專利名稱：調(diào)節(jié)核酸的甲基化/去甲基化狀態(tài)的方法和試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)和藥學(xué)領(lǐng)域；更具體地，本發(fā)明涉及調(diào)節(jié)核酸的甲基化/去甲基化狀態(tài)的方法和試劑。
背景技術(shù)：
在表觀調(diào)控中，現(xiàn)在機制了解最清楚的是胞嘧啶第5位的甲基化。胞嘧啶甲基化直接參與到了轉(zhuǎn)錄調(diào)控和基因組的其他調(diào)控過程中。因為胞嘧啶的甲基化會引起染色體的壓縮和基因的沉默，所以對于活躍表達的基因來說，它們的啟動子和促進子區(qū)域的DNA往往處于低甲基化水平狀態(tài)。因此，DNA的去甲基化對于沉默基因的轉(zhuǎn)錄激活也起到了重要作用?！?br> 現(xiàn)在，特定基因位點的去甲基化和基因組規(guī)模的去甲基化都已有報道。例如，雌激素受體的目標基因PS2的啟動子區(qū)域在基因的沉默和表達循環(huán)過程中是存在主動去甲基化的。對于基因組規(guī)模的去甲基化，這種現(xiàn)象在原始生殖細胞中出現(xiàn)，被認為對于擦除父母甲基化模式并在生殖細胞中建立配子特異的甲基化譜式起到重要作用；在受精后，精子基因組的重塑也伴隨著父源基因組的大規(guī)模去甲基化，這種現(xiàn)象很可能對于早期胚胎的發(fā)育是重要的?，F(xiàn)在，對于主動的去甲基化機制有多種解釋，包括打開C-C鍵直接將甲基基團從甲基胞嘧啶上切除，酶促反應(yīng)將甲基基團以甲醛的形式從5hmC上移除，以及通過DNA剪切修復(fù)途徑(BER和NER)將甲基胞嘧啶直接替換。但是，現(xiàn)在還沒有任何一種途徑通過生物化學(xué)或者遺傳的操作在哺乳動物中得到驗證。理論上講，這些途徑都可以被Tet氧化5mC為5hmC來啟動。基于5hmC在干細胞生物學(xué)和癌癥中的重要性，近年來Tet介導(dǎo)的羥甲基化的研究是一個熱點。已經(jīng)有多項證據(jù)顯示Tetl的功能可以逆轉(zhuǎn)起始性的DNA甲基化。但是，DNA的去甲基化即如何將甲基化的胞嘧啶逆轉(zhuǎn)成胞嘧啶是如何實現(xiàn)的依然未知。因此，研究DNA的甲基化/去甲基化機制，找到調(diào)節(jié)DNA的甲基化/去甲基化的關(guān)鍵分子或方法，是本領(lǐng)域人員需要進一步探索的，有助于從根本上了解DNA的修飾或變異。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供調(diào)節(jié)核酸的甲基化/去甲基化狀態(tài)的方法和試劑。在本發(fā)明的第一方面，提供一種DNA去甲基化的方法，包括(I)以Tet雙加氧酶處理DNA，將DNA中5_甲基胞嘧啶(5mC)或5_羥甲基胞嘧啶(5hmC)轉(zhuǎn)變?yōu)?-羧基胞嘧啶(5caC)；(2)以胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)處理步驟(I)獲得的DNA，將DNA中5-羧基胞嘧啶切除。(3)通過DNA剪切修復(fù)途徑(BER或NER)，在5_羧基胞嘧啶切除位點加上非甲基化的胞嘧啶。在一個優(yōu)選例中，步驟(2)中以胸腺卩密唳DNA糖基化酶處理DNA的同時,還加入GADD45A (Growth arrest andDNA-damage-inducible 45, alpha)。在一個優(yōu)選例中，所述的方法為非(疾病)治療方法，以及非(疾病)診斷方法。在另一優(yōu)選例中，所述的方法是體外方法。在另一優(yōu)選例中，所述方法還包括在本發(fā)明的另一方面，提供一種將DNA中5-甲基胞嘧啶(5mC)或5_羥甲基胞嘧啶(5hmC)轉(zhuǎn)變?yōu)?-羧基胞嘧啶(5caC)的方法，包括以Tet雙加氧酶處理DNA。(較佳地，所述方法為非治療性和非診斷性的)。在另一優(yōu)選例中，在以Tet雙加氧酶處理DNA時，還包括加入Fe2+和/或2_酮戊二酸；或加入可形成(如通過水解)Fe2+和/或2-酮戊二酸的物質(zhì)。
在另一優(yōu)選例中，以胸腺嘧啶DNA糖基化酶處理DNA的同時，還加入GADD45A。在本發(fā)明的另一方面，提供一種將DNA中5-羧基胞嘧啶切除的方法，包括以胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)處理DNA。較佳地，所述方法為非治療性和非診斷性的。在本發(fā)明的另一方面，提供Tet雙加氧酶或其促進劑的用途，用于將DNA中5-甲基胞嘧啶(5mC)或5-羥甲基胞嘧啶(5hmC)轉(zhuǎn)變?yōu)?-羧基胞嘧啶(5caC);或用于制備將DNA中5-甲基胞嘧啶(5mC)或5-羥甲基胞嘧啶(5hmC)轉(zhuǎn)變?yōu)?-羧基胞嘧啶(5caC)的組合物。較佳地，所述用途為非治療性和非診斷性的。在另一優(yōu)選例中，所述的Tet雙加氧酶包括Tetl、Tet2或Tet3或它們的保留催化結(jié)構(gòu)域并具有催化活性的片段或衍生物(如Tetl⑶、Tet2⑶或Tet3⑶)。在另一優(yōu)選例中，所述的Tet雙加氧酶的促進劑是可重組表達Tet雙加氧酶的表達載體。例如，PCDNA4載體，其中包含Tet雙加氧酶(包括Tetl、Tet2或Tet3或它們的保留催化活性的片段或衍生物(如Tetl⑶、Tet2⑶或Tet3⑶))的基因表達盒。在本發(fā)明的另一方面，提供Tet雙加氧酶的抑制劑的用途，用于抑制DNA中5_甲基胞嘧啶(5mC)或5-羥甲基胞嘧啶(5hmC)轉(zhuǎn)變?yōu)?-羧基胞嘧啶(5caC);或用于制備抑制DNA中5-甲基胞嘧啶(5mC)或5-羥甲基胞嘧啶(5hmC)轉(zhuǎn)變?yōu)?-羧基胞嘧啶(5caC)的組合物。(較佳地，所述用途為非治療性和非診斷性的)。在另一優(yōu)選例中，所述的Tet雙加氧酶的抑制劑是抗Tet雙加氧酶的抗體，干擾Tet雙加氧酶表達的干擾分子(如siRNA，shRNA)。在本發(fā)明的另一方面，提供胸腺嘧啶DNA糖基化酶或其促進劑的用途，用于將DNA中5-羧基胞嘧啶切除；或用于制備將DNA中5-羧基胞嘧啶切除的組合物。(較佳地，所述用途為非治療性和非診斷性的)。在另一優(yōu)選例中，所述的胸腺嘧啶DNA糖基化酶包括全長的胸腺嘧啶DNA糖基化酶或其保留酶活性的片段或衍生物(如Flag-TDG)。在另一優(yōu)選例中，所述的胸腺嘧啶DNA糖基化酶的促進劑是可重組表達胸腺嘧啶DNA糖基化酶的表達載體。例如，pcDNA4載體，其中包含胸腺嘧啶DNA糖基化酶的基因表達盒。在本發(fā)明的另一方面，提供胸腺嘧啶DNA糖基化酶的抑制劑的用途，用于抑制DNA中5-羧基胞嘧啶切除；或用于制備抑制DNA中5-羧基胞嘧啶切除的組合物。較佳地，所述用途為非治療性和非診斷性的。在另一優(yōu)選例中，所述的胸腺嘧啶DNA糖基化酶的抑制劑是抗胸腺嘧啶DNA糖基化酶的抗體，干擾胸腺嘧啶DNA糖基化酶表達的干擾分子(如siRNA，shRNA)。在另一優(yōu)選例中，所述的干擾胸腺嘧啶DNA糖基化酶表達的干擾分子是針對GenBank登錄號NM172552中第573-593位或第1180-1200位核苷酸的siRNA分子或shRNA分子。在本發(fā)明的另一方面，提供一種DNA去甲基化的試劑盒，其中包括Tet雙加氧酶或其促進劑；和胸腺嘧啶DNA糖基化酶或其促進劑。
在另一優(yōu)選例中，所述的DNA去甲基化試劑盒還包括GADD45A或其促進劑。在另一優(yōu)選例中，所述的GADD45A的促進劑是可重組表達GADD45A的表達載體。例如，pcDNA4載體，其中包含GADD45A的基因表達盒。在本發(fā)明的另一方面，提供一種抑制DNA去甲基化的試劑盒，其中包括Tet雙加氧酶的抑制劑；和胸腺嘧啶DNA糖基化酶的抑制劑。在本發(fā)明的另一方面，提供一種篩選調(diào)節(jié)DNA甲基化/去甲基化狀態(tài)的潛在物質(zhì)的方法，包括(I)用候選物質(zhì)處理表達Tet雙加氧酶的體系；和(2)檢測所述體系中Tet雙加氧酶的轉(zhuǎn)錄、表達或活性；其中，若所述候選物質(zhì)可提聞(優(yōu)選顯者提聞，如提聞20%以上,較佳的提聞50% ;更佳的提高80%以上)Tet雙加氧酶的轉(zhuǎn)錄、表達或活性，則表明該候選物質(zhì)是促進DNA去甲基化的潛在物質(zhì)；若所述候選物質(zhì)可降低(優(yōu)選顯著降低，如降低20%以上，較佳的降低50% ;更佳的降低80%以上)Tet雙加氧酶的轉(zhuǎn)錄、表達或活性，則表明該候選物質(zhì)是導(dǎo)致DNA甲基化的潛在物質(zhì)。在本發(fā)明的另一方面，提供一種篩選調(diào)節(jié)DNA甲基化/去甲基化狀態(tài)的潛在物質(zhì)的方法，包括(I)用候選物質(zhì)處理表達胸腺嘧啶DNA糖基化酶的體系；和(2)檢測所述體系中胸腺嘧啶DNA糖基化酶的轉(zhuǎn)錄、表達或活性；其中，若所述候選物質(zhì)可提聞(優(yōu)選顯者提聞，如提聞20%以上，較佳的提聞50% ；更佳的提高80%以上)胸腺嘧啶DNA糖基化酶的轉(zhuǎn)錄、表達或活性，則表明該候選物質(zhì)是促進DNA去甲基化的潛在物質(zhì)；若所述候選物質(zhì)可降低(優(yōu)選顯著降低，如降低20%以上，較佳的降低50% ;更佳的降低80%以上)胸腺嘧啶DNA糖基化酶的轉(zhuǎn)錄、表達或活性，則表明該候選物質(zhì)是抑制DNA去甲基化的潛在物質(zhì)。在另一優(yōu)選例中，步驟(I)包括在測試組中，將候選物質(zhì)加入到表達Tet雙加氧酶或胸腺嘧啶DNA糖基化酶的體系；和/或步驟⑵包括檢測測試組的體系中Tet雙加氧酶或胸腺嘧啶DNA糖基化酶的轉(zhuǎn)錄、表達、活性，并與對照組比較，其中所述的對照組是不添加所述候選物質(zhì)的表達Tet雙加氧酶或胸腺嘧啶DNA糖基化酶的體系；如果測試組中Tet雙加氧酶或胸腺嘧啶DNA糖基化酶的轉(zhuǎn)錄、表達、活性在統(tǒng)計學(xué)上聞于(優(yōu)選顯者提聞，如提聞20%以上，較佳的提聞50% ;更佳的提聞80%以上)對照組，則表明該候選物質(zhì)是促進DNA去甲基化的潛在物質(zhì)；如果測試組中Tet雙加氧酶或胸腺嘧啶DNA糖基化酶的轉(zhuǎn)錄、表達、活性在統(tǒng)計學(xué)上低于(優(yōu)選顯著降低轉(zhuǎn)錄、表達或活性，如降低20%以上，較佳的降低50% ;更佳的降低80%以上)對照組，則表明該候選物質(zhì)是抑制DNA去甲基化的潛在物質(zhì)。在另一優(yōu)選例中，所述的候選物質(zhì)包括(但不限于)針對Tet雙加氧酶或胸腺嘧啶DNA糖基化酶或它們的編碼基因設(shè)計的干擾分子、核酸抑制物、結(jié)合分子(如抗體或配體)、小分子化合物；或表達Tet雙加氧酶或胸腺嘧啶DNA糖基化酶的重組質(zhì)粒等。在另一優(yōu)選例中，所述的體系選自細胞體系(如表達Tet雙加氧酶或胸腺嘧啶DNA糖基化酶的細胞)(或細胞培養(yǎng)物體系)、亞細胞體系、溶液體系、組織體系、器官體系或動物體系。在另一優(yōu)選例中，所述的方法還包括對獲得的潛在物質(zhì)進行進一步的細胞實驗和/或動物試驗，以從候選物質(zhì)中進一步選擇和確定對于促進或抑制DNA去甲基化有用的 物質(zhì)。在本發(fā)明的另一方面，提供一種篩選TET雙加氧酶活性調(diào)節(jié)劑的方法，包括(I)以Tet雙加氧酶處理DNA，不加入或加入候選物質(zhì)；(2)檢測 5caC 水平；其中，若所述候選物質(zhì)可在統(tǒng)計學(xué)上降低5caC水平，則表明該候選物質(zhì)是TET雙加氧酶的抑制劑；若所述候選物質(zhì)可在統(tǒng)計學(xué)上增加5caC水平，則表明該候選物質(zhì)是TET雙加氧酶的促進劑。在另一優(yōu)選例中，在以Tet雙加氧酶處理DNA時，還包括加入ATP，F(xiàn)e2+和/或2-酮戊二酸；或加入可形成ATP，F(xiàn)e2+和/或2-酮戊二酸的物質(zhì)。在本發(fā)明的另一方面，提供一種篩選TDG活性調(diào)節(jié)劑的方法，包括(I)以TDG處理DNA，不加入或加入候選物質(zhì)；(2)檢測 5caC 水平；其中，若所述候選物質(zhì)在統(tǒng)計學(xué)上可增加5caC水平，則表明該候選物質(zhì)是TDG的抑制劑；若所述候選物質(zhì)可在統(tǒng)計學(xué)上降低5caC水平，則表明該候選物質(zhì)是TDG的促進劑。
在另一優(yōu)選例中，在以TDG處理DNA時，還包括加入Tet雙加氧酶或Gadd45a，或兩者同時加入。在另一優(yōu)選例中，所述的處理DNA是指在細胞內(nèi)過表達后處理細胞內(nèi)DNA，或在體外直接處理DNA。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。


