一種基于雙酶偶聯(lián)高通量檢測微生物生產(chǎn)二元酸的新方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種基于雙酶偶聯(lián)反應(yīng)的高通量檢測微生物生產(chǎn)二元酸的新方法，具體涉及利用二元酸氧化酶和過氧化物酶偶聯(lián)，在相應(yīng)緩沖溶液中與二元酸的反應(yīng)，產(chǎn)生熒光底物Resorufin。雙酶偶聯(lián)反應(yīng)在96孔黑色微孔板中進(jìn)行，利用酶標(biāo)儀讀取Ex/Em?490/585(nm)處的熒光值。二元酸與雙酶偶聯(lián)反應(yīng)生成產(chǎn)物在Ex/Em?490/585(nm)處的熒光值與其濃度成線性關(guān)系，能夠根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算濃度，并利用酶標(biāo)儀和96孔黑色微孔板進(jìn)行高通量檢測。
【專利說明】—種基于雙酶偶聯(lián)高通量檢測微生物生產(chǎn)二元酸的新方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于工業(yè)微生物篩選和開發(fā)利用領(lǐng)域，特別涉及一種基于雙酶偶聯(lián)反應(yīng)的高通量檢查微生物生產(chǎn)二元酸的檢測方法。
技術(shù)背景
[0002]從自然界篩選并在實驗室誘變進(jìn)化一直是發(fā)現(xiàn)和創(chuàng)新工業(yè)微生物菌種的重要途徑，是工業(yè)生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的基礎(chǔ)。代謝工程極大的促進(jìn)了應(yīng)用于工業(yè)的各種化合物的工程菌株的改進(jìn)。特別是近數(shù)十年來，代謝工程邁向了新的階段——系統(tǒng)代謝工程。系統(tǒng)代謝工程與具有全局理念的系統(tǒng)生物學(xué)、具有精細(xì)設(shè)計能力的合成生物學(xué)以及理性-隨機突變的進(jìn)化工程有機整合一起，使得代謝工程有了更廣泛的應(yīng)用，能夠更加省時省力地生產(chǎn)天然的以及非天然的化學(xué)品、燃料和聚合物。例如，關(guān)鍵酶通過系統(tǒng)與合成生物學(xué)的方法協(xié)同改造或者構(gòu)建，然后通過系統(tǒng)生物學(xué)的研究方法找出提高產(chǎn)量的瓶頸或者抑制細(xì)胞生長的未知因素來改變?nèi)执x網(wǎng)絡(luò)；通過進(jìn)化工程獲得的菌株可以利用系統(tǒng)生物學(xué)的方法闡明突變進(jìn)化位點，等等。盡管隨著代謝工程和合成生物學(xué)的發(fā)展，各種生物基化學(xué)品生產(chǎn)菌的構(gòu)建和合成變得相對比較容易，但是由于生物體的復(fù)雜性和人類認(rèn)識的局限性，設(shè)計合成得到的工程菌經(jīng)常不能完全達(dá)到高效生產(chǎn)的要求，仍然需要通過誘變或進(jìn)化的方法實施進(jìn)一步優(yōu)化，彌補設(shè)計和合成的不足。要實現(xiàn)生物基化學(xué)品生產(chǎn)菌的高效誘變和進(jìn)化改造、優(yōu)化通常離不開高通量篩選方法。只有高通量篩選方法的建立，并結(jié)合先進(jìn)的現(xiàn)代自動化技術(shù)和儀器設(shè)備才能大大突破人工篩選在速度、效率和標(biāo)準(zhǔn)化等方面的限制，這將是微生物菌種篩選和改造的一次技術(shù)革命。一個方便快捷的篩選檢測方法不但可以簡化篩選步驟，減少科研人員的工作量，而且可以大大促進(jìn)代謝工程的發(fā)展。
