專(zhuān)利名稱(chēng)：?jiǎn)?dòng)子及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種啟動(dòng)子及其應(yīng)用，特別涉及一種來(lái)源于巴西橡膠樹(shù)的啟動(dòng)子及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
在高等植物中，蔗糖是光合作用的主要產(chǎn)物。在由源到庫(kù)的長(zhǎng)距離運(yùn)輸過(guò)程中，鹿糖是作為植物體內(nèi)碳水化合物運(yùn)輸?shù)闹饕踔潦俏ㄒ坏男问?Williams, L. E.，etal.，Sugar transporters in higher plants—a diversity of roles and complexregulation. Trends Plant Sci，2000，5，283-290 ;Sylvie L，et al. The dual functionof sugar carriers: transport and sugar sensing. Plant Cell，1999，11:707-726)。鹿糖分子進(jìn)出韌皮部篩分子通過(guò)兩種不同的途徑進(jìn)行，即共質(zhì)體途徑和質(zhì)外體途徑(Buchanan B.B.,et al. , Biochemistry and Molecular Biology of Plants. Rockville:AmericanSociety of Plant Physiologists，2000，748-776)。由于在很多種類(lèi)的作物中，質(zhì)外體途徑占有極其重要的地位，蔗糖的跨膜運(yùn)輸及其在植物中的分配需要依賴(lài)于膜上的蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)行介導(dǎo)，蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白作為植物所特有的一類(lèi)載體蛋白，在蔗糖的分配中具有重要的生理作用，主要是在蔗糖進(jìn)出韌皮部，庫(kù)組織的蔗糖供給，蔗糖的貯藏，蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控以及其它小分子物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)等多種生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用(Gahrtz M.，et al.，Aphloem-specific sucrose-H+symporter from Plantago major L supports the modelof apoplastic phloem loading Plant J，1994，6 (5)，697-706;Truernit E.,et al. , Thepromoter of the Arabidopsis thaliana SUC2 sucrose-H+symporter gene directsexpression of β -glucuronidase to the phloem:evidence for phloem loading andunloading by SUC2. Plantaj 1995，196: 564-570 ; Kiihn C.，Companion cell-specificinhibition of the potato sucrose transporter SUTl. Plant Cell Environ, 1996, 19，1115_1123;Biirkle L，et al. , The H+_sucrose cotransporter NtSUTl is essentialfor sugar expurt from tobacco leaves. Plant Physiol，1988，118，59—68;HackelA, et al.，Sucrose transporter LeSUTl and LeSUT2 inhibition affects tomatofruit development in different ways.The Plant Journal，2006，45，180-192;Gabriel-Neumann E，et al.，Constitutive overexpression of the sucrosetransporter SoSUTl in potato plants increases arbuscular mycorrhiza fungalroot colonization under high,but not under low,soil phosphorus availability. JPlant Physiol，2011，168(9):911-9;Siahpoosha M. R.，et al. , Modification of OsSUTlgene expression modulates the salt response of rice Oryza sativa cv.Taipei309. Plant Science 2011)。