圖I、純化的Tet2蛋白催化5mC與5hmC生成新的修飾形式。A、TLC實驗顯示全長的Flag_Tet2蛋白催化5mC與5hmC底物生成一個未知的點“X”。6-8道為核苷酸參照。化學(xué)合成一段多核苷酸雙鏈DNA，其CCGG序列的第二個胞嘧啶C分別為不修飾、甲基化修飾或羥甲基化修飾。此雙鏈DNA經(jīng)由限制性酶切，末端標記及核酸酶水解產(chǎn)生游離的單核苷酸。注意“X”點的產(chǎn)生同時伴隨著5mC(3道)及5hmC(5道)信號的減弱。3-8道頂端的點為5’端標記的dAMP，由EcoNI酶切DNA底物不完全所產(chǎn)生的。底物 DNA 的全序列為5’ -AACAACCATAACTACCTACTGGAGGGTTGATTGTTGATGAAGTG-3’ (SEQ ID NO:2)和 3’ -TTGTTGGTATTGGTGGATGGmCCTCCCAACTAACAACTACTTCAC(SEQ IDNO:3)-Biotin-5’。B、通過14C標記5-甲基胞嘧啶(5mC)的甲基基團驗證“X”點的來源。利用細菌的CpG甲基轉(zhuǎn)移酶M. SssI，由14C標記的S-腺苷甲硫氨酸(SAM)提供14C-甲基基團，體外甲基化DNA底物從而產(chǎn)生14C標記的DNA底物。注意在第二道檢測到的14C標記的點與第四道檢測到的32P標記的“X”點具有相似的Rf值。C、HPLC檢測到由Flag_Tet2催化5mC及5hmC底物產(chǎn)生的一種新的核苷。當Tet蛋白與5mC或者5hmC底物反應(yīng)時，在HPLC譜圖上出現(xiàn)一個新的峰，標注為“X’ ”。此峰代表了一種尚未被鑒定的+核苷類型。當?shù)孜镏械陌奏槲葱揎椀?，或者Tet蛋白為喪失催化活性的突變體時，都沒有檢測到“X’ ”峰。圖2、5_甲基胞嘧啶(5mC)被Tet氧化后產(chǎn)物為5_羧基胞嘧啶(5-carboxylcytosine,5caC)。由Flag_Tet2催化產(chǎn)生的5mC衍生物分別用HPLC(A)，TLC(B)及質(zhì)譜(C)進行了分析，用5caC標準品作為參照。A、HPLC對經(jīng)Flag_Tet2催化的DNA底物中5mC的衍生核苷的分析。B、TLC法鑒定Tet2催化產(chǎn)生的修飾產(chǎn)物。5mC底物同于圖IA所用底物。5caC DNA是一段合成的雙鏈多核苷酸，序列同于圖1A。其EcoNI酶切位點的3’胞嘧啶C為羧基化的，作為5ca-dCMP的標準參照。C、“X’ ”峰的質(zhì)譜鑒定。對于主要的質(zhì)譜峰，顯示有推斷的結(jié)構(gòu)分子式。圖3、Tet2蛋白在體內(nèi)催化基因組DNA上形成5caC。A、Flag_Tet2蛋白在HEK293T細胞中的表達檢測。使用Flag抗體，對Tet2全長蛋白，催化結(jié)構(gòu)域片斷及催化區(qū)域突變體蛋白分別進行免疫熒光的檢測。B,HPLC檢測Tet2蛋白轉(zhuǎn)染的HEK293T細胞基因組DNA中的5caC。各種核苷的標準品為化學(xué)合成的5caC，以及包含C、5hmC和5mC的DNA水解產(chǎn)生的C、5hmC和5mC三種核苷。箭頭標出了轉(zhuǎn)染Tet2蛋白后基因組DNA中出現(xiàn)的5caC峰。C、HPLC-MS/MS方法檢測被轉(zhuǎn)染細胞基因組中的5caC。使用了負離子的多反應(yīng)質(zhì)譜監(jiān)測(MRM)模式檢測了 5caC母離子及其碎裂后產(chǎn)生的三種子離子(如圖2C中顯示)。藍色信號為5caC標準品，黑色信號來自B圖中轉(zhuǎn)染Tet2蛋白的HEK293T基因組DNA的“5caC”峰，而紅色信號來自轉(zhuǎn)染喪失催化活性的Tet2突變體的細胞基因組DNA。圖4、糖苷酶TDG識別并剪切DNA中的5caC。A、ES細胞核抽提物含有5caC特異的堿基切除活性。小鼠胚胎干細胞的核抽提物中產(chǎn)生堿敏感位點的活性通過含有5caC的雙鏈多核苷酸進行檢測。結(jié)果顯示的是針對不同的DNA底物(底物結(jié)構(gòu)見圖14A)的活性。三個不同的底物分別在序列中間含有G/U錯配(U)，G/5hmC(5hmC)或者G/5caC(5caC)。每個反應(yīng)的總體積為20微升，含有Ipmol的底物DNA與40微克的核抽提物。并且，用TDG抗體(anti_TDG)進行免疫消除的ES核抽提物中5caC的剪切活性大大降低。B、Flag-TDG 可以從雙鏈 DNA 中切除 5caC，但 Flag_MBD4，F(xiàn)lag-UNG 及 GST-SMUG1不行。N151A是TDG的一個喪失催化活性的突變體。相關(guān)蛋白的表達見圖14B。從細菌中純化的6XHis融合的TDG蛋白也具有5caC切除活性。如果DNA底物只在一條鏈上含5caC，則TDG對5caC的切除酶活更高。C、在293T細胞中共表達TDG顯著降低Tet2產(chǎn)生5caC。突變體TDG同B。D、Tdg knockdown的ES細胞的核抽提物缺失5caC堿基切除活性。分別制備穩(wěn)定表達shRNAl，shRNA2或者對照shRNA的兩株不同的細胞系(a與b)的核抽提物，并進行糖苷酶活性測試實驗(類似于A)。圖5、5caC在DNA去甲基化中的功能解釋模型。A、使用HPLC-MS/MS檢測TDG剔除ES細胞中的5caC。方法同圖3C。粉色信號來自TDG剔除的ES基因組DNA，而紅色信號為TDG沒有被knockdown的對照ES細胞株，陽性對照(5caC標準品)為藍色信號。TDG蛋白在ES穩(wěn)定株細胞中的剔除已通過Western分析證實(圖15)。其中abasic表示已丟失堿基的戊糖。B、Tet和TDG蛋白介導(dǎo)的DNA去甲基化的理論模型。Tet蛋白將5mC氧化為5hmC，或進一步氧化為5caC，5caC再由TDG識別并切除；從而引發(fā)了堿基切除修復(fù)，導(dǎo)致未甲基化C的摻入，實現(xiàn)去甲基化。
圖6、轉(zhuǎn)染Tet2的HEK293T細胞核抽提物中檢測到修飾5mC的活性。A、檢測核抽提物中修飾5mC活性的步驟。B、用TLC方法檢測HEK293T細胞核抽提物中修飾5mC的活性。TLC板上一個32P標記的未知位點標記為“X”。第6-8列是32P末端標記的核苷酸標準品，2’-脫氧胞苷-5’-磷酸(dCMP)，5-甲基-2-脫氧胞苷-5’ -磷酸(5m-dCMP)，5-羥甲基-2’ -脫氧胞苷_5’ -磷酸(5hm-dCMP)都是通過酶切水解合成的雙鏈DNA來制備，這些DNA在EcoNI酶切位點的3’具有一個修飾的核苷(見圖A)。具有較高極性的化合物有較小Rf值，因為極性強的化合物和TLC板上的極性吸附劑相互作用強。圖7、考馬斯亮藍染色檢測從HEK293T細胞中純化的帶Flag-標簽的Tet全長蛋白。圖8、DNA雙加氧酶Tetl和Tet3同樣可以氧化5mC或5hmC生成5caC。最上兩張HPLC圖譜顯示了 4種標準核苷的峰(以向下的箭頭指示)。圖9、三種Tet蛋白的C端結(jié)構(gòu)域(⑶)也能夠催化5mC氧化而生成5caC。A、考馬斯亮藍染色檢測從293T細胞中純化的帶Flag標簽的Tetl，Tet2和Tet3CD蛋白。B、含5mC的DNA樣品分別和三種Tet蛋白反應(yīng)后的產(chǎn)物水解成單核苷后進行HPLC分析，圖示為核苷的HPLC圖譜。底部的HPLC圖譜顯示的是來源于合成的DNA中的標準核苷。圖10、從昆蟲細胞Sf9細胞中純化的Tetl催化結(jié)構(gòu)域蛋白能將5mC和5hmC氧化生成5caC。A、考馬斯亮藍染色檢測昆蟲細胞中Tetl⑶蛋白；B、HPLC圖譜顯示TetlCD將5mC或5hmC氧化生成5caC。為了便于純化，該Tetl⑶蛋白在N端帶有Flag標簽，C端帶有6 X組氨酸標簽。圖11、Tet2在體外反應(yīng)中將5mC氧化生成5caC的作用依賴于輔因子。柱狀圖顯示了在輔因子存在或不存在時的體外反應(yīng)中5caC的生成率?！癮ll”表示ΑΤΡ，α-酮戊二酸(2-OG)，F(xiàn)e (NH4)2 (SO4)2 (Fe2+)和二硫蘇糖醇(DTT)所有的輔因子都加入到反應(yīng)緩沖液中，終濃度分別為1πιΜ、1πιΜ、100μΜ、1πιΜ。體外氧化反應(yīng)中的底物是包含有42個甲基胞嘧啶的IOlbp長的DNA片段。甲基胞嘧啶是通過PCR摻入5甲基三磷酸胞苷。300ng 底物(4. 5pmol,含 189pmol 的 5mC)和 4μ g 純化的 Tet2 全長蛋白(FL) (18pmol)孵育反應(yīng)I小時。酶活性是通過HPLC測量5caC產(chǎn)物來計算(實驗步驟見方法)。鑒于Tet2酶活性對ATP的需要，Tet2酶活性和胸腺嘧啶-7-水解酶類似。胸腺嘧啶_7_水解酶能催化胸腺嘧啶上的甲基進行連續(xù)氧化反應(yīng)，產(chǎn)生5-羧基尿嘧啶。圖12、5caC在內(nèi)切酶酶切分析和重亞硫酸鹽測序法分析中的反應(yīng)。A、HapII和MspI不能 酶切含5caC的DNA。一段合成的在CCGG序列中間C為5caC，C或者5hmC的20-merDNA雙鏈(序列信息見B)被用于內(nèi)切酶酶切分析。DNA底物經(jīng)32P末端標記，酶切后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳后再進行放射自顯影。和以往報道一致，MspI對hmC不敏感；B、在重亞硫酸鹽測序分析中，5caC表現(xiàn)出C的反應(yīng)。DNA中的5caC不會造成PCR擴增偏好性。5hmC和5mC的反應(yīng)一致。在原始序列中的“X”為C、5caC或者5hmC。圖13、Tet2全長蛋白氧化5mC生成5caC具有持續(xù)性催化活性。圖中顯示的是甲基化DNA在Tet2全長蛋白反應(yīng)前后的重亞硫酸鹽測序結(jié)果。實驗中分析的底物是一段IOlbp長的區(qū)域，該區(qū)域中含有21個CpG雙核苷而沒有其他形式的C (5’ -TAAT CG TAATACGATA CG ATAATA r am TA CG A CG A CG T CG TT CGAAT CGT CfZ TA Ca AAT COrTACfl AT CfZ TA Ca A Ca ATTAAA CG ATA CG AT CG TATATAA-3，CdG雙核苷酸用粗體標示)。DNA底物首先在體外被細菌的甲基轉(zhuǎn)移酶M. SssI進行甲基化。IOOng的DNA底物(I. 5pmol)和2ug純化的Tet2全長蛋白(9pmol)反應(yīng)I小時?？招娜︼@示的是未甲基化的C或5caC，實心圈表示的是5mC或5hmC。每條線表示的是分析的一條模板鏈。因為體外甲基化后的DNA只有2. 6%的C未甲基化，因此下圖中大多數(shù)空心圈表示的是5caC。5caC生成的百分比(61. 8%)和HPLC中檢測的5caC百分比(64. 2%)接近。圖14、糖苷酶活性測試中所用的DNA底物和酶蛋白。A、DNA底物是通過兩條寡聚核苷鏈退火后制備，其中一條帶有32P末端標記；B、考馬斯亮藍染色檢測純化的糖苷酶。帶Flag標簽的糖苷酶都是通過FLAG M2微珠純化從293T細胞中純化制備。帶GST標簽的SMUGl是從大腸桿菌(E. coli)細胞中純化制備。N151A是TDG酶活性失活的突變體。圖15、通過siRNA沉默小鼠胚胎干細胞(ES)中TDG的表達。通過用慢病毒siRNA沉默質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法建立了穩(wěn)轉(zhuǎn)株細胞。圖中顯示的是免疫印記法(western分析)檢測表達shRNA細胞株中的蛋白表達,每種shRNA檢測了兩株不同的細胞。實驗中所用的抗體在圖中左邊顯示，a-GAPDH購自上?？党缮锟萍加邢薰?。圖16、在TDG敲除的誘導(dǎo)性干細胞(iPS細胞)中檢測5caC。A、TDG敲除iPS細胞株的鑒定。圖示實時定量PCR數(shù)據(jù)顯示，0ct4和Tetl在重編程過程中被激活。所有的iPS細胞都能形成具有典型ES形態(tài)的克隆。對于每種Tdg基因型鑒定，都驗證了兩株獨立建立的細胞株。Endo表示內(nèi)源。B、TDG敲除的iPS細胞中(-/-)缺少切除5caC的活性。核抽提物酶活性的檢測方法同圖4A。+/+表示野生型，f/f表示等位基因的兩個拷貝均被錨定，f/-表示Tdg基因為雜合，-/-表示Tdg基因純合缺失。C、通過三重四級桿質(zhì)譜方法在Tdg敲除的iPS細胞中檢測5caC。實驗分析了從TDG野生型細胞(紅線表示)和TDG缺失的細胞(粉紅線表示)中抽提的基因組DNA。合成的5caC核苷被用作參考(藍線表示)，5caC只能在Tdg敲除的細胞株中檢測到。每種基因型(Tdg-/-，f/_和f/f)都至少檢測了兩株獨立建立的細胞株。圖17、ATP對Tet介導(dǎo)的5mC氧化過程起調(diào)節(jié)作用。反應(yīng)液中不同濃度的ATP對5mC究竟氧化成5hmC還是5caC及其相對產(chǎn)量的影響很大。如ATP濃度為O. 5mM時，氧化產(chǎn)物中5caC占多數(shù)。當ATP濃度較低時(小于O. 2mM),反應(yīng)產(chǎn)生的5hmC比5caC為多。圖18、白血病病人中的TET2突變使5mC和5hmC到5caC的轉(zhuǎn)變效率降低或喪失。 A.考馬斯亮藍染色檢測從瞬時轉(zhuǎn)染的293T細胞中純化的鼠Tet2野生型及突變體蛋白。其中E1231G，P1280S, H1795R及R1810S分別對應(yīng)于白血病患者中TET2的突變E1318G, P1367S, H1881R及 R1896S。B. HPLC檢測鼠Tet2野生型及突變體蛋白將5hmC底物轉(zhuǎn)變成5caC的能力。圖19、GADD45A顯著刺激TDG對5fC與5caC底物的糖苷酶活性。將50ngGST_TDG蛋白與梯度加量的GADD45A蛋白于室溫孵育5分鐘，隨后加入32P末端標記的5fC或5caC底物(5，32p-GAGCGTGACXGGAGCTGAAA-3’，X 為 5fC 或 5caC)，置于 30°C水浴 30 分鐘。反應(yīng)后，分別加入NaOH及EDTA至終濃度為90mM與10mM，并于100°C加熱5分鐘打斷形成AP位點的DNA底物。用20%聚丙烯酰胺尿素變性膠分離DNA底物并放射自顯影。圖20、GADD45A通過Tet-TDG介導(dǎo)的DNA去甲基化途徑激活被CpG甲基化沉默的突光素酶報告基因的表達。圖21、GADD45A能減少293T細胞中由外源過表達的Tet蛋白產(chǎn)生的5caC。A.高效液相色譜分析共表達Tet2蛋白+GADD45A蛋白或Tet2蛋白+TDG蛋白的293T細胞基因組中幾種不同修飾胞嘧啶的含量，箭頭指示5caC峰出現(xiàn)位置。B.質(zhì)譜分析比較單獨過表達Tet2、與GADD45A共表達的293T細胞基因組中不同修飾胞嘧啶的含量。圖中，“num. of…”表示每百萬個胞嘧啶中修飾胞嘧啶的個數(shù)。圖22、Tetl 酶、ATP、20G 和 FAS(Fe2+)濃度對 hmC/caC 生成的影響。