[0003]二元酸在工業(yè)和能源方面有著重要應(yīng)用，在能源日益枯竭的今天，利用生物質(zhì)來產(chǎn)生這些工業(yè)原料以及能源有著舉足輕重的意義。用微生物細(xì)胞工廠生產(chǎn)二元酸，原料來自可再生的生物質(zhì)資源，而不必消耗石油等不可再生資源，生產(chǎn)過程完全采用生物過程，不使用有毒有害的化學(xué)試劑，也不產(chǎn)生任何環(huán)境污染物。一旦經(jīng)濟上可行的生物合成生產(chǎn)工藝被推廣使用，可以促進(jìn)經(jīng)濟的發(fā)展和解決困擾制約國家國民經(jīng)濟發(fā)展的生態(tài)環(huán)境問題，保持國家安全、穩(wěn)定和可持續(xù)發(fā)展，創(chuàng)造重大的社會經(jīng)濟效益。
[0004]但是傳統(tǒng)定性或定量檢測二元酸的方法非常有限，以丁二酸為例，主要的檢測方法有液相色譜法、氣相色譜法、反相高效液相色譜法以及試劑盒檢測。液相色譜法操作比較繁瑣，靈敏度較低，如果檢測樣品較多，也會存在保留時間的偏移等問題。使用試劑盒檢測丁二酸不但價格昂貴，而且對樣品的純度要求嚴(yán)格，會受其他物質(zhì)的干擾。試劑盒檢測需要依賴于NADH，但是NADH相當(dāng)昂貴，且需要在340nm出測定吸光值，因此就需要紫外檢測器，增加了檢測 的費用。因此，研究建立簡便、快速、準(zhǔn)確和應(yīng)用廣泛的二元酸分析方法倍受重視，不僅可以促進(jìn)生物法生產(chǎn)二元酸的理論研究及產(chǎn)業(yè)化，同時對于其他生物產(chǎn)品，如支鏈醇、氨基酸的檢測和工程菌株篩選等也有很好的借鑒作用。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]【本發(fā)明的目的】
[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種基于雙酶偶聯(lián)反應(yīng)的高通量檢測微生物生產(chǎn)以丁二酸為代表的二元酸的新方法。通過二元酸氧化酶和過氧化物酶偶聯(lián)的方法測定二元酸，高通量篩選目標(biāo)微生物。與傳統(tǒng)微生物篩選方法相比，基于雙酶偶聯(lián)反應(yīng)的高通量篩選方法具有成本低、效率高、目的性強的優(yōu)點，而使用熒光信號檢測大大增加了檢測的靈敏度，能夠從廣泛的自然界中篩選性能優(yōu)良的菌株。
[0007]【本發(fā)明的思路】
[0008]利用二元酸氧化酶和過氧化物酶偶聯(lián)的方法，測定二元酸含量。該方法包含兩個方面內(nèi)容。一方面，在氧氣存在條件下，二元酸被其氧化酶氧化，生成過氧化氫，形成的過氧化氫與4-安替比林和苯酚在過氧化氫酶作用下形成一種紅色物質(zhì)醌亞胺。醌亞胺是一種紅色物質(zhì)，在500nm處有特征吸收值。另一方面,二元酸被其氧化酶作用形成的過氧化氫與AmplexUltraRed在過氧化物酶作用下形成Resorufin。Resorufin是一種突光底物,在給定了激發(fā)光波長后，檢測Ex/Em490/585(nm)處的熒光值，即可反映出待檢測二元酸的量?；陔p酶偶聯(lián)的熒光法與化學(xué)顯色法相比具有更高的靈敏度和精確度，本專利著重講述前者。微生物代謝產(chǎn)生的二元酸通過96孔黑色微孔板和酶標(biāo)儀，利用雙酶偶聯(lián)方法分析檢測代謝產(chǎn)物，篩選高產(chǎn)各種二元酸的菌株，為基礎(chǔ)和應(yīng)用研究提供寶貴的菌種資源。
[0009]【本發(fā)明的技術(shù)路線】
[0010]本發(fā)明的技術(shù)路線如下:
[0011](I)利用培養(yǎng)基將待篩選樣品進(jìn)行活化培養(yǎng)12-24小時；
[0012](2)將富集培養(yǎng)的混合菌利用無菌水進(jìn)行稀釋(獲得單菌落)，涂布到固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)6-12小時；
[0013](3)將固體培養(yǎng)基上長出的單菌落轉(zhuǎn)接到含有液體培養(yǎng)基的96深孔培養(yǎng)板中，每個孔接種一個單菌落，用硅膠蓋蓋好，培養(yǎng)6-24小時；
