專利名稱：一株產(chǎn)朊假絲酵母菌株及其在制備富硒酵母產(chǎn)品中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一株產(chǎn)朊假絲酵母菌株及其在制備富硒酵母產(chǎn)品中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
1817年瑞典化學(xué)家Berzeliu首次發(fā)現(xiàn)元素硒(selenium)后，人們一直把硒作為有毒元素來研究，直到1957年美國科學(xué)家Sehwarz等發(fā)現(xiàn)硒的營養(yǎng)功效，使人們又從一個(gè)嶄新的角度來研究硒。1972年Roetueh證實(shí)硒是谷膚甘膚過氧化物酶(GPX)活性成分，于是，硒被公認(rèn)為是生命所必需的微量元素。1973年，世界衛(wèi)生組織宣布硒是人類必需的微量兀素。中國營養(yǎng)學(xué)會也于1988年把硒列為必需的營養(yǎng)微量兀素。
硒作為人和動物一種必需的營養(yǎng)微量元素，參與組成多種酶的活性結(jié)構(gòu)，在過氧化物的分解和自由基的清除、機(jī)體免疫力的調(diào)節(jié)、有毒元素的拮抗等方面發(fā)揮著重要作用雖然無機(jī)硒也能參與肝臟中谷胱甘肽過氧化物酶的合成，對缺硒引起的疾病起預(yù)防和治療作用，但人體對于無機(jī)硒的吸收效果并不理想，過多的無機(jī)硒會對機(jī)體帶來一定的損害。研究表明，有機(jī)硒較無機(jī)硒毒性小，機(jī)體吸收率高。有機(jī)硒可克服無機(jī)硒的過氧化作用，其生物活性較高，能夠有效地在機(jī)體內(nèi)同化，有利于在動物體內(nèi)吸收利用。目前，人們獲得有機(jī)硒的主要途徑是生物轉(zhuǎn)化，由于微生物具有生長迅速、繁殖快、代謝能力強(qiáng)、適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn)，因此利用微生物進(jìn)行硒的生物轉(zhuǎn)化不受季節(jié)和氣候的影響，且生產(chǎn)周期短，近些年來，用微生物作為載體富集人和動物所必需的微量元素，以獲得有機(jī)態(tài)及成本低廉的微量元素添加劑日益引起了各國的關(guān)注。酵母菌具有富集多種微量元素的能力，又是發(fā)酵工業(yè)中最常用的菌種之一，發(fā)酵工藝成熟，生產(chǎn)周期短，是作為元素載體可能性最大的菌種，具有高度的富集硒能力和將無機(jī)硒轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒的能力。因此，開發(fā)成本低廉、生物學(xué)利用價(jià)值高的酵母硒成為近來研究的熱點(diǎn)，而且包括硒酵母在內(nèi)的微量元素載體酵母具有豐富而全面的營養(yǎng)成份，將作為酵母工業(yè)的新品種，對酵母工業(yè)的發(fā)展也會起促進(jìn)作用。硒酵母既能提供人體必需的營養(yǎng)元素硒，又能補(bǔ)充人體豐富的蛋白質(zhì)和多種維生素。其中富硒酵母中的硒多為有機(jī)態(tài)的硒，其利用率高、毒性低、對環(huán)境污染小，很適宜作為補(bǔ)硒的一種營養(yǎng)添加劑。我國相當(dāng)一部分地區(qū)是缺硒地區(qū)，尤其是中國黑龍江地區(qū)表現(xiàn)出的急性缺硒而引起的克山病等，如果使用安全的硒酵母，能短期治愈克山病。小劑量服用硒酵母，可以增強(qiáng)肌體免疫力，保護(hù)心臟，防癌和延緩衰老。通過微生物生命活動將無機(jī)硒轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒，是生產(chǎn)富硒食品的一種安全有效的方法。富硒酵母的生產(chǎn)是迄今最常用、最簡便的一種生物富硒途徑。近年來，對于富硒酵母的研究比較多，但大多數(shù)的研究課題中，其菌株的富硒能力都較弱一般含硒量在500-1500mg/kg之間，生物量也很低，很難達(dá)到一個(gè)大生產(chǎn)需要的高密度的量，而且重現(xiàn)性差。另外，其酵母中硒的形態(tài)也主要是吸附在細(xì)胞表面或是與細(xì)胞混合而成的無機(jī)硒形態(tài)，硒的有機(jī)形態(tài)，特別是硒蛋氨酸的含量極低，營養(yǎng)價(jià)值有限。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的ー個(gè)目的是提供ー株產(chǎn)朊假絲酵母菌株。本發(fā)明提供的產(chǎn)朊假絲酵母(Candida utilis) S1204，其保藏編號為CCTCC N0:M2012216。上述產(chǎn)朊假絲酵母S1204在生產(chǎn)富硒酵母產(chǎn)品中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。