具體實施例方式本發(fā)明人的研究首次證明，不論在體外還是在培養(yǎng)的細胞中，基因組DNA中的5mC和5hmC都可以被Tet雙加氧酶氧化為5-羧基胞嘧啶(5caC)。胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)可以特異性地識別該5caC，并將其從基因組中切除，引起DNA主動去甲基化。術(shù)語如本文所用，除非另外說明，所述的“DNA甲基化”是指在DNA鏈的胞嘧啶上，存在5位碳原子(C)上的甲基化修飾。DNA甲基化能引起染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、DNA構(gòu)象、DNA穩(wěn)定性及DNA與蛋白質(zhì)相互作用方式的改變，基因轉(zhuǎn)錄的改變(如使得基因沉默)從而控制基因表達。如本文所用，除非另外說明，所述的“DNA去甲基化”是指去除DNA鏈的胞嘧啶上存在5位碳原子(C)上的甲基化修飾。DNA去甲基化可以促進基因的轉(zhuǎn)錄激活等。
如本文所用，所述的“Tet雙加氧酶”、“Tet”與“Tet蛋白”可互換適用，均是指屬于Tet家族的蛋白(包括Tetl、Tet2、Tet3等)或蛋白片段。DNA去甲基化方法本發(fā)明首次揭示了一種DNA去甲基化的方法，包括首先，以Tet雙加氧酶處理DNA,將DNA中5-甲基胞嘧啶(5mC)或5-羥甲基胞嘧啶(5hmC)轉(zhuǎn)變?yōu)?-羧基胞嘧啶(5caC);其次，以胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)處理經(jīng)Tet雙加氧酶處理的DNA，將DNA中5-羧基胞嘧啶切除，如圖5B中所示。Tet介導(dǎo)的5mC和5hmC轉(zhuǎn)變?yōu)?caC能夠啟動TDG起始的BER通路，從而未甲基化的胞嘧啶插入到DNA中5-羧基胞嘧啶切除的位置，從而DNA發(fā)生去甲基化。

本發(fā)明第一次清楚地證明了 Tet雙加氧酶可以氧化5mC和5hmC轉(zhuǎn)變?yōu)?caC，后者進一步成為TDG的底物，將DNA中5-羧基胞嘧啶切除，使得DNA發(fā)生去甲基化。DNA的去甲基化與基因的轉(zhuǎn)錄激活等有關(guān)，因此，可藉由本發(fā)明的方法實現(xiàn)基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控等。例如，在白血病病人中多發(fā)生TET2蛋白突變，對相應(yīng)突變體蛋白的酶活檢測發(fā)現(xiàn)，這些突變導(dǎo)致了 TET2將5mC或者5hmC轉(zhuǎn)變成5caC能力的顯著降低或者完全喪失，從而導(dǎo)致DNA去甲基化不能發(fā)生。這可能在白血病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。Tet雙加氧酶及其作用Tet雙加氧酶為一種現(xiàn)有技術(shù)中為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的酶，其以往被人們熟知的功能是氧化5mC為5hmC。而本發(fā)明第一次揭示了其能夠氧化5mC或5hmC并生成5-羧基胞嘧啶(5caC)。在本發(fā)明中，所述的Tet雙加氧酶可以是天然存在的，比如其可被分離或純化自哺乳動物。此外，所述的Tet雙加氧酶也可以是人工制備的，比如可以根據(jù)常規(guī)的基因工程重組技術(shù)來生產(chǎn)重組Tet雙加氧酶。較佳地，可采用重組的Tet雙加氧酶。Tet雙加氧酶包括來自于Tet蛋白家族的酶，它們均包含一個催化氧化的結(jié)構(gòu)域，能夠氧化5mC為5hmC,以及氧化5mC或5hmC并生成5caC。例如所述的Tet雙加氧酶包括Tetl、Tet2、Tet3。Tet雙加氧酶已經(jīng)公知在許多哺乳動物中以高度的保守性存在。因此，可以理解，來源于不同哺乳動物的Tet雙加氧酶均包含于本發(fā)明中。較佳地，它們是與GenBank登錄號ACY38291 (Tetl)、GenBank 登錄號 ΝΡ_001035490 (Tet2)、GenBank 登錄號 NP_898961 (Tet3)所示的序列，序列相同性高于60%的，更佳地是高于70%，更佳地是高于80%，更佳地是高于85%，更佳地是高于88%，更佳地是高于90%，更佳地是高于95%，更佳地是高于98%。任何適合的Tet雙加氧酶均可用于本發(fā)明。所述的Tet雙加氧酶包括全長的Tet雙加氧酶或其生物活性片段(或稱為活性片段)。經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的Tet雙加氧酶的衍生物或其生物活性片段也包括在本發(fā)明中，只要其保留有野生型Tet雙加氧酶的功能。Tet雙加氧酶或其生物活性片段包括一部分保守氨基酸的替代序列，所述經(jīng)氨基酸替換的序列并不影響其活性或保留了其部分的活性。適當替換氨基酸是本領(lǐng)域公知的技術(shù)，所述技術(shù)可以很容易地被實施，并且確保不改變所得分子的生物活性。這些技術(shù)使本領(lǐng)域人員認識到，一般來說，在一種多肽的非必要區(qū)域改變單個氨基酸基本上不會改變生物活性。見Watson等Molecular Biology of The Gene,第四版，1987, The Benjamin/Cummings Pub. Co. P224。
任何一種Tet雙加氧酶的生物活性片段都可以應(yīng)用到本發(fā)明中。在這里，Tet雙加氧酶的生物活性片段的含義是指作為一種多肽，其仍然能保持全長的Tet雙加氧酶的全部或部分功能。通常情況下，所述的生物活性片段至少保持50%的全長Tet雙加氧酶的活性。在更優(yōu)選的條件下，所述活性片段能夠保持全長Tet雙加氧酶的60%、70%、80%、90%、95%、99%、或 100% 的活性。本發(fā)明也可采用經(jīng)修飾或改良的Tet雙加氧酶，比如，可采用為了促進其半衰期、有效性、代謝和/或蛋白的效力而加以修飾或改良的Tet雙加氧酶。所述經(jīng)過修飾或改良的Tet雙加氧酶可以是一種Tet雙加氧酶的共軛物，或其可包含被取代的或人工的氨基酸。所述經(jīng)過修飾或改良的Tet雙加氧酶可以是與天然存在的Tet雙加氧酶具有較小的共同點，但也能發(fā)揮催化氧化的作用，且不會帶來其它不良影響或毒性。也就是說，任何不影響Tet雙加氧酶的生物活性的變化形式都可用于本發(fā)明中。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的Tet雙加氧酶的衍生物或其生物活性片段包括但 不限于(a) GenBank登錄號NP_001035490所示的氨基酸序列的蛋白(Tet2)；(b) GenBank登錄號ACY38291所示的氨基酸序列的蛋白(Tetl)；(C)GenBank登錄號NP_898961所示的氨基酸序列的蛋白(Tet3)；(d)Tetl的包含有催化結(jié)構(gòu)域的C端蛋白(Tetl CD);較佳地其序列如GenBank登錄號ACY38291中第1366-2039位所示；(e)Tet2的包含有催化結(jié)構(gòu)域的C端蛋白(Tet 2⑶)；較佳地其序列如GenBank登錄號 NP_001035490 中第 1042-1912 位所示；(f)Tet3的包含有催化結(jié)構(gòu)域的C端蛋白(Tet3 CD);較佳地其序列如GenBank登錄號NP_898961. 2中第697-1668位所示。(g)將(a)-(h)任一的多肽的氨基酸序列經(jīng)過一個或多個(如1-20個，較佳地1-15個；更佳地1-10個；更佳地1-5個；更佳地1-3個)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)多肽功能的多肽。一旦分離獲得了所述蛋白的序列，就可以用重組法來大批量地獲得該蛋白。這通常是將其編碼基因克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細胞中分離得到。此外，對于較短的蛋白而言，也可采用人工合成(如通過多肽合成儀合成)的方法來合成有關(guān)序列，人工合成的方法可簡便且快速地得到所需要的蛋白。本發(fā)明還包括了編碼所述的Tet雙加氧酶的生物活性片段的分離的核酸，也可以是其互補鏈。編碼Tet雙加氧酶的生物活性片段的DNA序列，可以全序列人工合成，也可用PCR擴增的方法獲得。在獲得了編碼所述的Tet雙加氧酶的生物活性片段的DNA序列之后，將其連入合適的表達載體，再轉(zhuǎn)入合適的宿主細胞。最后通過培養(yǎng)轉(zhuǎn)化后的宿主細胞，通過分離純化得到所要的蛋白。本發(fā)明還包括了包含編碼所述Tet雙加氧酶的生物活性片段的核酸分子的載體。所述的載體還可包含與所述核酸分子的序列操作性相連的表達調(diào)控序列，以便于蛋白的表達。所述的“操作性相連”或“可操作地連于”指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠調(diào)節(jié)或控制同一線性DNA序列其它部分的活性。例如，如果啟動子控制序列的轉(zhuǎn)錄，那么它就是可操作地連于編碼序列。
此外，含有編碼所述Tet雙加氧酶的生物活性片段核酸序列的重組細胞也包括在本發(fā)明中?！八拗骷毎卑ㄔ思毎驼婧思毎?。常用的原核宿主細胞包括大腸桿菌、枯草桿菌等；例如可為大腸桿菌細胞(E. coli)，如大腸桿菌HMS174(DE3)、或BL21(DE3)。常用的真核宿主細胞包括酵母細胞、昆蟲細胞和哺乳動物細胞。基于本發(fā)明人的新發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供了 Tet雙加氧酶或其生物活性片段的用途，包括但不限于用于將DNA中5-甲基胞嘧啶(5mC)或5-羥甲基胞嘧啶(5hmC)轉(zhuǎn)變?yōu)?-羧基胞嘧啶(5caC);或用于制備將DNA中5-甲基胞嘧啶(5mC)或5-羥甲基胞嘧啶(5hmC)轉(zhuǎn)變?yōu)?-羧基胞嘧啶(5caC)的組合物；或用于篩選調(diào)節(jié)DNA甲基化/去甲基化狀態(tài)的物質(zhì)， 坐坐寸寸ο胸腺嘧啶DNA糖基化酶及其作用胸腺嘧啶DNA糖基化酶為一種現(xiàn)有技術(shù)中為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的酶，其以往被人們熟知的功能是可以切除DNA中G/T和G/U錯配中的T和U以及5mC的脫氨產(chǎn)物。而本發(fā)明第一次揭示了其能夠切除DNA中的5-羧基胞嘧啶。在本發(fā)明中，所述的胸腺嘧啶DNA糖基化酶可以是天然存在的，比如其可被分離或純化自哺乳動物。此外，所述的胸腺嘧啶DNA糖基化酶也可以是人工制備的，比如可以根據(jù)常規(guī)的基因工程重組技術(shù)來生產(chǎn)重組胸腺嘧啶DNA糖基化酶。較佳地，可采用重組的胸腺嘧啶DNA糖基化酶。胸腺嘧啶DNA糖基化酶已經(jīng)公知在許多哺乳動物中以高度的保守性存在，例如在人和小鼠中，胸腺嘧啶DNA糖基化酶的序列相同性(同源性)達到86%(identity=86%，similarity=90%)。因此，可以理解，來源于不同哺乳動物的胸腺嘧啶DNA糖基化酶均包含于本發(fā)明中。較佳地，它們是與GenBank登錄號匪766140 (TDG)所示的序列，序列相同性高于60%的，更佳地是高于70%，更佳地是高于80%，更佳地是高于85%，更佳地是高于88%，更佳地是高于90%，更佳地是高于95%，更佳地是高于98%。任何適合的胸腺嘧啶DNA糖基化酶均可用于本發(fā)明。所述的胸腺嘧啶DNA糖基化酶包括全長的胸腺嘧啶DNA糖基化酶或其生物活性片段(或稱為活性片段)。經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的胸腺嘧啶DNA糖基化酶的衍生物或其生物活性片段也包括在本發(fā)明中，只要其保留有野生型胸腺嘧啶DNA糖基化酶的功能。胸腺嘧啶DNA糖基化酶或其生物活性片段包括一部分保守氨基酸的替代序列，所述經(jīng)氨基酸替換的序列并不影響其活性或保留了其部分的活性。適當替換氨基酸是本領(lǐng)域公知的技術(shù)，所述技術(shù)可以很容易地被實施，并且確保不改變所得分子的生物活性。這些技術(shù)使本領(lǐng)域人員認識到，一般來說，在一種多肽的非必要區(qū)域改變單個氨基酸基本上不會改變生物活性。見Watson等Molecular Biology of The Gene,第四版，1987, TheBenjamin/Cummings Pub.Co. P224。任何一種胸腺嘧啶DNA糖基化酶的生物活性片段都可以應(yīng)用到本發(fā)明中。在這里，胸腺嘧啶DNA糖基化酶的生物活性片段的含義是指作為一種多肽，其仍然能保持全長的胸腺嘧啶DNA糖基化酶的全部或部分功能。通常情況下，所述的生物活性片段至少保持50%的全長胸腺嘧啶DNA糖基化酶的活性。在更優(yōu)選的條件下，所述活性片段能夠保持全長胸腺嘧啶DNA糖基化酶的60%、70%、80%、90%、95%、99%、或100%的活性。本發(fā)明也可采用經(jīng)修飾或改良的胸腺嘧啶DNA糖基化酶，比如，可采用為了促進其半衰期、有效性、代謝和/或蛋白的效力而加以修飾或改良的胸腺嘧啶DNA糖基化酶。所述經(jīng)過修飾或改良的胸腺嘧啶DNA糖基化酶可以是一種胸腺嘧啶DNA糖基化酶的共軛物，或其可包含被取代的或人工的氨基酸。所述經(jīng)過修飾或改良的胸腺嘧啶DNA糖基化酶可以是與天然存在的胸腺嘧啶DNA糖基化酶具有較小的共同點，但也能發(fā)揮催化氧化的作用，且不會帶來其它不良影響或毒性。也就是說，任何不影響胸腺嘧啶DNA糖基化酶的生物活性的變化形式都可用于本發(fā)明中。