ20121025533
公開日2012年10月24日 申請日期2012年7月23日 優(yōu)先權日2012年7月23日
發(fā)明者劉磊, 張亮, 郭玉蓉 申請人:甘肅農業(yè)大學