本發(fā)明的另ー個(gè)目的是提供一種富硒酵母產(chǎn)品。本發(fā)明提供的富硒酵母產(chǎn)品，其活性成分為上述產(chǎn)朊假絲酵母S1204的發(fā)酵物。上述富硒酵母產(chǎn)品中的有機(jī)硒含量為4000-10000mg/kg，所述有機(jī)硒轉(zhuǎn)化率為98. 8%。上述產(chǎn)品中，所述發(fā)酵產(chǎn)物按照如下方法制備在含無機(jī)硒的發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵上述產(chǎn)朊假絲酵母S1204，得到發(fā)酵產(chǎn)物；該方法還可以包括將發(fā)酵產(chǎn)物過濾，收集固體過濾產(chǎn)物。上述產(chǎn)品中，所述含無機(jī)硒的發(fā)酵培養(yǎng)基中的無機(jī)硒為亞硒酸鈉，所述亞硒酸鈉在所述含無機(jī)硒的發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度具體為50-100mg/l。上述發(fā)酵包括如下步驟I)在所述含無機(jī)硒的發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵上述產(chǎn)朊假絲酵母S1204，得到發(fā)酵產(chǎn)物；2)再向所述發(fā)酵產(chǎn)物中添加亞硒酸鈉繼續(xù)發(fā)酵，所述亞硒酸鈉在所述發(fā)酵產(chǎn)物中的終濃度為200mg/L ；所述發(fā)酵和所述繼續(xù)發(fā)酵的溫度具體均為28°C，所述發(fā)酵的時(shí)間具體為12h，所述繼續(xù)發(fā)酵的時(shí)間具體為22h-28h ；所述發(fā)酵和所述繼續(xù)發(fā)酵的溶氧量具體均為50-70% ;所述發(fā)酵和所述繼續(xù)發(fā)酵的含糖量具體均為I. 0-2. 0g/100mL，所述發(fā)酵和所述繼續(xù)發(fā)酵的pH值具體均為5. 5-6. O。上述含無機(jī)硒的發(fā)酵培養(yǎng)基按照如下方法制備將含糖量9-11% (質(zhì)量百分含量)的麥芽汁、蛋白胨、酵母膏和亞硒酸鈉混合得到含無機(jī)硒的發(fā)酵培養(yǎng)基，所述蛋白胨在所述含無機(jī)硒的發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為15g/L，所述酵母膏在所述含無機(jī)硒的發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為8g/L，所述亞硒酸鈉在所述含無機(jī)硒的發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為100mg/L。本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種制備上述富硒酵母產(chǎn)品的方法。本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟在含無機(jī)硒的發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵上述產(chǎn)朊假絲酵母S1204，收集發(fā)酵產(chǎn)物，即得到富硒酵母產(chǎn)品。上述方法中，所述含無機(jī)硒的發(fā)酵培養(yǎng)基中的無機(jī)硒為亞硒酸鈉，所述亞硒酸鈉在所述含無機(jī)硒的發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度具體為50-100mg/l。上述方法中，所述發(fā)酵包括如下步驟I)在所述含無機(jī)硒的發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵上述產(chǎn)朊假絲酵母S1204，得到發(fā)酵產(chǎn)物；2)再向所述發(fā)酵產(chǎn)物中添加亞硒酸鈉繼續(xù)發(fā)酵，所述亞硒酸鈉在所述發(fā)酵產(chǎn)物中的終濃度為200mg/L。上述方法中，所述發(fā)酵和所述繼續(xù)發(fā)酵的溫度均為28°C，所述發(fā)酵的時(shí)間為12h，所述繼續(xù)發(fā)酵的時(shí)間為22h-28h ；