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的胸腺嘧啶DNA糖基化酶的衍生物或其生物活性片段包括但不限于(i) GenBank登錄號NP_766140所示的氨基酸序列的蛋白(TDG)；(ii)將⑴的多肽的氨基酸序列經(jīng)過一個或多個(如1-20個，較佳地1-15個；更佳地1-10個；更佳地1-5個；更佳地1-3個)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的， 且具有(a)多肽功能的多肽。一旦分離獲得了所述蛋白的序列，就可以用重組法來大批量地獲得該蛋白。這通常是將其編碼基因克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細胞中分離得到。此外，對于較短的蛋白而言，也可采用人工合成(如通過多肽合成儀合成)的方法來合成有關(guān)序列，人工合成的方法可簡便且快速地得到所需要的蛋白。本發(fā)明還包括了編碼所述的胸腺嘧啶DNA糖基化酶的生物活性片段的分離的核酸，也可以是其互補鏈。編碼胸腺嘧啶DNA糖基化酶的生物活性片段的DNA序列，可以全序列人工合成，也可用PCR擴增的方法獲得。在獲得了編碼所述的胸腺嘧啶DNA糖基化酶的生物活性片段的DNA序列之后，將其連入合適的表達載體，再轉(zhuǎn)入合適的宿主細胞。最后通過培養(yǎng)轉(zhuǎn)化后的宿主細胞，通過分離純化得到所要的蛋白。本發(fā)明還包括了包含編碼所述胸腺嘧啶DNA糖基化酶的生物活性片段的核酸分子的載體。所述的載體還可包含與所述核酸分子的序列操作性相連的表達調(diào)控序列，以便于蛋白的表達。所述的“操作性相連”或“可操作地連于”指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠調(diào)節(jié)或控制同一線性DNA序列其它部分的活性。例如，如果啟動子控制序列的轉(zhuǎn)錄，那么它就是可操作地連于編碼序列。此外，含有編碼所述胸腺嘧啶DNA糖基化酶的生物活性片段核酸序列的重組細胞也包括在本發(fā)明中?！八拗骷毎卑ㄔ思毎驼婧思毎３Ｓ玫脑怂拗骷毎ù竽c桿菌、枯草桿菌等；例如可為大腸桿菌細胞(E. coli)，如大腸桿菌HMS174(DE3)、或BL21 (DE3)。常用的真核宿主細胞包括酵母細胞、昆蟲細胞和哺乳動物細胞?；诒景l(fā)明人的新發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供了胸腺嘧啶DNA糖基化酶或其生物活性片段的用途，包括但不限于用于將DNA中5-羧基胞嘧啶切除；或用于制備將DNA中5-羧基胞嘧啶切除的組合物；或用于篩選調(diào)節(jié)DNA甲基化/去甲基化狀態(tài)的物質(zhì)，等等。GADD45A 及其作用在本發(fā)明中，所述的GADD45A可以是天然存在的，比如其可被分離或純化自哺乳動物。此外，所述的GADD45A也可以是人工制備的，比如可以根據(jù)常規(guī)的基因工程重組技術(shù)來生產(chǎn)重組GADD45A。較佳地，可采用重組的GADD45A。GADD45A已經(jīng)公知在許多哺乳動物中以高度的保守性存在，來源于不同哺乳動物的GADD45A均包含于本發(fā)明中。較佳地，它們是與GenBank登錄號NP_001915所示的序列，序列相同性高于60%的，更佳地是高于70%,更佳地是高于80%，更佳地是高于85%，更佳地是高于88%，更佳地是高于90%，更佳地是高于95%，更佳地是高于98%。任何適合的GADD45A均可用于本發(fā)明。所述的GADD45A包括全長的GADD45A或其生物活性片段(或稱為活性片段)。經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的GADD45A的衍生物或其生物活性片段也包括在本發(fā)明中，只要其保留有野生型GADD45A的功能。GADD45A或其生物活性片段包括一部分保守氨基酸的替代序列，所述經(jīng)氨基酸替換的序列并不影響其活性或保留了其部分的活性。任何一種GADD45A的生物活性片段都可以應(yīng)用到本發(fā)明中。在這里，GADD45A的生物活性片段的含義是指作為一種多肽，其仍然能保持全長的GADD45A的全部或部分功能。通常情況下，所述的生物活性片段至少保持50%的全長GADD45A的活性。在更優(yōu)選的條件
下，所述活性片段能夠保持全長GADD45A的60%、70%、80%、90%、95%、99%、或100%的活性。本發(fā)明也可采用經(jīng)修飾或改良的GADD45A，比如，可采用為了促進其半衰期、有效性、代謝和/或蛋白的效力而加以修飾或改良的GADD45A。所述經(jīng)過修飾或改良的GADD45A可以是一種GADD45A的共軛物，或其可包含被取代的或人工的氨基酸。所述經(jīng)過修飾或改良的GADD45A可以是與天然存在的GADD45A具有較小的共同點，但也能發(fā)揮天然GADD45A的作用，且不會帶來其它不良影響或毒性。也就是說，任何不影響GADD45A的生物活性的變化形式都可用于本發(fā)明中。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的GADD45A的衍生物或其生物活性片段包括但不限于(i) GenBank登錄號NP_001915所示的氨基酸序列的蛋白；(ii)將(i)的多肽的氨基酸序列經(jīng)過一個或多個(如1-20個，較佳地1-15個；更佳地1-10個；更佳地1-5個；更佳地1-3個)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)多肽功能的多肽。一旦分離獲得了所述蛋白的序列，就可以用重組法來大批量地獲得該蛋白。這通常是將其編碼基因克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細胞中分離得到。此外，對于較短的蛋白而言，也可采用人工合成(如通過多肽合成儀合成)的方法來合成有關(guān)序列，人工合成的方法可簡便且快速地得到所需要的蛋白。本發(fā)明還包括了編碼所述的GADD45A的生物活性片段的分離的核酸，也可以是其互補鏈。編碼GADD45A的生物活性片段的DNA序列，可以全序列人工合成，也可用PCR擴增的方法獲得。在獲得了編碼所述的GADD45A的生物活性片段的DNA序列之后，將其連入合適的表達載體，再轉(zhuǎn)入合適的宿主細胞。最后通過培養(yǎng)轉(zhuǎn)化后的宿主細胞，通過分離純化得到所要的蛋白。本發(fā)明還包括了包含編碼所述GADD45A的生物活性片段的核酸分子的載體。所述的載體還可包含與所述核酸分子的序列操作性相連的表達調(diào)控序列，以便于蛋白的表達。此外，含有編碼所述GADD45A的生物活性片段核酸序列的重組細胞也包括在本發(fā)明中?！八拗骷毎卑ㄔ思毎驼婧思毎?。常用的原核宿主細胞包括大腸桿菌、枯草桿菌等；例如可為大腸桿菌細胞(E. coli)，如大腸桿菌HMS174(DE3)、或BL21(DE3)。常用的真核宿主細胞包括酵母細胞、昆蟲細胞和哺乳動物細胞。
基于本發(fā)明人的新發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供了 GADD45A或其生物活性片段的用途，包括但不限于用于調(diào)控TDG的活性，促進TDG對DNA中5-羧基胞嘧啶的切除作用，等等。調(diào)節(jié)劑如本文所用，所述的Tet或TDG或GADD45A的促進劑包括了穩(wěn)定劑、激動劑、上調(diào)劑等。任何可提高Tet或TDG或GADD45A蛋白的活性、維持Tet或TDG或GADD45A蛋白的穩(wěn)定性、促進Tet或TDG或GADD45A蛋白的表達、延長Tet或TDG或GADD45A蛋白有效作用時間、促進Tet或TDG或GADD45A的基因轉(zhuǎn)錄和翻譯以及的物質(zhì)均可用于本發(fā)明，作為可用于調(diào)節(jié)DNA甲基化/去甲基化狀態(tài)(較佳地為促進DNA的去甲基化)的有效物質(zhì)。
如本文所用，所述的Tet或TDG或GADD45A蛋白的抑制劑包括了拮抗劑、下調(diào)劑、阻滯劑、阻斷劑等。任何可降低Tet或TDG或GADD45A蛋白的活性、降低Tet或TDG或GADD45A蛋白的穩(wěn)定性、抑制Tet或TDG或GADD45A蛋白的表達、減少Tet或TDG或GADD45A蛋白有效作用時間或抑制Tet或TDG或GADD45A蛋白的轉(zhuǎn)錄和翻譯的物質(zhì)均可用于本發(fā)明，作為可用于調(diào)節(jié)DNA甲基化/去甲基化狀態(tài)(較佳地為抑制DNA的去甲基化)的有效物質(zhì)。基于本發(fā)明的新發(fā)現(xiàn)以及結(jié)合現(xiàn)有常識，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以制備或設(shè)計出Tet或TDG蛋白的激動劑或抑制劑，這些激動劑或抑制劑也包括在本發(fā)明中。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的Tet或TDG或GADD45A蛋白的促進劑包括(但不限于):表達Tet或TDG蛋或GADD45A白的質(zhì)粒。所述的Tet或TDG或GADD45A蛋白的促進劑可通過影響Tet或TDG或GADD45A蛋白或其編碼基因的表達或活性而實現(xiàn)對DNA去甲基化的調(diào)控。所述的Tet或TDG或GADD45A蛋白的抑制劑可以是核酸抑制物，蛋白抑制劑，抗體，配體，蛋白水解酶、蛋白結(jié)合分子、EDTA，其能夠下調(diào)Tet或TDG蛋白的表達或活性。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的Tet或TDG或GADD45A蛋白的抑制劑是基于Tet或TDG或GADD45A蛋白的編碼基因的序列設(shè)計的核酸抑制物，如小干擾分子。根據(jù)特定的靶序列來設(shè)計干擾分子是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，目前用于構(gòu)建干擾分子的質(zhì)粒完全可以通過商購?fù)緩将@得。所述的干擾RNA分子可通過采用適當?shù)霓D(zhuǎn)染試劑被輸送到細胞內(nèi)，或還可采用本領(lǐng)域已知的多種技術(shù)被輸送到細胞內(nèi)。根據(jù)已知的蛋白，篩選可以抑制其活性的抗體(單抗或多抗)也是本領(lǐng)域常規(guī)的技術(shù)。所述的Tet或TDG或GADD45A蛋白的抑制劑通過影響Tet或TDG或GADD45A蛋白的表達或活性而實現(xiàn)對DNA甲基化的調(diào)控。試劑盒基于本發(fā)明的新發(fā)現(xiàn)，還提供了一種DNA去甲基化的試劑盒(或稱為藥盒)，其中包括Tet雙加氧酶或其促進劑；和胸腺嘧啶DNA糖基化酶或其促進劑。更佳地，所述試劑盒中還包括GADD45A或其促進劑。所述的試劑盒將試劑集成于一個套組中，便于它們的商業(yè)應(yīng)用。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的試劑盒中還可包括其它一些試劑，例如定量或定性分析DNA甲基化情況的試劑等。更佳地，所述的試劑盒中還可包括使用說明書，以便于人們使用。藥物篩選
在得知了所述的Tet或TDG蛋白的新功能后，可以基于該特征來篩選調(diào)節(jié)Tet或TDG的轉(zhuǎn)錄、表達或活性的物質(zhì)，從而找到可通過影響Tet或TDG而影響DNA甲基化/去甲基化狀態(tài)的物質(zhì)。因此，本發(fā)明提供了一種篩選調(diào)節(jié)DNA甲基化/去甲基化狀態(tài)的潛在物質(zhì)的方法，包括用候選物質(zhì)處理表達Tet的體系；和檢測所述體系中Tet的轉(zhuǎn)錄、表達或活性；其中，若所述候選物質(zhì)可提高Tet的轉(zhuǎn)錄、表達或活性，則表明該候選物質(zhì)是促進DNA去甲基化的潛在物質(zhì)；若所述候選物質(zhì)可降低Tet的轉(zhuǎn)錄、表達或活性，則表明該候選物質(zhì)是導(dǎo)致DNA甲基化的潛在物質(zhì)。本發(fā)明還提供了一種篩選調(diào)節(jié)DNA甲基化/去甲基化狀態(tài)的潛在物質(zhì)的方法，包括用候選物質(zhì)處理表達TDG的體系；和檢測所述體系中TDG的轉(zhuǎn)錄、表達或活性；其中，若所述候選物質(zhì)可提高TDG的轉(zhuǎn)錄、表達或活性，則表明該候選物質(zhì)是促進DNA去甲基化的潛在物質(zhì)；若所述候選物質(zhì)可降低TDG的轉(zhuǎn)錄、表達或活性，則表明該候選物質(zhì)是抑制DNA去 甲基化的潛在物質(zhì)。在本發(fā)明的提示下，本領(lǐng)域技術(shù)人員均能夠去初步地選擇一些候選物質(zhì)，如認為潛在有用的物質(zhì)。例如，所述的候選物質(zhì)包括(但不限于)針對Tet或TDG或它們的編碼基因設(shè)計的干擾分子、核酸抑制物、結(jié)合分子(如抗體或配體)、小分子化合物；或表達Tet或TDG的重組質(zhì)粒等。在進行篩選時，為了更易于觀察到Tet或TDG的表達或活性的改變，還可設(shè)置對照組，所述的對照組可以是不添加所述候選物質(zhì)的表達Tet或TDG的體系。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的方法還包括對獲得的潛在物質(zhì)進行進一步的細胞實驗和/或動物試驗，以進一步選擇和確定對于調(diào)節(jié)DNA甲基化/去甲基化狀態(tài)真正有用的物質(zhì)。另一方面，本發(fā)明還提供了采用所述篩選方法獲得的可用于調(diào)節(jié)DNA甲基化/去甲基化的潛在物質(zhì)。這些初步篩選出的物質(zhì)可構(gòu)成一個篩選庫。下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)的方法或條件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實驗指南，科學(xué)出版社，2002中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。I.材料與方法5hmC和5caC寡核昔酸5hmC寡核苷酸在Invitrogen公司(上海)合成。5caC寡核苷酸通過已發(fā)表的方法合成(Q. Dai, C. He, Org Lett 13,3446 (Jul 1,2011))。DNA 底物含有21 個甲基胞嘧啶的 IOlbp 長的 DNA 片段 ALTAATniCGTAATAniCGATAniCGATAATAniCGmCGTAmCGAmCGAmCGTmCGTTmCGAATmCGTmCGTAmCGAATmCGTAmCGATmCGTAmCGAmCGATTAAAmCGATAmCGATmCGTATATAA-3’ (DNA序列見SEQ ID NO: I)，其中mC為甲基胞嘧啶。