一些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明鹿糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白還參與了對(duì)非生物脅迫和生物脅迫的口向應(yīng)(Sakr S.，et al.，Cutting，ageing and expression of plant membranetransporters. Biochim. Biophys. Acta, 1997，1330:207-216;Meyer S.，AtSUC3，a geneencoding a new Arabidopsis sucrose transporter, is expressed in cells adjacentto the vascular tissue and in a carpel cell layer. Plant J, 2000，24:869-882),以及鹿糖信號(hào)感應(yīng)與轉(zhuǎn)運(yùn)效率的調(diào)控(Barker L. , et al. , SUT2, a putative sucrose sensorin sieve elements. Plant Cell,2000，12，1153-1164;Schulze ff. , et al. , Function ofthe cytosolic N-terminus of sucrose transporter AtSUT2 in substrate affinity.FEBS Lett,2000,485:189-194;Reinders, A. , Schulze, ff. , et al., Protein - proteininteractions between sucrose transporters of different affinities colocalizedin the same enucleate sieve element. Plant Cell,2002，14，1567 - 1577)。巴西橡膠樹(shù)是一種在世界經(jīng)濟(jì)和軍事發(fā)展中均扮演重要角色的熱帶樹(shù)種，其生產(chǎn)的天然橡膠是一種重要的工業(yè)原料和戰(zhàn)略物資。天然橡膠的生物合成是以蔗糖為原料，以乳管為加工場(chǎng)所進(jìn)行，乳管中蔗糖的供給能力與橡膠產(chǎn)量密切相關(guān)。早期，Bouteau等人通過(guò)同位素標(biāo)記和電生理試驗(yàn)首次證明在乳管的原生質(zhì)體膜上存在參與乳管糖吸收的糖-質(zhì)子共轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)(sugar-H+symport system) (Bouteau F. , Evidence of multiplesugar uptake across the plasma membrane of lacticifer protoplasts from Hevea.Bioelectrochem Bioenerg,1999, 48 (I):135-139)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種植物啟動(dòng)子及其應(yīng)用。該啟動(dòng)子具有組織特異性表達(dá)特性并可被多種因素誘導(dǎo)表達(dá)，可以用于培育轉(zhuǎn)基因植物并控制外源基因的表達(dá)特異性和表達(dá)量。本發(fā)明所提供的啟動(dòng)子，來(lái)源于大戟科橡膠屬的巴西橡膠樹(shù)(Heveabrasiliensis),名稱(chēng)為PrHb5,可以是下述核苷酸序列之一I)序列表中序列I的DNA序列；2)與序列表中序列I限定的DNA序列具有90%以上同源性，且具有啟動(dòng)子功能的DNA序列；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中序列I限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。上述高嚴(yán)謹(jǐn)條件可為在0. IXSSPE (或0. 1XSSC)，0. 1%SDS的溶液中，在65° C下雜交并洗膜。其中，序列表中序列I是由1440個(gè)脫氧核苷酸組成。
結(jié)果顯示自序列表中序列I的V端第20廣251位核苷酸，序列I的V端第626飛76位核苷酸，序列I的5'端第1057 1107位核苷酸處存在可能的基礎(chǔ)啟動(dòng)子區(qū)域(表1)，特別是1057-1107基礎(chǔ)啟動(dòng)子區(qū)域的得分值接近1.0，表明是核心啟動(dòng)子區(qū)的可靠性很高。該序列中還含有激素、脅迫、及其他作用元件如表2所示。含有上述啟動(dòng)子的表達(dá)盒、重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及宿主菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。