[0014](4)將96深孔培養(yǎng)板利用冷凍離心機進(jìn)行離心，使菌體沉淀；
[0015](5)取96深孔培養(yǎng)板中的上清液與延胡索酸還原酶和過氧化物酶在96孔黑色微孔板中反應(yīng)，37°C保溫30分鐘；
[0016](6)將反應(yīng)結(jié)束的96孔黑色微孔板利用酶標(biāo)儀測定Ex/Em(490/585)處熒光值，并將測定的熒光值與利用延胡索酸還原酶和過氧化物酶測定醇的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行對比，查到丁二酸的濃度；
[0017](7)將測定產(chǎn)二元酸濃度高的生產(chǎn)菌株進(jìn)行保存。
[0018]【本發(fā)明的優(yōu)點】
[0019]本發(fā)明的優(yōu)點是:
[0020](I)效率高，二元酸氧化酶和過氧化物酶偶聯(lián)能夠快速檢測二元酸的含量。
[0021](2)靈敏度高，利用AmpIexUltraRed與H2O2反應(yīng)，可以精確檢測到I μ M的底物。
[0022](3)通量高，96深孔培養(yǎng)板和96孔黑色微孔板并結(jié)合酶標(biāo)儀一起使用，使得目的菌株的篩選速度大大 提高。
[0023](4)成本低，能夠以較低成本獲得大量菌種。
[0024](5)可以獲得更多菌株，為基礎(chǔ)和應(yīng)用研究提供菌種資源。[0025]具體實施
[0026]以下為列舉的實施例，以便于更好地理解本發(fā)明。
[0027]實施例1
[0028]雙酶偶聯(lián)的熒光法與化學(xué)顯色法比較。
[0029](I)突光法。試劑 A:AmpIexUltraRed:0.1mM，過氧化物酶:9U/mL,PBS:pH 7.4。過氧化氫溶液:0.1mM。步驟:在96孔黑色微孔板上依次加入不同濃度的H2O2 (PBS稀釋)50uL，試劑 A 50 μ L,總體積為 100 μ L,測定 Ex/Em490/585 (nm)熒光值。建立 Ex/Em 490/585 (nm)熒光值與H2O2濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線(附圖1)，R2 = 0.992，說明雙酶偶聯(lián)的熒光法可以檢測到4皿級的!1202。 [0030](2)化學(xué)顯色法。Buffer I中各物質(zhì)含量為:苯酌.:6mmol/mL,EDTA:75mg/L,磷酸鹽緩沖液:pH = 7.5,0.lmol/L。BufferII中各物質(zhì)含量為:過氧化氫酶:600U/L，4_安替比林:3.5m mol/L,磷酸鹽緩沖液0.lmol/L pH = 7.5。步驟:在96孔酶標(biāo)板中先后加入不同濃度的 H2O2 25 μ L, Buffer I 100 μ L, Buffer ΙΙ50μ L0 測定 0D500nm 處吸光值，建立0D500nm吸光值與H2O2濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，R2 = 0.0351 (附圖2)，說明濃度為uM級別的H2O2與0D500nm處的吸收值無線性關(guān)系。為檢測化學(xué)顯色法能夠測定H2O2的最低濃度，將H2O2濃度增加10倍，重復(fù)上述實驗，測定0D500nm處吸光值，建立0D500nm吸光值與H2O2濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，R2 = 0.991 (附圖3)，說明化學(xué)顯色法能夠較準(zhǔn)確的測定10 μ M級的H2O2,也說明雙酶偶聯(lián)的熒光法比化學(xué)顯色法靈敏10倍以上。
[0031]實施例2