Tet2及其突變體本發(fā)明實施例中所用的野生型的Tet2 (鼠源)的序列如GenBank登錄號ΝΡ_001035490。核心催化部位的氨基酸殘基突變(HxD，位于保守的Fe2+結(jié)合部位)的Tet2酶為野生型的Tet2在第1295位H — Y，1297位D — A突變后的Tet2突變體。該突變體喪失催化活性。Tet2的同源蛋白Tetl的序列如GenBank登錄號ACY38291所示。Tet2的同源蛋白Tet3的序列如GenBank登錄號NP_898961所示。Tetl的包含有催化結(jié)構(gòu)域的C端蛋白(Tetl⑶)的序列如GenBank登錄號 ACY38291 中第 1366-2039 位所示。Tet2的包含有催化結(jié)構(gòu)域的C端蛋白(Tet2⑶)的序列如GenBank登錄號ΝΡ_001035490 中第 1042-1912 位所示。Tet3的包含有催化結(jié)構(gòu)域的C端蛋白(Tet3⑶)的序列如GenBank登錄號NP_898961 中第 697-1668 位所示。從Sf9昆蟲細胞中純化的含有Tetl催化結(jié)構(gòu)域的C端蛋白的序列如=GenBank登錄號ACY38291中第1366-2039位所示。GADD45A基因的序列為GenBank登錄號NP_001915所示。重組的TDG蛋白的表達，以及糖苷酶活性檢測實施例中所用的TDG蛋白的編碼序列如GenBank登錄號NP_766140所示。N151A是TDG酶活性失活的突變體為GenBank登錄號NP_766140所示蛋白中第151位由N突變?yōu)锳而獲得。構(gòu)建表達載體TDG的編碼基因序列如GenBank登錄號NP_766140所示，將其插入pcDNA4-Flag 載體,插入位點為 BamHI, Xhol。表達載體轉(zhuǎn)化293T細胞，表達獲得重組的TDG蛋白或重組表達的酶活性突變體N151A，重組蛋白帶有Flag標簽(N端帶有Flag標簽)。Flag-MBD4的制備方法類似制備純化Flag-TDG方法，MBD4蛋白序列參見GenBank 登錄號 AAC68878 所示。Flag-UNG2的制備方法如制備純化Flag-TDG方法，UNG2蛋白序列參見GenBank登錄號ΝΡ_001035781所示。GST-SUMGI的制備PCR法擴增SUMGI編碼序列，經(jīng)BamHI、Xho I酶切后插入到PGEX-4T 載體的 BamHI、XhoI 位點。將 pGEX_4T_SMUGl 轉(zhuǎn)化 BL21 (DE3)，并用 IPTG 誘導(dǎo)蛋白表達。參照 GE healthcare 的產(chǎn)品說明書用 Gluthione Sepharose AE^1MtGST-SMUGl;SUMGl蛋白序列參見GenBank登錄號AAL86910所示。 從細菌中純化6XHi s融合的TDG蛋白的方法將TDG編碼序列從pcDNA4_Flag載體上亞克隆至pET28a載體的BamHI、XhoI位點。將pET28_TDG質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達菌株BL21 (DE3)，用IPTG誘導(dǎo)6XHis融合的TDG蛋白的表達。按照Qiagen公司的說明書用Ni-NTA介質(zhì)純化His-TDG蛋白。Tet2 CD、TDG、GADD45A 的表達質(zhì)粒構(gòu)建Tet2⑶表達質(zhì)粒Tet2的包含有催化結(jié)構(gòu)域的C端蛋白(Tet2⑶)的編碼基因序列如GenBank登錄號NP_001035490中第1042-1912位所示,將其插入pcDNA4_Flag載體，插入位點為BamHI和NotI。Tet2表達質(zhì)粒Tet2的全長編碼基因序列如GenBank登錄號NP_001035490中所示，將其插入pCAG-Flag載體，插入位點為BamHI和NotI。TDG : TDG的編碼基因序列如GenBank登錄號NP_766140中所示，將其插入pcDNA4-Flag 載體,插入位點為 BamHI, Xhol。TDG突變體表達質(zhì)粒N151A是TDG酶活性失活的突變體，其編碼基因序列為如GenBank登錄號NP_766140中所示，但通過PCR方法將對應(yīng)的編碼蛋白中第151位由N突變?yōu)锳，然后將突變體編碼基因序列插入pcDNA4-Flag載體，插入位點為BamHI，Xhol。GADD45A表達質(zhì)粒GADD45A編碼基因序列為如GenBank登錄號NP_001915中所示，將其插入pcDNA4-Flag載體,插入位點為BamHI, Xhol。GADD45A突變體表達質(zhì)粒G39A是GADD45A的突變體，其編碼基因序列為如GenBank登錄號NP_001915中所示，但通過PCR方法將對應(yīng)的編碼蛋白中第39位由G突變?yōu)锳，然后將突變體編碼基因序列插入pcDNA4-Flag載體，插入位點為Hindlll，Xbal。
M. SssI體外甲基化的熒光素酶報告基因載體的獲得獲得方法將熒光素酶報告基因載體(載體骨架不含CG位點，但啟動子區(qū)域含CG位點)(G Barreto et al.，Nature445，671 (Feb8，2007)用 M. SssI 酶在體外反應(yīng)，M. SssI 酶只對CG位點的C進行甲基化修飾，因此可以獲得啟動子區(qū)域被甲基化的熒光素酶報告基因載體。重組蛋白表達和純化為了表達帶Flag標簽的重組蛋白，蛋白或蛋白片段或蛋白突變體的編碼基因被克隆到修改過的(改造方法合成編碼Flag標簽的兩條互補DNA oligo，5’_AGCTTATGGACTACAAAGACGATGACGACAAGG-3，(SEQ ID NO: 4)及 5 ’ GATCCCTTGTCGTCATCGTCTTTGTAGTCCATA-3’(SEQ ID NO:5)，退火后，插入到 pcDNA4 載體(Invitrogen，Cat. No. V1020-20))pcDNA4 載體(Invitrogen)的BamHI、XhoI位點中，獲得pcDNA4_Flag載體。表達質(zhì)粒通過聚乙烯亞胺(polyethylenimine,PEI, Sigma)轉(zhuǎn)染入HEK 293T細胞中。轉(zhuǎn)染40小時后，收獲和裂解細胞。裂解液為 50mM Tris, pH7. 4,500mM NaCl，1%NP40，IX 無 EDTA 的蛋白酶抑制劑(Roche)以及ImM PMSF。重組蛋白采用FLAG M2親和膠(Sigma)按照說明書純化。最后洗脫下的重組蛋白在透析液(20mM HEPES, pH7. 4,50mM NaCl，50%甘油)中于4°C透析4小時，然后儲存于_20°C。重組蛋白的質(zhì)量通過跑SDS-PAGE膠、然后考馬斯亮藍染色以及由Flag抗體(Sigma)檢測的免疫雜交鑒定。從昆蟲細胞中表達和純化含催化結(jié)構(gòu)域的小鼠Tetl (Tetl⑶)通過以前描述的方法進行(M. Tahiliani et al.，Science324，930 (May 15,2009))。構(gòu)建Tdg knockdown的小鼠ES細胞株根據(jù)已發(fā)表的方法構(gòu)建由U6啟動子驅(qū)動Tdg shRNA表達的慢病毒質(zhì)粒(J. Moffatet al.，Cell 124,1283 (Mar 24,2006)) 慢病毒載體pLKO. I經(jīng)過改造，其嘌呤霉素抗性基因被替換成常規(guī)的EGFP基因。兩個siRNA靶序列分別對應(yīng)于小鼠Tdg基因(GenBank登錄號NM 172552)的第573-593位及第1180-1200位核苷酸。含有每一種siRNA序列的DNA多核苷酸經(jīng)退火后插入改造載體的AgeI與EcoRI位點。包裝好的病毒感染MPI-IIES 細胞(來源于 129Sv/Pas (小鼠品系,獲自德國 Max-Plank Institute of BiophysicalChemistry),感染復(fù)數(shù)為60。挑取并擴增多個表達EGFP的ES克隆。用Western blotting進行鑒定并選擇缺失TDG的ES克隆。構(gòu)建TDG缺失的iPS細胞株Tdg 打革巴載體的構(gòu)建如 P. Liu, N. A. Jenkins, N. G. Copeland, Genome Resl3,476 (Mar, 2003)所述。用電轉(zhuǎn)的方法將打靶載體導(dǎo)入到C57BL/6 ES細胞進行同源重組。在陽性ES細胞克隆中，包含第3個外顯子至第7個外顯子的基因組區(qū)域被LoxP位點錨定。為了建立Tdg敲除的iPS細胞系，首先從Tdg雙錨定的C57BL/6-ICR混合背景的小鼠的E13. 5天胚胎分離胚胎成纖維細胞，隨后用0ct4，Sox2及Klf4因子進行重編程誘導(dǎo)iPS細胞的產(chǎn)生。在iPS細胞中瞬時表達Cre切除Tdg被錨定區(qū)域，從而產(chǎn)生Tdg敲除的iPS細胞。體外DNA氧化反應(yīng)·體外酶反應(yīng)基本采用以前描述的方法(S. Kriaucionis, N. Heintz, Science324,929 (May 15,2009))。簡要的過程是含有5mC或hmC的PCR片段與核抽提物或者Tet蛋白在反應(yīng)液中于37°C反應(yīng)40分鐘，反應(yīng)液的成份是50mMHEPES，pH8. O, 50mM NaCl,2mM抗壞血酸(ascorbic acid), lmM2-oxoglutarate (OG), 100 μ M Fe (NH4)2 (SO4)2, ImM ATP,以及 ImMDTT0底物DNA然后用蛋白酶K處理，酚/氯仿抽提，用DNAmate(TaKaRa)按照說明書操作沉淀。薄層色譜(thinlayer chromatography, TLC)分析 5mC 衍生物 與Tet酶反應(yīng)后，生物素標記的DNA底物用EcoNI在37 V消化I小時，然后用酚/氯仿抽提純化、DNAmate (TaKaRa)沉淀。消化的DNA底物用牛小腸堿性磷酸酶(calfintestinal alkaline phosphatase, CIAP, TaKaRa)處理 I 小時后，再次純化。DNA寡核苷酸然后用T4多聚核苷激酶(TaKaRa)末端標記。反應(yīng)液含10 μ Ci的[γ-32Ρ]ΑΤΡ，于37°C反應(yīng)I小時。標記好的片段與鏈酶親和素Sepharose High Performance beads (GEHealthcare)于室溫反應(yīng)I分鐘。用TE緩沖液洗后，結(jié)合的DNA片段用核酸酶SI (TaKaRa)于23°C消化反應(yīng)15分鐘。I微升的消化產(chǎn)物點在纖維素TLC板(Sigma)上。流動相為異丁酸水氨水(66:20:2)。TLC 板用磷屏檢測、FujiFilm Fluorescent Image AnalyzerFLA-3000掃描分析。HPLC分析DNA核苷水解物含有至少20ng的5hmC或5caC的DNA底物經(jīng)熱變性后，用O. IU的核酸酶Pl (Sigma)于50°C反應(yīng)至少I小時或37°C過夜(反應(yīng)體系18“1，包括201111 NaOAc,pH5. 3,O. 2mM ZnSO4)。之后加入 2. I μ I 的 IOX CIAP 緩沖液以及 O. 9 μ I 的 CIAP (TaKaRa)，于 37°C反應(yīng)至少2小時或過夜。反應(yīng)產(chǎn)物在Agi lent 1200 HPLC儀上分析，色譜柱為5-μ m顆粒的AQ-C18 柱，25cm χ4· 6mm。流動相為 IOmM KH2PO4, ρΗ3· 7，運行 lml/min，280nm 檢測。5hmC核苷標準品通過CIAP (TaKaRa)脫掉5hmdCTP (Bioline)的磷酸制備。2-脫氧胞啶和5-甲基2-脫氧胞唳購自Sigma。質(zhì)譜實驗為了鑒定由Tet蛋白在體內(nèi)和體外氧化生成的產(chǎn)物，本發(fā)明人經(jīng)過HPLC實驗后使用自動收集模塊(Agilent Technologies)收集目的峰。經(jīng)過脫鹽后，收集的組分使用20微升的H20/ACN(1:1)重懸。取5微升樣品使用LTQ-Orbitrap Velos質(zhì)譜儀(ThermoScientific)進行檢測，實驗使用了負離子模式(I. 3kV)。實驗精確度為O. 4-0. 7ppm。5caC的HPLC-ESI-MS/MS檢測使用了三重四極桿質(zhì)譜儀(Agilent 6410QQQ)的多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM mode)。MRM模式的信號來自5caC母離子(核質(zhì)比為270)及其碰撞碎裂產(chǎn)生的核質(zhì)比為110、154和227的三個特征性子離子(三種核質(zhì)比轉(zhuǎn)換為270 — 110，270 — 154，270 — 227)。