所述發(fā)酵和所述繼續(xù)發(fā)酵的溶氧量均為50-70% ;所述發(fā)酵和所述繼續(xù)發(fā)酵的含糖量均為I. 0-2. 0g/100mL，所述發(fā)酵和所述繼續(xù)發(fā)酵的pH值均為5. 5-6. 0 ；在所述收集發(fā)酵產(chǎn)物后還包括如下步驟過濾所述發(fā)酵產(chǎn)物、收集固體過濾產(chǎn)物、干燥所述固體過濾產(chǎn)物，得到富硒酵母產(chǎn)品。上述含無機(jī)硒的發(fā)酵培養(yǎng)基按照如下方法制備將含糖量9-11% (質(zhì)量百分含量)的麥芽汁、蛋白胨、酵母膏和亞硒酸鈉混合得到含無機(jī)硒的發(fā)酵培養(yǎng)基，所述蛋白胨在所述含無機(jī)硒的發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為15g/L，所述酵母膏在所述含無機(jī)硒的發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為8g/L，所述亞硒酸鈉在所述含無機(jī)硒的發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為100mg/L。上述方法中，在所述發(fā)酵前，還包括如下步驟I)將上述產(chǎn)朊假絲酵母S1204 CCTCC N0:M2012216接種 在斜面培養(yǎng)基28°C培養(yǎng)16h，得到斜面菌株；2)將上述斜面菌株接種在80mL的種子培養(yǎng)基中28°C、220r/min、振蕩培養(yǎng)16h，得到一級種子培養(yǎng)液；2)將所述一級種子培養(yǎng)液接種在20L的種子培養(yǎng)基中28°C、220r/min、振蕩培養(yǎng)16h，得到ニ級種子液；3)將所述ニ級種子培養(yǎng)液接種在250L的種子培養(yǎng)基中28°C、220r/min、振蕩培養(yǎng)16h，得到三級種子液。斜面培養(yǎng)基按照如下方法制備將葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、瓊脂、亞硒酸鈉和水混合，得到斜面培養(yǎng)基，其中葡萄糖的終濃度為20g/L，蛋白胨的終濃度為20g/L，酵母膏的終濃度為10g/L，瓊脂的終濃度為20g/L，亞硒酸鈉的終濃度為30ug/mL。種子培養(yǎng)基按照如下方法制備將含糖量9%(質(zhì)量百分含量)的麥芽汁、蛋白胨、酵母膏和亞硒酸鈉混合得到種子培養(yǎng)基，蛋白胨在種子培養(yǎng)基中的濃度為15g/L，酵母膏在種子培養(yǎng)基中的濃度為8g/L，亞硒酸鈉在種子培養(yǎng)基中的濃度為50mg/L。初始pH值為5. 5。上述的富硒酵母產(chǎn)品在作為漁業(yè)養(yǎng)殖和/或牲畜養(yǎng)殖的飼料添加劑中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。上述產(chǎn)朊假絲酵母(Candida utilis) S1204，已于2012年6月11日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCCdii :中國武漢，武漢大學(xué)；郵編430072)，保藏編號為CCTCC N0:M2012216，分類命名為產(chǎn)朊假絲酵母菌株 S1204 (Candida utilis S1204)。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明利用分子生物學(xué)手段對出發(fā)菌株進(jìn)行こ醇發(fā)酵途徑的削弱得到的，減少菌株產(chǎn)こ醇的量，提高菌株的好氧生長能力，再結(jié)合多次的物理-化學(xué)復(fù)合誘變，利用高通量的篩選手段，選育的出一株新的產(chǎn)朊假絲酵母(Candida utilis)S1204。