[0032]利用延胡索酸還原酶和過氧化物酶偶聯(lián)的方法測定丁二酸的熒光值隨時間變化及測定時間的確定。試劑A:AmpIexUltraRed:0.1mM,過氧化物酶:9U/mL,PBS:pH 7.4。延胡索酸還原酶粗酶液:重組大腸桿菌E.coli BL21(pET-30a-frd)誘導(dǎo)表達(dá)后用蛋白抽提試劑處理獲取粗酶液。配制丁二酸溶液ImM。步驟:在96孔黑色微孔板上依次加入PBS20 μ L，ImM 丁二酸(PBS稀釋)10 μ L，50 μ L試劑Α，延胡索酸還原酶粗酶液20 μ L，總體積IOOuL0對照組不加丁二酸。設(shè)置酶標(biāo)儀溫度為37°C，讀取0-30min每隔5min的Ex/Em490/585 (nm)熒光值。從時間變化圖(附圖4)中可以看出，延胡索酸還原酶粗酶液對丁二酸有明顯的氧化作用，且突光值在25min時穩(wěn)定，因此設(shè)定雙酶偶聯(lián)作用時間為30min后檢測熒光值是可取的。
[0033]實施例3
[0034]利用延胡索酸還原酶和過氧化物酶偶聯(lián)的方法測定丁二酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線。試劑A:AmplexUltraRed:0.1mM,過氧化物酶:9U/mL,PBS:pH 7.4。延胡索酸還原酶粗酶液:重組大腸桿菌E.coli BL21(pET-30a-frd)誘導(dǎo)表達(dá)后用蛋白抽提試劑處理獲取粗酶液。配制丁二酸溶液ImM。步驟:在96孔黑色微孔板上依次加入不同濃度丁二酸(PBS稀釋)30μ L，試劑A 50uL,延胡索酸還原酶粗酶液20 μ L，總體積100uL。37°C保溫30min，讀取Ex/Em490/585 (nm)熒光值。建立Ex/Em 490/585 (nm)熒光值與丁二酸濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線(附圖5)，R2 = 0.998，說明丁二酸濃度在一定范圍內(nèi)與測定的Ex/Em 490/585 (nm)熒光值呈顯著線性關(guān)系。
[0035]實施例4
[0036]LB培養(yǎng)基及M9鹽基本培養(yǎng)基對利用延胡索酸還原酶和過氧化物酶偶聯(lián)的方法測定丁二酸方法的影響。試劑 A:AmpIexUltraRed:0.1mM,過氧化物酶:9U/mL, PBS:pH 7.4。延胡索酸還原酶粗酶液:重組大腸桿菌E.coli BL21 (pET-30a-frd)誘導(dǎo)表達(dá)后用蛋白抽提試劑處理獲取粗酶液。配制丁二酸溶液ImM，LB培養(yǎng)基，LB培養(yǎng)基稀釋10倍，M9鹽培養(yǎng)基，M9鹽培養(yǎng)基稀釋10倍。步驟:在96孔黑色微孔板上依次加入不同濃度丁二酸(PBS稀釋)30 μ L，試劑A 50uL,延胡索酸還原酶粗酶液20 μ L，總體積100 μ L，并將PBS依次替換為Μ9鹽培養(yǎng)基，Μ9鹽培養(yǎng)基稀釋10倍，LB培養(yǎng)基，LB培養(yǎng)基稀釋10倍。所有樣品37°C保溫30min，讀取Ex/Em 490/585 (nm)熒光值。LB培養(yǎng)基由于組分的復(fù)雜性，其對雙酶偶聯(lián)的方法干擾較大(附圖6)，因此不適合作為篩選二元酸的基本培養(yǎng)基。而M9鹽培養(yǎng)基則對雙酶偶聯(lián)檢測方法的影響較小(附圖7)，可以忽略，是篩選二元酸的最適基本培養(yǎng)基。
[0037]實施例5
[0038]取一株本實驗室產(chǎn)丁二酸的大腸桿菌菌株(命名為CK，Kan+)做此酶聯(lián)方法驗證。5mL LB培養(yǎng)基(含Kan抗性)過夜活化，培養(yǎng)條件為37°C，200rpm。以5 %的接種量接種至30mL M9鹽培養(yǎng)基中，進(jìn)行產(chǎn)丁二酸的發(fā)酵。(接種前需做去除LB培養(yǎng)基的處理:12000rpm離心2min，棄上清，用M9鹽培養(yǎng)基重懸。)發(fā)酵條件為37°C，200rpm。取12h發(fā)酵液，12000rpm離心4min，保留上清。
[0039]分別利用延胡索酸還原酶和過氧化物酶偶聯(lián)的方法以及高效液相法測定丁二酸濃度。雙酶偶聯(lián)的步驟:在96孔黑色微孔板上依次加入待測菌液30uL，試劑A 50uL,延胡索酸還原酶粗酶液20 μ L，總體積100 μ L，。反應(yīng)體系置37 °C，30min,測定Ex/Em490/585 (nm)熒光值。雙酶偶聯(lián)的方法及高效液相法得到的丁二酸濃度分別為0.02259mM,