判斷5caC出現(xiàn)的標準為經(jīng)過HPLC反向柱后三種轉(zhuǎn)換同時出現(xiàn)。CpG雙核苷酸內(nèi)胞嘧啶5甲基基團的14C標記200μ I反應(yīng)體系中加入5μ g的101-bp PCR DNA片段(見前面所述，具體DNA序列如下5’ -TAATCGTAATACGATACGATAATACGCGTACGACGACGTCGTTCGAATCGTCGTACGAATCGTACGATCGTACGACGATTAAACGATACGATCGTATATAA-3’ (SEQ ID NO:6))、20 單位的 M. SssI CpG 甲基轉(zhuǎn)移酶和 8μ I S-[甲基-14C]-adenosyl-L-甲硫氨酸(14C-SAM, I. 48-2. 22GBq/mmoI，PerkinElmer),于37°C反應(yīng)2小時。DNA用酹/氯仿抽提純化、乙醇沉淀,溶于40 μ I H2O 中。堿基切除分析根據(jù)已經(jīng)發(fā)表的方法并略作修改，檢測多個糖苷酶對不同雙鏈DNA底物的堿基切除活性(Neddermann P. JBC，1993，268:21218-21224)。底物 DNA 含有單個 G/U 錯配或者其MspI位點的胞嘧啶經(jīng)化學(xué)修飾。用ΡΝΚ(Τ4 PNK)及[Y-32P]-ATP對一條修飾的多核苷酸(5’ -GAGCGTGACMGGAGCTGAAA-3’，M=U，5hmC或5caC)進行末端標記。隨后與等摩爾的互補G鏈(該鏈在M相應(yīng)位點存在G錯配，其它位點互補)或者含有對應(yīng)修飾(5hmC或者5caC修飾)的多核苷酸進行退火。反應(yīng)時，將40nM糖苷酶或者核抽提物與IOnMDNA底物在 30°C孵育 30 分鐘。反應(yīng)緩沖液為 25mM HEPES，pH7. 8,0. 5mM EDTA,O. 5mM DTT，0. 5mg/mlBSA。為了將DNA雙鏈中的脫堿基位點(AP位點)轉(zhuǎn)變成單鏈的缺口，分別在反應(yīng)體系中加入NaOH及EDTA至終濃度90mM與10mM，并在100°C加入5分鐘。隨后用20%變性聚丙酰胺膠進行產(chǎn)物的分離。電泳后，進行放射性自顯影。TDG糖苷酶活性檢測方法同上述堿基切除分析方法。5caC在轉(zhuǎn)染Tet2的HEK293T細胞基因組的檢測Flag-Tet蛋白或蛋白片段(或結(jié)構(gòu)域)的表達質(zhì)粒的構(gòu)建將Tet2、Tetl、Tet3或它們的片段或變異體的編碼序列插入到經(jīng)改造的pCAG(m)載體的Ascl/Notl位點中。使用Linpofectamine Reagent 2000 (Invitrogen)將 Flag_Tet2 的表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HEK 293T細胞中。48小時后，收取細胞并使用酚/氯仿的方法提取基因組DNA。然后使用RNase A/T1消化基因組DNA中的RNA污染(每100微克DNA使用50微克RNase A和1000U RNase Tl)。DNA使用70%的乙醇沉淀并使用TE緩沖液溶解。隨后，使用nucleasePl水解DNA過夜(每100微克DNA使用1U)。最后，使用CIAP酶(TAKARA)消化掉核苷酸5’端磷酸生成核苷。將樣品濃縮至20-30微升，進行HPLC-MS/MS檢測。重亞硫酸鹽測序分析基本原理單鏈DNA的胞嘧啶可被亞硫酸氫鹽脫去氨基而轉(zhuǎn)變成尿嘧啶，而5-甲基胞嘧啶則不能被修飾，仍保持為5-甲基胞嘧啶。針對經(jīng)亞硫酸氫鹽處理后的特定基因組區(qū)域設(shè)計引物，可通過PCR將其擴增，擴增后尿嘧啶變?yōu)樾叵汆奏?。具體方法 200ng基因組DNA用限制性內(nèi)切酶片段化后在100°C變性10分鐘后立即插入冰中冷卻，加入2M NaOH至終濃度為O. 3M并在50°C放置15分鐘保持DNA的單鏈狀態(tài)。將2倍體積的2%low melting point agarose (Sangon)加入到DNA溶液中迅速混勻。將10 μ I DNA/agarose混合物滴加到預(yù)冷的礦物油中并在冰上放置20分鐘形成小球。待瓊脂糖小球凝固后，加入 500 μ I bisulfite solution (2. 5M sodium bisulfite (SigmaS-9000), IOmM hydroquinone, pH5. 0)并小心晃動離心管使瓊脂糖小球浸在bisulfitesolution (下層液相)中，在避光條件下于50 55°C處理4 12小時。隨后，盡量移去所有溶液，并用Imll XTE清洗小球三次，每次10分鐘；500 μ 10. 2Μ NaOH處理小球兩次，每次15分鐘；最后再用Iml I X TE清洗小球三次，每次10分鐘。處理完畢后，小球可在I X TE中于4°C存放數(shù)周待用。用針對目的基因組區(qū)域的引物進行普通PCR或者巢式PCR擴增。PCR產(chǎn)物經(jīng)試劑盒(Takara DNA fragments purification Kit)純化后連接入 pBluscript IISK(+)中。連接產(chǎn)物在LB培養(yǎng)基平板上大約長300 400個克隆，取10 15個陽性克隆交由上海博亞生物技術(shù)公司進行插入片段的測序。核抽提方法將至少IO8細胞重懸于與細胞沉淀等體積的低滲緩沖液Buffer A (IOmM HEPES, pH7. 9，IOmM KCl，I. 5mM MgCl2,0. 5mM DTT)中，冰上放置20分鐘后轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的細胞勻漿器中(Wheaton, Cat. No. 432-1270)，勻漿 10-15 次。4°C，12，OOOg 離心 20 秒。棄上清，沉淀重懸于高滲緩沖液 Buffer B(20mM HEPES, pH7. 9,420mM NaCl, I. 5mM MgCl2,0. 2mM EDTA,0. 5mM DTT，25%glycerol)中，冰上放置60分鐘以裂解細胞核。4°C，16，OOOg離心10分鐘。收集上清并透析至貯存緩沖液 Buffer C (20mM HEPES, pH7. 9, IOOmM KCl, I. 5mM MgCl2,0. 2mM EDTA,0. 5mM DTT，20%glycerol)中。Bradford 法測定蛋白濃度，分裝后凍存于-80度冰箱。II.實施例實施例I、在轉(zhuǎn)染Tet2的哺乳動物細胞的核抽提物中檢測到5mC和5hmC的修飾活性已有報道Tet雙加氧酶能使5mC羥基化反應(yīng)為5hmC(M. Tahiliani et al.，Science 324,930 (May 15，2009))，但不清楚是否在哺乳動物細胞的核抽提物中具有針對5mC和/或5hmC的修飾活性。由于這一修飾活性是否存在具有不確定性，選擇一個恰當?shù)姆椒▽z測的成功至關(guān)重要。用放射性同位素32P末端標記經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化后的修飾核苷酸，然后用薄層色譜(thin layer chromatography,TLC)分析,是一種十分敏感的方法。但是，堿基的修飾可能會阻礙內(nèi)切酶消化。為了解決這一問題，本發(fā)明人利用了限制性內(nèi)切酶EcoNI的一種特點，即它可以識別由5個任意核苷酸隔開的兩端各有3個固定核苷酸的序列(5，CCTNN/NNNAGG3’，N=任意核苷酸)。如果5mC修飾后產(chǎn)生的新的核苷酸位于第三個N的位置，則不會阻礙EcoNI消化；如果該位置仍然是5mC，則EcoNI不能消化。另外，考慮到任何核抽提物中不可避免的會污染有DNA，本發(fā)明人將含有5mC的DNA用生物素標記，這樣，底物DNA就可以被鏈酶親和素珠子純化。通過如圖6A中的操作流程，在將5mC DNA底物與轉(zhuǎn)染Tet2 (帶有Flag標簽)的HEK293細胞(細胞內(nèi)轉(zhuǎn)染表達Flag-Tet2的表達質(zhì)粒)的核抽提物(NE)反應(yīng)，經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoNI酶切及放射性同位素32P標記后，用TLC能夠檢測到一個額外的點(這個末鑒定的核苷酸標示為“X”，圖6B)。這個點移動的距離遠小于所有其它的核苷酸，而且它的量與5mC減少的量相當。用含5hmC的DNA底物(底物序列同圖6A，僅在中間甲基化的胞嘧啶(mC)位置變?yōu)榱u甲基化的胞嘧啶(hmC))作反應(yīng)后也可檢測到同樣類似的一個點(圖6B)，但是在用只含C的DNA底物(底物序列同圖6A，僅在中間甲基化的胞嘧啶(mC)位置變?yōu)榘奏?C))做反應(yīng)時沒有檢測到這個點。利用同樣的檢測方法，在用小鼠ES細胞核抽提物或者含有同樣量的內(nèi)源性Tet2的核抽提物組份做反應(yīng)時，沒有檢測到任何額外的點。這些結(jié)果提示，轉(zhuǎn)染Tet2的細胞核抽提物具有將5mC和5hmC生成“X”的特別活性。實施例2、DNA中5mC和5hmC的修飾由Tet雙加氧酶催化既然Tet雙加氧酶能催化氧化5mC成5hmC，本發(fā)明人猜測在TLC板上檢測到的末鑒定的核苷酸“X”點可能是由與Tet2相互作用的蛋白質(zhì)或者Tet2本身催化。為了檢驗這一猜測，本發(fā)明人在293T細胞中轉(zhuǎn)染帶有Flag標簽的全長Tet2 (即轉(zhuǎn)染表達Flag_Tet2的 表達質(zhì)粒)，并純化Tet2蛋白用來檢測是否具有對含有5mC的DNA的修飾活性。TLC分析顯示，含有5mC或5hmC的DNA底物與純化的Tet2蛋白反應(yīng)后，都檢測到產(chǎn)生了“X”點(圖1A)。為了確定在TLC板上的“X”點是來源于5mC，本發(fā)明人做了一個同位素示蹤實驗。利用CpG特異的細菌甲基轉(zhuǎn)移酶M. SssI和[14C甲基]S-腺苷甲硫氨酸，本發(fā)明人將DNA底物中5mC的甲基基團進行了同位素標記，進行如實施例I的TLC分析。結(jié)果，在TLC板上可以看到有一個14C的點與32P標記的“X”點具有一樣的遷移率，證實那個未知的“X”點來源于 5mC (圖 1B)。在Tet2作用下產(chǎn)生的5mC衍生物也能夠被高效液相色譜(high performanceliquid chromatographic, HPLC)檢測到。野生型的Tet2能將90%以上的5mC或5hmC轉(zhuǎn)變?yōu)橐环N新的核苷{(diào)V峰)(圖1C)。然而，在核心催化部位的氨基酸殘基突變(HxD，位于保守的Fe2+結(jié)合部位)的Tet2酶(重組表達見圖7)則不能產(chǎn)生V峰。采用相似的方法，本發(fā)明人檢測了 Tet2的另兩個同源蛋白(重組表達見圖7)的活性。結(jié)果顯示Tetl和Tet3都具有活性，但Tetl比Tet3活性更強些(圖8)。包含有催化結(jié)構(gòu)域的C端蛋白(TetlCD)也具有明顯的活性(圖9)。此外，從Sf9昆蟲細胞中純化的含有催化結(jié)構(gòu)域的C端蛋白也具有明顯的轉(zhuǎn)化5mC的活性(圖10)。顯然，這些結(jié)果證實Tet酶在本質(zhì)上具有轉(zhuǎn)換5mC和5hmC生成另一種DNA修飾堿基的功能。實施例3、Tet雙加氧酶催化5mC和5hmC轉(zhuǎn)變?yōu)?_羧基胞嘧啶含5mC或5hmC的DNA底物(同實施例I中的底物)在和Tet作用后，在HPLC上檢測到新出現(xiàn)的峰，但這個峰只有在反應(yīng)時加入所有雙加氧酶家族的酶都需要的兩個輔因子，即Fe2+和2-酮戊二酸(2-oxoglutarate，2_0G)時才產(chǎn)生(圖11)，呈現(xiàn)這兩個輔因子的依賴性，結(jié)合胞嘧啶上保留的14C標記的甲基基團(圖1B)，提示新的修飾來源于5mC的5-甲基基團的氧化。而且ATP濃度在0，O. 1,0. 3,0. 5，ImM時，5caC呈現(xiàn)劑量依賴性地上升(圖17) 5mC的逐級氧化會形成5hmC、5_醒基胞喃唳(5-formylcytosine, 5fC)以及5-羧基胞喃唳(5-carboxylcytosine, 5caC)。本發(fā)明人明顯地看到,HPLC上檢測到的由Tet2催化產(chǎn)生的5mC未知衍生物與化學(xué)合成的5caC標準品具有相同的保留時間(圖2A)。此外，在TLC上檢測到的由Tet催化產(chǎn)生的“X”點與32P標記的5caC核苷酸標準品的遷移率一致，這進一步為鑒定5mC未知衍生物提供了可信的證據(jù)(圖2B)。為了進一步確信無疑地鑒定未知的修飾核苷，本發(fā)明人收集了HPLC上的X'峰，然后進行高分辨率的質(zhì)譜分析。在負電模式下，質(zhì)譜檢測到一個質(zhì)荷比(m/z)為270. 0731峰，與來源于5caC(m/z :270. 0726)的單同位素離子峰的偏差僅I. 8ppm(圖2C,上)?？偟碾x子碎片模式與標準品5-羧基胞啶的離子碎片模式完全吻合(圖2C，下)?？傊@些結(jié)果證實Tet2雙加氧酶催化氧化DNA中的5mC和5hmC轉(zhuǎn)變?yōu)?-羧基胞嘧啶。為了研究Tet2的酶反應(yīng)特性，本發(fā)明人對甲基化的DNA在體外羥化反應(yīng)后進行了重亞硫酸鹽測序分析。5caC在重亞硫酸鹽反應(yīng)后與未甲基化的胞嘧啶的表現(xiàn)一樣(圖12B)。5caC在反應(yīng)后的分布格局(圖13)清晰地提示Tet2是連續(xù)催化氧化5mC位點的。實施例4、Tet2在轉(zhuǎn)染的哺乳動物細胞中催化形成5caC