該菌株具有高濃度亞硒酸鈉耐受性及こ硫氨酸抗性，其在進(jìn)行高生物量發(fā)酵的同時(shí)具有較高的轉(zhuǎn)硒富硒能力，該菌株為高效富硒的酵母菌株，可以用來制備富硒產(chǎn)品，該產(chǎn)品中有機(jī)硒含量高達(dá)9880mg/kg，且99%的硒為有機(jī)硒形態(tài)，其中硒蛋氨酸占富硒酵母產(chǎn)品有機(jī)硒含量的70%。本菌株發(fā)酵生產(chǎn)富硒產(chǎn)品的原料來源廣泛、操作簡便、發(fā)酵周期短，而且酵母中的有機(jī)硒含量高，尤以活性的硒蛋氨酸為主，其對于飼料添加方面，安全無毒、無副作用，可顯著改善動物肉質(zhì)營養(yǎng)，提高肉質(zhì)品質(zhì)，同時(shí)促進(jìn)動物健康發(fā)育，提高機(jī)體免疫力，具有重大的經(jīng)濟(jì)和社會效益。
具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。產(chǎn)朊假絲酵母菌株(Candida utilis)獲自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(www. china-cicc. org/,簡稱 CICC), CICC 編號為 1268,簡稱產(chǎn)I元假絲酵母 1268。麥芽汁制備大麥芽若干，粉碎后，加入4倍于麥芽重量的水,攪拌均勻,在60°C保溫箱內(nèi)糖化4h，取出過濾，得麥芽汁，測量此麥芽汁的體積和濃度后，分裝于已滅菌的三角瓶中，O. 6kg/cm2滅菌40min備用，用時(shí)將濾液稀釋至所需糖度。實(shí)施例I、菌株S1204的獲得和保藏以菌株產(chǎn)朊假絲酵母1268為出發(fā)菌(購自于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，CICC編號為1268)，通過多次的物理-化學(xué)復(fù)合誘變育種和高通量的篩選方法選育高生物量和高轉(zhuǎn)硒的酵母菌種S1204，具體方法如下一、菌株的UV (紫外)誘變和NTG (亞硝基胍)的復(fù)合誘變處理取生長對數(shù)期的產(chǎn)朊假絲酵母1268菌液5mL以4800r/min離心5min,用無菌水洗滌2次，加入pH7. 2磷酸緩沖液，制成菌懸液。取制備好的菌懸液全量置于直徑為9cm的無菌平皿內(nèi)，放入無菌磁力攪拌棒，置磁力攪拌器上，紫外燈預(yù)熱20min,使光波穩(wěn)定。菌懸液平皿距15W紫外燈25cm處照射45s，紫外照射后，將處理后的菌懸液加入含有終濃度為O. 5%NTG的滅菌試管中(18 X 180mm)，28°C，150r/min，避光振蕩處理60min,加入終體積6%硫代硫酸鈉溶液終止反應(yīng)，離心收集菌體，并用無菌生理鹽水清洗4次，進(jìn)行終止NTG誘變反應(yīng)以及。加入5mL YPD,培養(yǎng)12小時(shí)。二、誘變菌株的亞硒酸鈉抗性平板和乙硫氨酸抗性平板的篩選誘變處理后的過夜培養(yǎng)的菌液，再次離心收集菌體，并用生理鹽水洗滌2次。先進(jìn)行稀釋IO5涂布含亞硒酸鈉的抗性平板。將在亞硒酸鈉抗性平板長出的菌落進(jìn)行影印至含有乙硫氨酸的抗性平板上。經(jīng)過多次的誘變和篩選過程，獲得耐受高濃度亞硒酸鈉(200mg/L)以及高乙硫氨酸(4g/L)抗性的酵母菌株，而且其發(fā)酵生物量在同等條件下較出發(fā)菌株提高了近一倍。獲得的高生物量、高耐硒轉(zhuǎn)硒的產(chǎn)朊假絲酵母菌株，編號S1204。將上述獲得的產(chǎn)朊假絲酵母菌株(Candida utilis) S1204，簡稱富硒酵母S1204，于2012年6月11日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC ;地址中國武漢，武漢大學(xué)；郵編430072)，保藏編號為CCTCC N0:M2012216，分類命名為產(chǎn)朊假絲酵母菌株S1204(Candida utilis S1204)。實(shí)施例2、富硒酵母S1204 CCTCC N0:M2012216在富硒中的應(yīng)用一、培養(yǎng)基配方的優(yōu)化培養(yǎng)基中，麥芽汁為培養(yǎng)基中的主要碳源，添加的糖度為90g/L_110g/L時(shí)可得到最高生物量與硒含量；蛋白胨和酵母膏為培養(yǎng)基中的氮源；亞硒酸鈉為培養(yǎng)基中的無機(jī)硒源選擇，種子培養(yǎng)基的初始添加量為50mg/L，發(fā)酵培養(yǎng)基的初始添加量為100mg/L，流加補(bǔ)硒的亞硒酸鈉濃度為10g/L。