在所述表達(dá)盒中，所述植物啟動(dòng)子的下游連接結(jié)構(gòu)基因，或調(diào)節(jié)基因，或結(jié)構(gòu)基因或調(diào)節(jié)基因的反義基因，或者能夠干擾內(nèi)源基因表達(dá)的小RNA，用于驅(qū)動(dòng)結(jié)構(gòu)基因，或調(diào)節(jié)基因，或結(jié)構(gòu)基因或調(diào)節(jié)基因的反義基因，或者天然小RNA或人工合成的小RNA的表達(dá)。所述重組表達(dá)載體是上述表達(dá)盒與質(zhì)粒、病毒或運(yùn)載體表達(dá)載體所構(gòu)建的重組載體，所述重組表達(dá)載體為重組植物表達(dá)載體，所述重組植物表達(dá)載體含有上述表達(dá)盒并且能夠?qū)⑺龅谋磉_(dá)盒轉(zhuǎn)送進(jìn)入植物宿主細(xì)胞、組織或器官及其后代并且能夠或者至少方便所述的表達(dá)盒整合到宿主的基因組中，它包括但不限于雙元載體、共合載體。上述重組表達(dá)載體可通過(guò)使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)或基因槍等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織或器官，得到轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或組織或器官及由此分化、再生的完整植株及其無(wú)性系或其后代。本發(fā)明的啟動(dòng)子存在著大量的可能與激素應(yīng)答相關(guān)、脅迫應(yīng)答相關(guān)(生物脅迫與非生物脅迫)、光應(yīng)答相關(guān)、發(fā)育相關(guān)、糖應(yīng)答相關(guān)的順式作用元件，其中激素應(yīng)答及根特異表達(dá)調(diào)控相關(guān)的作用元件最為廣泛。構(gòu)建該啟動(dòng)子的GUS融合表達(dá)載體，通過(guò)轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)其進(jìn)行功能驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)該啟動(dòng)子在根中活性最高，同時(shí)發(fā)現(xiàn)該啟動(dòng)子活性受多種激素及脅迫調(diào)節(jié)。為了驗(yàn)證該啟動(dòng)子的功能，構(gòu)建了 GUS融合表達(dá)載體，并對(duì)其進(jìn)行了本發(fā)明的啟動(dòng)子進(jìn)行擬南芥轉(zhuǎn)基因分析，確定了該啟動(dòng)子的活性，該啟動(dòng)子為根特異表達(dá)及誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。 實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的啟動(dòng)子存在著大量的可能與激素應(yīng)答相關(guān)、脅迫應(yīng)答相關(guān)(生物脅迫與非生物脅迫)、光應(yīng)答相關(guān)、發(fā)育相關(guān)、糖應(yīng)答相關(guān)的順式作用元件，其中激素應(yīng)答及根特異表達(dá)調(diào)控相關(guān)的作用元件最為廣泛。構(gòu)建該啟動(dòng)子的GUS融合表達(dá)載體，通過(guò)煙草瞬時(shí)表達(dá)及轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)其進(jìn)行功能驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)該啟動(dòng)子在根中活性最高，同時(shí)發(fā)現(xiàn)該啟動(dòng)子活性受多種激素調(diào)節(jié)，如生長(zhǎng)素、乙烯利前體I-氨基環(huán)丙烷-I-羧酸(ACC)、細(xì)胞分裂素、水楊酸、脫落酸、赤霉素；并且，該啟動(dòng)子可以被非生物環(huán)境脅迫誘導(dǎo)，如干旱脅迫、高溫脅迫(37°C)、低溫脅迫(4°C)或機(jī)械傷害；且大部分屬于誘導(dǎo)下調(diào)。因此，該啟動(dòng)子在橡膠樹(shù)以外的其他植物及微生物工程中得到廣泛的應(yīng)用。綜上所述，該啟動(dòng)子能指導(dǎo)外源基因在植物發(fā)育過(guò)程中特定時(shí)空表達(dá)，它不僅能使目的基因的表達(dá)產(chǎn)物在一定空間積累，增加或降低區(qū)域表達(dá)量，調(diào)節(jié)表達(dá)產(chǎn)物的表達(dá)空間和表達(dá)量。因此，該啟動(dòng)子在橡膠樹(shù)以外的其他植物及微生物工程中得到廣泛的應(yīng)用。