本發(fā)明人然后在培養(yǎng)的哺乳動物細胞中轉(zhuǎn)染Tet蛋白來檢測其是否可以氧化基因組DNA上5mC為5caC。將全長的Tet2 (Tet2FL)和其C端的催化結(jié)構(gòu)域(Tet2⑶)分別轉(zhuǎn)染了 HEK 293T細胞，并利用其所帶有Flag標簽使用免疫熒光和Western雜交的方法對蛋白的表達情況進行了驗證(圖3A)。HPLC分析顯示，當Tet轉(zhuǎn)染到293T細胞中后，基因組DNA中除了出現(xiàn)5hmC的峰外，還出現(xiàn)了一個新的峰，這個峰在HPLC分析中與5caC具有相同的保留時間(圖3B)。而對于轉(zhuǎn)染了催化結(jié)構(gòu)域的突變體Tet2的細胞，其基因組中并未出現(xiàn)這一個峰。為了確定這一峰是否為5caC，本發(fā)明人使用三重四極桿質(zhì)譜儀的多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM mode)來檢測核質(zhì)比為270的母離子碎裂后的三種特征性子離子(核質(zhì)比分別為110，154和227)。在設(shè)定的實驗條件下進行了質(zhì)譜鑒定實驗，毫無疑問，轉(zhuǎn)染Tet2蛋白的細胞基因組DNA中該峰為5caC(圖3C)。本發(fā)明人對Tetl蛋白也進行了相同的實驗，發(fā)現(xiàn)Tetl蛋白也具有氧化生成5caC的活性。實施例5、DNA糖苷酶TDG識別并切除5_羧基胞嘧啶在高表達Tet的小鼠胚胎干細胞及神經(jīng)細胞中沒有檢測到5-羧基胞嘧啶(M. Tahiliani et al. , Science 324,930 (May 15,2009))。從另外一個方面看，5-羧基胞嘧啶在化學(xué)上是穩(wěn)定的，在生理條件下，并不能自發(fā)脫羧變成胞嘧啶。這提出一種可能性，即在哺乳動物細胞中，5-羧基胞嘧啶一旦產(chǎn)生就會被主動地從基因組DNA中移除。所以本發(fā)明人著手檢測哺乳動物細胞的核抽提物中是否含有切除5caC的活性。本發(fā)明人用含有5caC的雙鏈DNA作為底物進行糖苷酶酶活測定。結(jié)果顯示，在小鼠ES細胞的核抽提物中能夠檢測到5caC特異的糖苷酶活性。將核抽提物與長度為20個核苷酸(20mer)的5caC底物孵育產(chǎn)生一個長度為9個的核苷酸(9mer)的剪切產(chǎn)物(圖4A)，這是通過移除5caC堿基產(chǎn)生一個脫堿基的位點，在堿性溶液中加熱處理DNA鏈產(chǎn)生了斷裂形成的。有意思的是，ES核抽提物與5hmC底物孵育并不能移除5hmC堿基。本發(fā)明人想知道哪一個糖苷酶介導(dǎo)了 caC的切除。經(jīng)反復(fù)研究本發(fā)明人認為TDG(thymine-DNA glycosylase)是最有可能介導(dǎo)caC切除的，因為該酶對于胚胎發(fā)育是必須的，且能夠移除由5-甲基胞嘧啶及胞嘧啶經(jīng)脫氨產(chǎn)生的胸腺嘧啶及尿嘧啶(T. Lindahl, R. D. Wood, Science286,1897 (Dec3,1999))。因此，本發(fā)明人用重組的TDG蛋白(圖14B)進行了糖苷酶活性檢測。結(jié)果顯示確實可以剪切5caC，但不能剪切5hmC。MBD4是另外一個可以移除鳥嘌呤對應(yīng)的尿嘧啶或者胸腺嘧啶的糖苷酶(D. Cortazar et al. ,Nature 470,419 (Feb 17，2011))，其對 5caC 沒有剪切活性。類似地，糖苷酶 UNG(uracil-DNA glycosylase)與 SMUGl (single-strand-selectivemonofunctional uracil DNA glycosylase I)可以從DNA中移除尿卩密唳及5-輕基尿卩密唳(B. Hendrich, U. Hardeland, H. H. Ng, J. Jiricny, A. Bird, Nature 401, 301 (Sep 16,1999)；H. E. Krokan, R. Standal, G. Slupphaug, Biochem J325 (Ptl)，I (Jul1,1997))，但沒有表現(xiàn)出5caC切除活性(圖4B)。TDG的5caC切除活性在轉(zhuǎn)染的HEK293T細胞中得到進一步的驗證。外源過表達野生型TDG可以清除共表達的Tet2產(chǎn)生的5caC，但喪失催化活性的TDG突變則沒有這種作用(圖4C)。與上述結(jié)果一致的是，Tdg knockdown的ES細胞的核抽提物缺少5caC切除活性(圖4D)。此外，從ES核抽提物中免疫剔除TDG(ES+anti-TDG)導(dǎo)致5caC切除活性的缺失(圖4A，lane3)。這些結(jié)果提示TDG具有特有的識別并切除DNA中5mC的氧化產(chǎn)物5caC的活性。實施例6、小鼠ES細胞中TDG的剔除導(dǎo)致了基因組中5caC的積累本發(fā)明人已經(jīng)在體內(nèi)和轉(zhuǎn)染的細胞中證明TDG可以從基因組DNA切除5caC。在此·基礎(chǔ)上，進一步研究如果剔除TDG是否可以在ES細胞中導(dǎo)致內(nèi)源5caC積累。為了確認這一點，本發(fā)明人利用siRNA的技術(shù)建立了 Tdg knockdown的穩(wěn)定細胞株,并且確定TDG蛋白的表達水平與對照細胞株相比的確明顯降低(圖15)。質(zhì)譜檢測的結(jié)果顯示,TDG knockdown的穩(wěn)定細胞株中可以清楚地檢測到5caC的信號，而在對照細胞株中無法清楚地看到(圖5A)。相似的，使用Tdg完全敲除的iPS細胞，本發(fā)明人也檢測到5caC的積累(圖16)。從質(zhì)譜定量的結(jié)果可以計算得到，在Tdg knockdown和敲除的iPS細胞中，5caC的含量為9000/基因組；而根據(jù)本發(fā)明人的實驗精度推測，野生型細胞中5caC的含量要低于1000/基因組。這些數(shù)據(jù)都說明，5caC在細胞內(nèi)源狀態(tài)下是存在的，只是其含量低于檢測底線；當TDG介導(dǎo)的堿基切除修復(fù)通路被阻斷后，導(dǎo)致5caC的積累從而可以清楚地檢測到。實施例7、白血病病人中的TET2突變使5mC和5hmC到5caC的轉(zhuǎn)變效率降低或喪失本發(fā)明人采用考馬斯亮藍染色檢測從瞬時轉(zhuǎn)染的293T細胞中純化的鼠Tet2野生型及突變體蛋白。如圖18A，其中E1231G，P1280S, H1795R及R1810S分別對應(yīng)于白血病患者中 TET2 的突變 E1318G, P1367S, H1881R 及 R1896S。采用HPLC檢測鼠Tet2野生型及突變體蛋白將5hmC底物轉(zhuǎn)變成5caC的能力，結(jié)果TET2突變使5mC和5hmC到5caC的轉(zhuǎn)變效率降低或喪失，如圖18B。實施例8、篩選方法(I) Tet雙加氧酶為基礎(chǔ)的篩選如前所述構(gòu)建表達Tet2雙加氧酶的重組載體，并轉(zhuǎn)化293T細胞，獲得可表達Tet2雙加氧酶的重組293T細胞。設(shè)置以下兩組測試組用候選物質(zhì)處理的上述重組293T細胞；對照組不用候選物質(zhì)處理的上述重組293T細胞。檢測測試組和對照組中Tet2雙加氧酶的表達量，若與對照組相比，測試組中Tet2雙加氧酶的表達量顯著增加(如增加30%以上)，則說明該候選物質(zhì)是潛在的可以促進DNA去甲基化的物質(zhì)。
(2) TDG為基礎(chǔ)的篩選如前所述構(gòu)建表達TDG的重組載體，并轉(zhuǎn)化293T細胞，獲得可表達TDG的重組293T細胞。設(shè)置以下兩組測試組用候選物質(zhì)處理的上述重組293T細胞；對照組不用候選物質(zhì)處理的上述重組293T細胞。檢測測試組和對照組中TDG的表達量，若與對照組相比，測試組中TDG的表達量顯著增加(如增加30%以上 )，則說明該候選物質(zhì)是潛在的可以促進DNA去甲基化的物質(zhì)。若與對照組相比，測試組中TDG的表達量顯著降低(如降低30%以上)，則說明該候選物質(zhì)是潛在的可以抑制DNA去甲基化的物質(zhì)。以前述針對小鼠Tdg基因第573-593位的shRNA作為候選物質(zhì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其能夠降低TDG的表達量30%以上，因此，其是可以抑制DNA去甲基化的物質(zhì)。(3) 5caC為基礎(chǔ)的篩選 測試組用候選物質(zhì)處理的細胞或組織；對照組不用候選物質(zhì)處理的細胞或組織。檢測測試組和對照組細胞或組織中(優(yōu)選核抽提物)5caC的含量，若與對照組相t匕，測試組中5caC的含量顯著增加或下降(有統(tǒng)計學(xué)意義，如下降20%)，則說明該候選物質(zhì)是潛在的可以調(diào)節(jié)DNA去甲基化或甲基化的物質(zhì)。所述的細胞或組織可以動物的正常細胞或組織，也可以是疾病狀態(tài)下的細胞或組織。實施例9、GADD45A通過調(diào)控TDG活性參與Tet-TDG介導(dǎo)的DNA主動去甲基化Niehrs 等的研究(G Barreto et al. , Nature445,671 (Feb8, 2007)提不 GADD45A蛋白通過參與DNA去甲基化途徑激活被CpG甲基化沉默的熒光素酶報告基因的表達。而Bellacosa等的研究(S Cortellino et al. , Cell 146, 67 (July 8, 2011))表明 TDG蛋白與Gadd45蛋白及AID蛋白形成復(fù)合物。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明人推測GADD45A通過調(diào)控TDG的活性而參與Tet-TDG介導(dǎo)的DNA主動去甲基化途徑。首先，本發(fā)明人分別從大腸桿菌中純化了 GST融合的TDG蛋白(GST-TDG的制備PCR法擴增TDG編碼序列，經(jīng)BamHI、XhoI酶切后插入到pGEX_4T載體的BamHI、XhoI位點。將PGEX-4T-TDG轉(zhuǎn)化BL21 (DE3)，并用IPTG誘導(dǎo)蛋白表達。參照GE healthcare的產(chǎn)品說明書用 Gluthione Sepharose4B 純化 GST-TDG ；TDG 蛋白序列參見 GenBank 登錄號 NP_766140所示)與GADD45A蛋白(GST-GADD45A的制備PCR法擴增GADD45A編碼序列，經(jīng)BglII、XhoI酶切后插入到PGEX-4T載體的BamHI、XhoI位點。將pGEX_4T_GADD45A轉(zhuǎn)化BL21 (DE3)，并用IPTG誘導(dǎo)蛋白表達。參照GE healthcare的產(chǎn)品說明書用Gluthione Sepharose 4B純化GST-TDG ;GADD45A蛋白序列參見GenBank登錄號NP_001915所示)，并分析GADD45A對TDG糖苷酶活性的影響。結(jié)果如圖19，50ng GST-TDG蛋白只能部分切除2nmol 5fC或5caC底物中的修飾胞嘧啶，其效率約為10%。隨著GADD45A蛋白加入量的逐漸增加，TDG對5fC及5caC底物的糖苷酶活性也逐漸增強。當GADD45A加入量達到I μ g時，TDG對5fC與5caC的切除效率達到了 90%以上。本發(fā)明人進一步實驗，將表達Tet2⑶、TDG (或其突變體(mut))、GADD45A (或其突變體(mut))的表達質(zhì)粒與M. SssI體外甲基化的熒光素酶報告基因載體按圖20中所示的組合方式轉(zhuǎn)染293T細胞(ATCC)。轉(zhuǎn)染后約48小時測定各轉(zhuǎn)染組的熒光素酶活性。圖20中可見，同時表達Tet2⑶、TDG及GADD45A蛋白能顯著促進被CpG甲基化沉默的熒光素酶報告基因的重新激活，而GADD45A和TDG的突變體對熒光素基因的激活能力都明顯下降，尤其是TDG的突變體能夠顯著抑制GADD45A介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活能力，這可能是喪失糖苷酶活性的TDG突變體保留了結(jié)合5caC的能力，從而與內(nèi)源TDG蛋白競爭Tet2⑶產(chǎn)生的5caC位點，起到Dominant Negative的作用。該結(jié)果提示,GADD45A通過調(diào)控TDG的活性而激活被DNA甲基化沉默的熒光素酶報告基因的表達。為了研究GADD45A對體內(nèi)產(chǎn)生的5caC的作用，本發(fā)明人將表達GADD45A的質(zhì)粒與表達Tet2的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)入293T細胞，并用高效液相色譜分析共轉(zhuǎn)293T細胞的基因組DNA中不同修飾胞嘧啶的含量。TDG作為已知的能切除5caC堿基的糖苷酶，與Tet2共轉(zhuǎn)入293T細胞后，能夠完全清除Tet2蛋白產(chǎn)生的5caC。而GADD45A與Tet共轉(zhuǎn)后的293T細胞中，HPLC檢測到5caC的含量顯著降低，如圖21A。同時將基因組DNA進行質(zhì)譜定量分析，數(shù)據(jù)顯示GADD45A與Tet2共轉(zhuǎn)后，5fC與5caC均有明顯降低，但是5mC與5caC含量則不受影響，如圖21B。實施例10、Tetl酶、ATP、20G和FAS (Fe2+)濃度對hmC/caC生成的影響實驗步驟I.在 96 孔板中每孔加入 50 μ I Avidin 溶液(加 40 μ I Avidin 儲液(2. 5mg/ml,Sigma, A9275)到 IOml 包被液中(IOOmM NaHCO3, pH9. 6，終濃度為 10 μ g/ml))。封住 96 孔板，4°C過夜或室溫1-2小時；2.體外酶反應(yīng)(總體積20 μ I每管):反應(yīng)液含50mM HEPES, pH8, 50mM NaCl，5ng生物素末端標記的含5mC的DNA(序列無特異性,但不含未修飾的C,通過普通PCR合成),2mM Ascorbic Acid,0,0. 04,0. 2 或 ImM 20G (Sigma, K1128)，0、0· 004,0. 02,0. I 或 100 μ MFAS(Fe2+)，0、0.04、0.2 或 ImM ATP 以及 ImM DTT，加入 O、150、300 或 600ng Tetl 酶，37°C反應(yīng)40分鐘；3.反應(yīng)結(jié)束后每管孔加入1/10體積的10%SDS，使終濃度為1%，混勻，室溫放置5分鐘，加入TE至總體積80 μ I ;4.用洗滌緩沖液(500mM NaCl, ImM EDTA inlXTBST)清洗 Avidin包被的 96 孔板3次(每次3分鐘);5. DNA結(jié)合轉(zhuǎn)移40微升第3步的液體到96孔板的一孔中，可每個樣品設(shè)至少I個復(fù)孔，室溫振搖5分鐘；6.用洗滌緩沖液洗板一次，2分鐘；7. DNA變性每孔加入2M的HCl 70 μ I，室溫2分鐘；8.棄上清，加入 100 μ IlOOmM Tris. HC1，ρΗ8· 0，室溫 2 分鐘，再用 TBST 洗一次；