優(yōu)化培養(yǎng)基具體配方如下種子培養(yǎng)基按照如下方法制備將含糖量90g/L的麥芽汁、蛋白胨、酵母膏和無水亞硒酸鈉混合得到種子培養(yǎng)基，蛋白胨在種子培養(yǎng)基中的濃度為15g/L，酵母膏在種子培養(yǎng)基中的濃度為8g/L，亞硒酸鈉在種子培養(yǎng)基中的初始添加濃度為50mg/L，該種子培養(yǎng)基初始PH值為5.5。發(fā)酵培養(yǎng)基按照如下方法制備將含糖量110g/L的麥芽汁、蛋白胨、酵母膏和無水亞硒酸鈉混合得到種子培養(yǎng)基，蛋白胨在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為15g/L，酵母膏在發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度為8g/L，亞硒酸鈉在發(fā)酵培養(yǎng)基中的初始添加濃度為100mg/L，該發(fā)酵培養(yǎng)基初始PH值為6。 ニ、獲得富硒酵母產(chǎn)品I、發(fā)酵(I)斜面菌株培養(yǎng)將富硒酵母S1204 CCTCC N0:M2012216接種于含葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母膏10g/L，瓊脂20g/L，亞硒酸鈉30ug/mL的斜面培養(yǎng)基(18*180mm試管)。28°C，培養(yǎng)16h。(2)搖瓶一級種子培養(yǎng)吸取6mL無菌水至18*1801111]1的試管斜面,洗脫斜面菌株制成菌懸液(3\107個(gè)/ml)，然后再按2%的接種量接種至含有80mL的種子培養(yǎng)基的500mL搖瓶中，8層紗布封ロ，28°C振蕩培養(yǎng)(220r/min) 16h，得到一級種子培養(yǎng)液(種子液的0D6(l(lmi=50)。(3) ニ級種子培養(yǎng)將ー級種子培養(yǎng)液按1%(體積百分含量)的接種量移種至含20L種子培養(yǎng)基的50L全自動發(fā)酵罐，28°C，pH5. 5培養(yǎng)16h，得到搖瓶ニ級種子培養(yǎng)液(種子液的0D6(l(lmi=70)(4)三級種子培養(yǎng)將ニ級種子培養(yǎng)液按5% (體積百分含量)的接種量移種至含250L種子培養(yǎng)基的500L全自動發(fā)酵罐，培養(yǎng)溫度28°C，pH6. 0，培養(yǎng)16h，得到搖瓶三級種子培養(yǎng)液(種子液的OD600nm-75 )。(5)發(fā)酵培養(yǎng)將三級種子培養(yǎng)液按12% (體積百分含量)的接種量移種至5M3發(fā)酵罐(裝液量為45%) 28°C，溶氧控制50-70%，含糖量控制I. 0-2. 0g/100mL,pH維持5. 5-6. 0，發(fā)酵12h后在發(fā)酵產(chǎn)物中補(bǔ)加終濃度為200mg/L的亞硒酸鈉，再發(fā)酵培養(yǎng)22h，發(fā)酵菌濃達(dá)到OD6cicimi=ISS,收集發(fā)酵產(chǎn)物。2、富硒能力測定I)收集將上述發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行板框過濾，收集富硒酵母細(xì)胞，并用清水進(jìn)行洗滌兩次，65°C風(fēng)干至水分為7% ;然后對風(fēng)干的富硒酵母進(jìn)行粉碎，最后根據(jù)需要進(jìn)行包裝，得到富硒酵母產(chǎn)品。ニ、富硒能力的測定I、有機(jī)硒含量檢測
準(zhǔn)確稱取I. OOOg富硒酵母產(chǎn)品，置于燒瓶中，加入5ml消化液，接上冷凝裝置，回流冷凝消化至樣液呈無色透明為止；冷卻后，消化液轉(zhuǎn)入200ml的燒杯，用大約20ml的蒸餾水洗凈；然后用90%的甲酸調(diào)節(jié)pH至2-3，加入4ml、40%的鹽酸羥胺還原過剩的氧化成分，最后將溶液用蒸餾水定溶到50ml，此即為消化好的待測樣品。根據(jù)亞甲藍(lán)還原法檢測待測溶液的顯色程度。亞甲藍(lán)還原法檢測原理在酸性條件下，亞硒酸根可與3，3'- 二氨基聯(lián)苯胺(DAB)作用，生成黃色絡(luò)合物(Se-DAB)，在一定pH時(shí)，使用有 機(jī)溶劑萃取，根據(jù)有機(jī)層顯色的程度，可進(jìn)行分光光度法測定富硒酵母產(chǎn)品中的有機(jī)硒硒含量。