圖I.橡膠樹(shù)蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因啟動(dòng)子順式作用元件統(tǒng)計(jì)分析。圖2.轉(zhuǎn)基因擬南芥陽(yáng)性植株(轉(zhuǎn)pPPrHb5_GUS擬南芥陽(yáng)性植株)組織染色分析；A:擬南芥陽(yáng)性植株幼苗期及其各組織的染色結(jié)果B:轉(zhuǎn)基因擬南芥陽(yáng)性植株成熟期各組織的染色結(jié)果。圖3.轉(zhuǎn)基因擬南芥陽(yáng)性植株各組織中⑶S熒光定量分析，其中，橫坐標(biāo)中，1-6依次為PrHb5啟動(dòng)子轉(zhuǎn)基因擬南芥(轉(zhuǎn)pPPrHb5-GUS擬南芥陽(yáng)性植株)的根、蓮座葉、莖、莖生葉、種子、花；7_12依次為轉(zhuǎn)對(duì)照質(zhì)粒PCK擬南芥根、蓮座葉、莖、莖生葉、種子、花。圖4.乙烯利前體對(duì)PrHb5啟動(dòng)子轉(zhuǎn)基因擬南芥(轉(zhuǎn)pPPrHb5_GUS擬南芥陽(yáng)性植株)GUS表達(dá)活性熒光定量分析；圖5.生長(zhǎng)素對(duì)PrHb5啟動(dòng)子轉(zhuǎn)基因擬南芥(轉(zhuǎn)PPPrHb5_GUS擬南芥陽(yáng)性植株)⑶S表達(dá)活性熒光定量分析；圖6.細(xì)胞分裂素對(duì)PrHb5啟動(dòng)子轉(zhuǎn)基因擬南芥(轉(zhuǎn)pPPrHb5-GUS擬南芥陽(yáng)性植株)GUS表達(dá)活性熒光定量分析；
圖7.赤霉素對(duì)PrHb5啟動(dòng)子轉(zhuǎn)基因擬南芥⑶S (轉(zhuǎn)PPPrHb5_GUS擬南芥陽(yáng)性植株)表達(dá)活性熒光定量分析；圖8.水楊酸對(duì)PrHb5啟動(dòng)子轉(zhuǎn)基因擬南芥⑶S (轉(zhuǎn)PPPrHb5_GUS擬南芥陽(yáng)性植株)表達(dá)活性熒光定量分析；圖9.脫落酸對(duì)PrHb5啟動(dòng)子轉(zhuǎn)基因擬南芥⑶S (轉(zhuǎn)PPPrHb5_GUS擬南芥陽(yáng)性植株)表達(dá)活性熒光定量分析；圖10.低溫脅迫對(duì)PrHb5啟動(dòng)子轉(zhuǎn)基因擬南芥⑶S (轉(zhuǎn)PPPrHb5_GUS擬南芥陽(yáng)性植株)表達(dá)活性熒光定量分析；圖11.高溫脅迫對(duì)PrHb5啟動(dòng)子轉(zhuǎn)基因擬南芥⑶S (轉(zhuǎn)PPPrHb5_GUS擬南芥陽(yáng)性植株)表達(dá)活性熒光定量分析；圖12.傷害脅迫對(duì)PrHb5啟動(dòng)子轉(zhuǎn)基因擬南芥(轉(zhuǎn)PPPrHb5_GUS擬南芥陽(yáng)性植株) GUS表達(dá)活性熒光定量分析；圖13.干旱脅迫對(duì)PrHb5啟動(dòng)子轉(zhuǎn)基因擬南芥(轉(zhuǎn)PPPrHb5_GUS擬南芥陽(yáng)性植株)GUS表達(dá)活性熒光定量分析。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中的方法，如無(wú)特別說(shuō)明，均為常規(guī)方法。實(shí)施例I、橡膠樹(shù)啟動(dòng)子獲得一 .構(gòu)建橡I父樹(shù)啟動(dòng)子克隆文庫(kù)為了更好的構(gòu)建橡膠樹(shù)啟動(dòng)子克隆文庫(kù)，對(duì)Clontech的Genome Walker Universal Kit中的接頭長(zhǎng)鏈進(jìn)行了修改，短鏈未做修改，接頭的短鏈與長(zhǎng)鏈分別溶解于TE溶液，濃度為10(^11101/1，長(zhǎng)鏈和短鏈1:1混合，變性退火(951 5min，37°C lOmin，室溫放置30min)形成接頭，接頭濃度為50 μ mol/1。以橡膠樹(shù)品系熱研7_33_97的葉片為材料提取基因組DNA，方法采用安澤偉等人改進(jìn)的CTAB法。選取25種限制性?xún)?nèi)切酶對(duì)橡膠樹(shù)熱研7-33-97 (中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所培育，中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所長(zhǎng)期有種苗出售)基因組基因進(jìn)行完全酶切，其中酶切產(chǎn)物為粘性末端的限制性?xún)?nèi)切酶包括BamH I、Bcl I,Bcu I、Bgl 11,BspT I,EcoR I,Hind III,Kpn I,Nco I,Nde I,Sty I和 Xba I ;產(chǎn)物為平末端的包括 BseJ I、Bstll07I、Dra I、Ecol05I、Ecol47I、Eco72I、EcoR V, HincII,KspA I、Pvu II、Sca I、Ssp I 和 Xap I。酶切體系如下，5. Ομ I IOx 酶切 buffer, 5· O μ g基因組DNA，37°C或者對(duì)應(yīng)內(nèi)切酶的最佳酶切溫度，酶切16h ;對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行酚氯仿抽提，乙醇-醋酸鈉沉淀回收酶切后的基因組DNA。利用T4DNA Polymerase對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行末端平端化處理，反應(yīng)結(jié)束后，酚氯仿抽提，乙醇-醋酸鈉沉淀回收平端化酶切產(chǎn)物，分別與接頭連接。