0.022941Mm(附圖8)。兩個數(shù)據(jù)基本吻合，在誤差范圍內(nèi)，說明雙酶偶聯(lián)的方法測定丁二酸在一定條件下是可靠的。
【專利附圖】

【附圖說明】:
[0040]附圖1:熒光法檢測H2O2的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0041]附圖2:顯色法檢測H2O2的標(biāo)準(zhǔn)曲線⑴。
[0042]附圖3:顯色法檢測H2O2的標(biāo)準(zhǔn)曲線(2)。
[0043]附圖4:丁二酸與雙酶偶聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)物在Ex/Em 490/585 (nm)熒光值隨時間的變化曲線。
[0044]附圖5:丁二酸濃度與雙酶偶聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)物在Ex/Em 490/585 (nm)熒光值之間建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0045]附圖6:LB培養(yǎng)基對延胡索酸還原酶和過氧化物酶雙酶偶聯(lián)方法檢測丁二酸的影響。
[0046]附圖7:M9鹽培養(yǎng)基對延胡索酸還原酶和過氧化物酶雙酶偶聯(lián)方法檢測丁二酸的影響。
[0047]附圖8:延胡索酸還原酶和過氧化物酶雙酶偶聯(lián)方法及高效液相法測定大腸桿菌12h發(fā)酵液中丁二酸濃度的比較。
【權(quán)利要求】
1.一種利用二元酸氧化酶和過氧化物酶偶聯(lián)反應(yīng)的檢測微生物生產(chǎn)二元酸的高通量檢測新方法，步驟如下: (1)將培養(yǎng)基活化菌群經(jīng)稀釋后涂布到固體培養(yǎng)基中，待單菌落長出后接種到96深孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)； (2)將96深孔培養(yǎng)板利用冷凍離心機在合適的條件下離心，取其上清液進(jìn)行測定； (3)利用雙酶偶聯(lián)的方法，在96孔黑色微孔板中結(jié)合試劑A測定上述上清液中二元酸含量;
2.按權(quán)利要求1中所述的方法，其特征是:所述的96深孔培養(yǎng)板是體積為3mL，但是每孔中加入0.5-2mL的培養(yǎng)基；
3.按權(quán)利要求1中所述的方法，其特征是:所述的冷凍離心機能夠直接離心96深孔培養(yǎng)板；
4.按權(quán)利要求1中所述的方法，其特征是:所述的離心條件為4°C，4000rpm離心10_60min ；
5.按權(quán)利要求1中所述的方法，其特征是:所述的上清液中不能含有菌體；
6.按權(quán)利要求1中所述的方法，其特征是:所述的雙酶是二元酸氧化酶和過氧化物酶；
7.按權(quán)利要求1中所述的方法，其特征是:所述的試劑A中各物質(zhì)含量為:AmplexUltraRed:0.05-1.0mM，過氧化物酶:0.1-lOU/mL，PBS:pH 7.4。
8.按權(quán)利要求1中所述的方法，其特征是:待試劑A、二元酸氧化酶及樣品加入到其中后在37°C下反應(yīng)5-60min ；
9.按權(quán)利要求1中所述的方法，其特征是:所述的測定條件為:Ex/Em490/585 (nm)。
【文檔編號】C12Q1/28GK103571915SQ201210255817
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2012年7月19日 優(yōu)先權(quán)日:2012年7月19日
【發(fā)明者】王欽宏, 孫琳, 涂然, 齊顯尼, 姜丹, 馬延和 申請人:天津工業(yè)生物技術(shù)研究所