上述消化液稱取IOg鑰酸鈉，加150ml蒸餾水溶解，緩慢添加150ml濃硫酸，冷卻，加入200ml濃度為72%的高氯酸；用飽和的NaOH調(diào)節(jié)pH在7. O左右。無水亞硒酸鈉、鑰酸鈉、3，3'- 二氨基聯(lián)苯胺，甲酸、濃硫酸、高氯酸、甲苯等均購自于阿拉丁 (上海)試劑有限公司，試劑均為分析純。具體方法如下(依次進(jìn)行以下操作)(I)取5支125ml的分液漏斗，分別加入2. 0,4. 0,6. 0,8. O、10. Oml的亞硒酸鈉水溶液(lmg/L)，然后均加蒸餾水至40ml ；(2)每支漏斗加入2ml O. 2mol/L的EDTA_2Na水溶液以掩蓋干擾離子，用甲酸調(diào)節(jié)pH 至 3 ;(3)每支漏斗加入4ml 5g/L的DAB水溶液，搖勻，黑暗條件下60°C反應(yīng)20min ；(4)用濃NaOH調(diào)節(jié)pH至7. O,然后每支漏斗加入4ml甲苯,充分搖勻，靜置4min分層；(5)將有機(jī)層通過脫脂棉濾到Icm的比色皿中，于420nm處測定溶液的吸光度(甲苯作為空白對照)。以吸光值A(chǔ)為橫坐標(biāo)，以硒濃度Y (單位為mg/L)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。制備的待測溶液代替亞硒酸鈉水溶液進(jìn)行以上步驟(I)至(5)的實(shí)驗(yàn)，將吸光值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=O. 0126X+0. 00151 (R2=O. 99994)，得到的結(jié)果即為富硒酵母產(chǎn)品中的有機(jī)
硒濃度。 富硒能力(有機(jī)硒轉(zhuǎn)化率)=(富硒酵母產(chǎn)品中的有機(jī)硒含量/發(fā)酵培養(yǎng)基的總的無機(jī)硒含量)X 100%。結(jié)果為富硒酵母產(chǎn)品中的有機(jī)硒濃度(有機(jī)硒含量)達(dá)9880mg/kg，而發(fā)酵培養(yǎng)基的總的無機(jī)硒濃度為10000mg/kg，菌株的富硒能力達(dá)98. 8%，有機(jī)硒含量可適用于多種不同硒需求的飼料的配置。2、硒蛋氨酸的測定采用高效液相色譜(HPLC)的方法進(jìn)行硒蛋氨酸的檢測，具體方法如下稱取O. Ig富硒酵母產(chǎn)品粉末于三角瓶中，加入5mL的O. 05%的DTT (W/V)、O. 05mol/L的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液(ph=7. 4)以及50mg的蛋白酶K，50°C水浴震蕩8h，反應(yīng)結(jié)束后，冷卻至室溫(25°C)，加入lmg/mL的亞鐵氰化鉀、O. 2mL I. 5g/mL的乙酸鈉，充分混勻后于6000轉(zhuǎn)/分鐘，離心lOmin，收集上清液。取200uL的上述上清液，加入2mL的Na2CO3緩沖液(ph=8. 5),0. 5mL lg/L的丹磺酰氯衍生溶液，于50°C水浴加入4h，加入0. ImL 20mg/mL的鹽酸羥胺溶液終止反應(yīng)，于避光處靜置30min，得到衍生后的酶解液。衍生后的酶解液經(jīng)0. 22um過濾膜過濾后進(jìn)行測定，采用外標(biāo)法計(jì)算硒蛋氨酸的含量。高效液相色譜儀采用C18柱(250mm*4. 6mm,粒徑5um)，柱溫維持30°C ;熒光檢測器增益為1，進(jìn)行量為IOul ;洗脫液為32%的IOmM磷酸緩沖液和68%的こ腈溶液(比例為體積比)。硒蛋氨酸出峰時(shí)間在23min。其中，硒蛋氨酸(>98%)，梯希愛(上海)化 成エ業(yè)發(fā)展有限公司；丹磺酰氯(>98%)，上海科興生化試劑有限公司；鹽酸羥胺(分析純)、こ腈(色譜純)等購自于阿拉丁 (上海)試劑有限公司。測定結(jié)果顯不g砸酵母廣品中砸蛋氣Ife的含量為6970mg/kg,占g砸酵母廣品有機(jī)硒含量的70%。
權(quán)利要求
1.產(chǎn)朊假絲酵母(Candidautilis) S1204，其保藏編號為 CCTCC N0:M2012216。
2.權(quán)利要求I所述產(chǎn)朊假絲酵母S1204在生產(chǎn)富硒酵母產(chǎn)品中的應(yīng)用。