9.封閉加入3%BSA_TBST，每孔60 μ I，室溫振搖30分鐘；10.棄上清,加入mC、hmC或caC抗體(Anti-mC為商品化小鼠源抗體,Anti-hmC或caC為兔源抗體)稀釋液每孔40 μ 1，室溫振搖30分鐘；11.棄上清，TBST洗板2次，每次3分鐘；12.加入抗小鼠或兔的IgG抗(均為商品化抗體)稀釋液每孔40 μ I，室溫振搖30分鐘；
13.棄上清，TBST洗板3次，每次4分鐘；14.加入ECL反應(yīng)液每孔40 μ I，曝光檢測。結(jié)果如圖22，圖中除酶外，反應(yīng)液組份為(除非濃度特別標出):50mM HEPES,pH8. O,50mM NaCl,ImM ATP,2mM ascorbic acid,ImM 2-oxoglutarate(20G),100 μ MFe (NH4)2(SO4)2(FAS)，以及 ImM DTT，底物為含有 mC 的 67bpDNA 雙鏈(序列5 ’-TTGATGGATATGGTGGAATTCGATAACGACCCTACCGGAGGAACGAACGATCACATACACATCACTT-3’(SEQ ID NO :7);所有C均為caC ;該序列的互補鏈的5’端帶有生物素標記)，反應(yīng)在37° C孵育40分鐘。圖中信號越強(灰度越高)表示生成的量越多。注意各組中，隨著相應(yīng)的加入反應(yīng)成份的量增加，底物mC相應(yīng)會減少，伴隨著產(chǎn)物caC相應(yīng)增加。hmC作為中間產(chǎn)物，變化趨勢不明顯。Tet2酶的實驗結(jié)果與Tetl酶的結(jié)果類似，而Tet3酶的催化活性比Tetl或Tet2明顯弱(此處沒有顯示)。 信號越強(灰度越高)表示Tetl酶、ATP、20G或FAS的量越多。各組中，隨著底物mC的減少，產(chǎn)物caC相應(yīng)增加。hmC作為中間產(chǎn)物，變化趨勢不明顯。討論已知TDG可以切除DNA中的5mC或5mC的脫氨產(chǎn)物，但是這些功能是否與DNA的去甲基化相關(guān)還不清楚。而且目前還沒有令人信服的證據(jù)表明有何種酶可以特異地介導(dǎo)5mC的脫氨來產(chǎn)生胸腺嘧啶錯配，TDG也沒有針對5mC的糖苷酶活性(S. C. Wu, Y. Zhang, Nat RevMol Cell Biol 11,607 (Sep,2010) ；D. Cortazar et al. , Nature470,419(Feb 17,2011))。在5mC的切除或者脫氨都還缺乏實驗證據(jù)的背景下，本發(fā)明清楚的證明了 Tet雙加氧酶可以氧化5mC和5hmC轉(zhuǎn)變?yōu)?caC，后者進一步成為TDG的底物。因而，Tet介導(dǎo)的5mC和5hmC轉(zhuǎn)變?yōu)?caC能夠啟動TDG起始的BER通路。這一系列的反應(yīng)最終能導(dǎo)致DNA的去甲基化，因為未甲基化的胞嘧啶插入到了修復(fù)的基因組區(qū)域(圖5B)。基因組范圍的蛋白分布分析顯示Tetl在ES細胞中相對富集于含較多CpG的未甲基化的活躍啟動子部位(G. Ficz et al. , Nature, (Apr3, 2011) ；ff. A. Pastor et al.,Nature,(May8,2011) ；C. X. Song et al. ,Nat Biotechnol29,68 (Jan,2011) ；H. Wu et al.，Genes Dev25,679 (AprI, 2011)),但絕大部分 Tetl 結(jié)合位點不含 5hmC(K. Williams etal. , Nature, (Aprl3,2011) ；Y. Xuet al. , Mol Cell, (Apr20,2011) ；H. Wu et al. , Nature,(Mar30,2011)) 0這些表面上矛盾的現(xiàn)象或許可以這樣解釋是否在Tetl結(jié)合的活躍啟動子部位，通過Tetl氧化偶爾發(fā)生的5mC成5caC，后者進一步通過TDG介導(dǎo)的BER通路去除，從而避免了錯誤的甲基化。在這種情況下，5mC在活躍啟動子部位極有可能檢測不到，因為它們只是在小部分細胞中短暫存在。同樣的，在許多Tetl結(jié)合位點，5hmC含量不高，因為它們很快被轉(zhuǎn)換成5caC，在細胞中被去除。在ES細胞和神經(jīng)元中存在穩(wěn)定水平的5hmC而不是5caC，這一事實提示氧化5hmC到5caC是去甲基化過程中的限速步驟；并提示除了作為DNA甲基化過程中的中間體外，5hmC也具有基因組標記的功能。在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.一種DNA去甲基化的方法，包括 (1)以Tet雙加氧酶處理DNA，將DNA中5-甲基胞嘧啶或5-羥甲基胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)?-羧基胞嘧啶； (2)以胸腺嘧啶DNA糖基化酶處理步驟(I)獲得的DNA，將DNA中5-羧基胞嘧啶切除。
(3)通過DNA剪切修復(fù)途徑，在5-羧基胞嘧啶切除位點加上非甲基化的胞嘧啶。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)中 以胸腺嘧啶DNA糖基化酶處理DNA的同時，還加入GADD45A。
3.—種將DNA中5-甲基胞嘧啶或5-羥甲基胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)?-羧基胞嘧啶的方法，包括以Tet雙加氧酶處理DNA。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，在以Tet雙加氧酶處理DNA時，還包括加入ATP, Fe2+和/或2-酮戊二酸；或加入可形成ATP，F(xiàn)e2+和/或2-酮戊二酸的物質(zhì)。
5.一種將DNA中5-羧基胞嘧啶切除的方法，包括以胸腺嘧啶DNA糖基化酶處理DNA。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，以胸腺嘧啶DNA糖基化酶處理DNA的同時，還加入GADD45A。
7.Tet雙加氧酶或其促進劑的用途，用于將DNA中5-甲基胞嘧啶或5-羥甲基胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)?-羧基胞嘧啶；或用于制備將DNA中5-甲基胞嘧啶或5-羥甲基胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)?-羧基胞嘧啶的組合物。
8.Tet雙加氧酶的抑制劑的用途，用于抑制DNA中5-甲基胞嘧啶或5-羥甲基胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)?-羧基胞嘧啶；或用于制備抑制DNA中5-甲基胞嘧啶或5-羥甲基胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)?-羧基胞嘧啶的組合物。
9.胸腺嘧啶DNA糖基化酶或其促進劑的用途，用于將DNA中5-羧基胞嘧啶切除；或用于制備將DNA中5-羧基胞嘧啶切除的組合物。
10.胸腺嘧啶DNA糖基化酶的抑制劑的用途，用于抑制DNA中5-羧基胞嘧啶切除；或用于制備抑制DNA中5-羧基胞嘧啶切除的組合物。
11.一種DNA去甲基化的試劑盒，其中包括 Tet雙加氧酶或其促進劑；和 胸腺嘧啶DNA糖基化酶或其促進劑。
12.如權(quán)利要求11所述的試劑盒，其特征在于，還包括GADD45A或其促進劑。
13.一種抑制DNA去甲基化的試劑盒，其中包括 Tet雙加氧酶的抑制劑；和 胸腺嘧啶DNA糖基化酶的抑制劑。
14.一種篩選調(diào)節(jié)DNA甲基化/去甲基化狀態(tài)的潛在物質(zhì)的方法，包括 (1)用候選物質(zhì)處理表達Tet雙加氧酶的體系；和 (2)檢測所述體系中Tet雙加氧酶的轉(zhuǎn)錄、表達或活性； 其中，若所述候選物質(zhì)可提高Tet雙加氧酶的轉(zhuǎn)錄、表達或活性，則表明該候選物質(zhì)是促進DNA去甲基化的潛在物質(zhì)；若所述候選物質(zhì)可降低Tet雙加氧酶的轉(zhuǎn)錄、表達或活性，則表明該候選物質(zhì)是導(dǎo)致DNA甲基化的潛在物質(zhì)。
15.一種篩選調(diào)節(jié)DNA甲基化/去甲基化狀態(tài)的潛在物質(zhì)的方法，包括 (I)用候選物質(zhì)處理表達胸腺嘧啶DNA糖基化酶的體系；和(2)檢測所述體系中胸腺嘧啶DNA糖基化酶的轉(zhuǎn)錄、表達或活性； 其中，若所述候選物質(zhì)可提高胸腺嘧啶DNA糖基化酶的轉(zhuǎn)錄、表達或活性，則表明該候選物質(zhì)是促進DNA去甲基化的潛在物質(zhì)；若所述候選物質(zhì)可降低胸腺嘧啶DNA糖基化酶的轉(zhuǎn)錄、表達或活性，則表明該候選物質(zhì)是抑制DNA去甲基化的潛在物質(zhì)。
16.如權(quán)利要求14或15所述的方法，其特征在于，步驟(I)包括在測試組中，將候選物質(zhì)加入到表達Tet雙加氧酶或胸腺嘧啶DNA糖基化酶的體系；和/或 步驟(2)包括檢測測試組的體系中Tet雙加氧酶或胸腺嘧啶DNA糖基化酶的轉(zhuǎn)錄、表達、活性，并與對照組比較，其中所述的對照組是不添加所述候選物質(zhì)的表達Tet雙加氧酶或胸腺嘧啶DNA糖基化酶的體系； 如果測試組中Tet雙加氧酶或胸腺嘧啶DNA糖基化酶的轉(zhuǎn)錄、表達、活性在統(tǒng)計學(xué)上高于對照組，則表明該候選物質(zhì)是促進DNA去甲基化的潛在物質(zhì)；如果測試組中Tet雙加氧酶或胸腺嘧啶DNA糖基化酶的轉(zhuǎn)錄、表達、活性在統(tǒng)計學(xué)上低于對照組，則表明該候選物質(zhì)是抑制DNA去甲基化的潛在物質(zhì)。
17.—種篩選TET雙加氧酶活性調(diào)節(jié)劑的方法，包括 (1)以Tet雙加氧酶處理DNA，不加入或加入候選物質(zhì)； (2)檢測5caC水平； 其中，若所述候選物質(zhì)可在統(tǒng)計學(xué)上降低5caC水平，則表明該候選物質(zhì)是TET雙加氧酶的抑制劑；若所述候選物質(zhì)可在統(tǒng)計學(xué)上增加5caC水平，則表明該候選物質(zhì)是TET雙加氧酶的促進劑。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，在以Tet雙加氧酶處理DNA時，還包括加入ATP, Fe2+和/或2-酮戊二酸；或加入可形成ATP，F(xiàn)e2+和/或2-酮戊二酸的物質(zhì)。
19.一種篩選TDG活性調(diào)節(jié)劑的方法，包括 (1)以TDG處理DNA，不加入或加入候選物質(zhì)； (2)檢測5caC水平； 其中，若所述候選物質(zhì)在統(tǒng)計學(xué)上可增加5caC水平，則表明該候選物質(zhì)是TDG的抑制劑；若所述候選物質(zhì)可在統(tǒng)計學(xué)上降低5caC水平，則表明該候選物質(zhì)是TDG的促進劑。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，在以TDG處理DNA時，還包括加入Tet雙加氧酶或Gadd45a，或兩者同時加入。
21.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述的處理DNA是指在細胞內(nèi)過表達后處理細胞內(nèi)DNA，或在體外直接處理DNA。
全文摘要
本發(fā)明涉及調(diào)節(jié)核酸的甲基化/去甲基化狀態(tài)的方法和試劑。本發(fā)明人首次證實，基因組DNA中的5-甲基胞嘧啶(5mC)和5-羥甲基胞嘧啶(5hmC)都可以被Tet雙加氧酶氧化為5-羧基胞嘧啶(5caC)。胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)可以特異性地識別該5caC，并將其從基因組中切除，引起DNA主動去甲基化。因此，可基于此來調(diào)節(jié)基因組中DNA的甲基化/去甲基化作用，以及制備調(diào)節(jié)基因組中DNA的甲基化/去甲基化作用的試劑。本發(fā)明確證了細胞中基因組DNA存在5caC修飾，5caC修飾譜式可用來監(jiān)測細胞狀態(tài)，并發(fā)現(xiàn)ATP及其類似物可以作為Tet酶的調(diào)節(jié)劑。并且，白血病中Tet突變使5caC活性降低或喪失。
文檔編號C12Q1/68GK102888395SQ20121025603
公開日2013年1月23日 申請日期2012年7月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月22日
發(fā)明者徐國良 申請人:中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院