連接體系如下1·0μ1 IOx ligase buffer, I. O μ I 50%PEG4000，I. O μ g 酶切產(chǎn)物，Ι.ΟμΙ 50μπιο1/1 接頭，2. 5U T4DNA ligase，加滅菌水至 10. 0 μ 1，16°C 連接 24h ;65°C，IOmin滅活連接酶，稀釋10倍后即可作為啟動(dòng)子克隆的模板。橡膠樹(shù)啟動(dòng)子克隆文庫(kù)包括由25種限制性?xún)?nèi)切酶的基因組DNA酶切產(chǎn)物加上接頭而形成的啟動(dòng)子克隆模板。二.橡膠樹(shù)膠乳蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白啟動(dòng)子序列的獲得根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室獲得的橡膠樹(shù)蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的cDNA序列設(shè)計(jì)巢式PCR引物兩條PrHb5-GSPl 5’ -TTGAAGTCACACGTAGTAGTTGACGCAACC-3’
PrHb5-GSP2 5’ -AACCGGACTCTGCGGACCACCGGTGGTCT-3’利用設(shè)計(jì)的兩條基因特異性引物(GSP1和GSP2)，結(jié)合接頭引物(ADP1和ADP2)，以步驟一獲得的文庫(kù)為模板，進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增，以獲得基因的啟動(dòng)子序列。第一輪PCR擴(kuò)增使用高保真的熱啟動(dòng)DNA聚合酶primeSTAR HS DNA Ploymerase進(jìn)行Touch Down PCR,反應(yīng)體系如下5. O μ I 5 XPrimeSTAR buffer (Mg2+plus), 2. O μ I 2. 5mM dNTP Mixture,I. Ομ I 稀釋 10 倍·的文庫(kù)(取 25 個(gè)模板之一)，0. 5μ I ADPl (10 μ Μ), O. 5μ I GSPl(IOyM),
0.25 μ I PrimeSTAR HS DNA Polymerase (2. 5U/μ I)，加滅菌水至 25. O μ I.反應(yīng)程序如下94°C 3分鐘；98°C 10秒，72°C 5分鐘，7個(gè)循環(huán)；98°C 10秒，68°C 5分鐘，32個(gè)循環(huán)；68°C 7分鐘。第二輪PCR擴(kuò)增采用LA Taq DNA Polymerase進(jìn)行兩步法PCR，并以第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，反應(yīng)體系如下2. 5μ 15 X LA PCR buffer (Mg2+plus), 2. O μ I 2. 5mM dNTP Mixture,
1.0μ I 稀釋 100 倍的第一輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，0· 5μ I ADP2 (10 μ Μ)，O. 5 μ 11 GSP2(10yM),O. 2μ I PrimeSTAR HS DNA Polymerase (5. OU/μ I)，加滅菌水至 25. O μ I.反應(yīng)程序如下94°C 3分鐘；94°C 30秒，68°C 5分鐘30個(gè)循環(huán)；68°C 7分鐘。PCR獲得大小1500bp左右的核苷酸序列片段，并將其克隆到PMD18-T載體進(jìn)行測(cè)序，對(duì)其序列進(jìn)行分析確定該序列為蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的啟動(dòng)子，啟動(dòng)子長(zhǎng)度為1440bp命名為PrHb5。實(shí)施例2、橡膠樹(shù)膠乳蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白啟動(dòng)子序列分析一.橡膠樹(shù)膠乳蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白核心啟動(dòng)子位點(diǎn)預(yù)測(cè)利用 promoter Prediction 軟件(http://www. fruitfly. org/seq_tools/promoter, html)對(duì)鹿糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(PrHb5)啟動(dòng)子的基礎(chǔ)啟動(dòng)子進(jìn)行預(yù)測(cè),結(jié)果顯示自序列表中序列I的5'端第20廣251位核苷酸，序列I的5'端第626飛76位核苷酸，序列I的5'端第1057 1107位核苷酸處存在可能的基礎(chǔ)啟動(dòng)子區(qū)域(表1)，特別是1057-1107基礎(chǔ)啟動(dòng)子區(qū)域的得分值接近1.0，表明是核心啟動(dòng)子區(qū)的可靠性很高。同時(shí)序列中陰影處為預(yù)測(cè)的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。表IBDGP (Berkeley Drosophila Genome Project)數(shù)據(jù)庫(kù)啟動(dòng)子預(yù)測(cè)結(jié)果