3.一種富硒酵母產(chǎn)品，其活性成分為權(quán)利要求I所述產(chǎn)朊假絲酵母S1204或其發(fā)酵產(chǎn)物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的產(chǎn)品，其特征在于所述發(fā)酵產(chǎn)物按照如下方法制備在含無機(jī)硒的發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵權(quán)利要求I所述產(chǎn)朊假絲酵母S1204，得到發(fā)酵產(chǎn)物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的產(chǎn)品，其特征在于 所述含無機(jī)硒的發(fā)酵培養(yǎng)基中的無機(jī)硒為亞硒酸鈉，所述亞硒酸鈉在所述含無機(jī)硒的發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度具體為50-100mg/l。
6.一種制備權(quán)利要求3-5任一所述富硒酵母產(chǎn)品的方法，包括如下步驟在含無機(jī)硒的發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵權(quán)利要求I所述產(chǎn)朊假絲酵母S1204，收集發(fā)酵產(chǎn)物，即得到富硒酵母產(chǎn)品。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于 所述含無機(jī)硒的發(fā)酵培養(yǎng)基中的無機(jī)硒為亞硒酸鈉，所述亞硒酸鈉在所述含無機(jī)硒的發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度具體為50-100mg/l。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于 所述發(fā)酵包括如下步驟 1)在所述含無機(jī)硒的發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵權(quán)利要求I所述產(chǎn)朊假絲酵母S1204，得到發(fā)酵產(chǎn)物； 2)再向所述發(fā)酵產(chǎn)物中添加亞硒酸鈉繼續(xù)發(fā)酵，所述亞硒酸鈉在所述發(fā)酵產(chǎn)物中的終濃度為200mg/L。
9.根據(jù)權(quán)利要求6-8中任一所述的方法,其特征在于 所述發(fā)酵和所述繼續(xù)發(fā)酵的溫度均為28°C，所述發(fā)酵的時(shí)間為12h，所述繼續(xù)發(fā)酵的時(shí)間為22h-28h ； 所述發(fā)酵和所述繼續(xù)發(fā)酵的溶氧量均為50-70% ;所述發(fā)酵和所述繼續(xù)發(fā)酵的含糖量均為I. 0-2. 0g/100mL，所述發(fā)酵和所述繼續(xù)發(fā)酵的pH值均為5. 5-6. 0 ； 在所述收集發(fā)酵產(chǎn)物后還包括如下步驟過濾所述發(fā)酵產(chǎn)物、收集固體過濾產(chǎn)物、干燥所述固體過濾產(chǎn)物，得到富硒酵母產(chǎn)品。
10.權(quán)利要求3-5任一所述富硒酵母產(chǎn)品在作為漁業(yè)養(yǎng)殖和/或牲畜養(yǎng)殖的飼料添加劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株產(chǎn)朊假絲酵母菌株及其在制備富硒酵母產(chǎn)品中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的產(chǎn)朊假絲酵母(Candida utilis)S1204，其保藏編號為CCTCC NO:M2012216。上述產(chǎn)朊假絲酵母S1204在生產(chǎn)富硒酵母產(chǎn)品中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，選育的出一株新的產(chǎn)朊假絲酵母(Candida utilis)S1204，該菌株在進(jìn)行高生物量發(fā)酵的同時(shí)具有較高的轉(zhuǎn)硒富硒能力，可制備富硒酵母產(chǎn)品。
文檔編號C12N1/16GK102816707SQ20121025819
公開日2012年12月12日 申請日期2012年7月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月24日
發(fā)明者黃欽耿, 倪村標(biāo), 孫艷, 蔡玉鳳, 駱梅香, 朱穗貞, 劉建明, 施巧琴, 吳松剛 申請人:福建倪氏微生物科技有限公司