Start_End_Score_Promoter Sequence_
201 251 o. 92 aaattaaaattagtgttgaattatmaaggcgtaamtttTatgcttttc
626676 0.87GTAT^GTGTTATGATTACTTTACATAGAGCCtCGTGGATGGTCCCACTAC
1057 1107 0.99TCACTTTMCGGGGAMTGGCCTTMAACCCCCCC.4AAACAMTACAACT二.橡膠樹(shù)啟動(dòng)子順式元件預(yù)測(cè)利用Plantcare 軟件(http://bioinformatics. psb. ugent. be/webtools/plantcare/html/)軟件在線(xiàn)分析啟動(dòng)子的順式作用元件。分析結(jié)果表明，該啟動(dòng)子除存在啟動(dòng)子的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄元件TATA-Box和CAAT-Box外，同時(shí)存在著大量的可能與激素應(yīng)答相關(guān)、脅迫應(yīng)答相關(guān)(生物脅迫與非生物脅迫)、光應(yīng)答相關(guān)、發(fā)育相關(guān)的順式作用元件(表2)。其中與光應(yīng)答作用元件最多，其次為脅迫應(yīng)答、激素應(yīng)答及發(fā)育相關(guān)的順式作用元件(圖I)。甲基茉莉酸應(yīng)答順式作用元件(CGTCA-motif、TGACG-motif )，乙烯應(yīng)答順式作用元件(ERE)，生長(zhǎng)素應(yīng)答順式作用元件(TGA-motif)，赤霉素應(yīng)答順式作用元件(P-box)及水楊酸應(yīng)答順式作用元件(TCA-element)，這些激素分別或相互協(xié)調(diào)地調(diào)控植物的生長(zhǎng)、發(fā)育與分化。在脅迫應(yīng)答相關(guān)的順式作用元件中，主要包括了厭氧脅迫應(yīng)答順式作用元件(ARE)，高低溫脅迫應(yīng)答相關(guān)的順式作用元件(HSE，LTR)及干旱脅迫作用元件(MBS)。在發(fā)育相關(guān)的順式作用元件中主要包括了分生組織(CAT-box)，柵欄葉肉細(xì)胞(HD-Zip1，HD-Zip 2)及胚乳發(fā)育相關(guān)的順式作用元件。光應(yīng)答的相關(guān)順式作用元件廣泛分布于PrHb5 啟動(dòng)子(GA-motif, BoxI, Spl, GTl-motif 等)。表2. PrHb5啟動(dòng)子區(qū)域順勢(shì)作用元件預(yù)測(cè)
權(quán)利要求
1.一種DNA分子,其序列是下述核苷酸序列之一 1)序列表中序列I的DNA序列； 2)與序列表中序列I限定的DNA序列具有90%以上同源性，且具有啟動(dòng)子功能的DNA序列； 3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中序列I限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的DNA分子，其特征在于所述DNA分子為啟動(dòng)子。
3.含有權(quán)利要求I或2所述的DNA分子的表達(dá)盒。
4.含有權(quán)利要求I或2所述的植物胚乳特異性表達(dá)啟動(dòng)子的重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或宿主菌。
5.權(quán)利要求I所述的DNA分子為作為植物啟動(dòng)子中的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求I所述的DNA分子在培育轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述轉(zhuǎn)基因植物中，所述權(quán)利要求I所述的DNA分子的下游連接外源基因，所述外源基因在根中特異性表達(dá)。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述外源基因受植物激素和非生物環(huán)境脅迫誘導(dǎo)表達(dá)。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于所述植物激素為乙烯利前體I-氨基環(huán)丙燒-I-羧酸和/或細(xì)胞分裂素和/或水楊酸和/或脫落酸和/或赤霉素。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于所述非生物環(huán)境脅迫為高溫脅迫、低溫脅迫或機(jī)械傷害。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種啟動(dòng)子及其應(yīng)用。該啟動(dòng)子，1)序列表中序列1的DNA序列；2)與序列表中序列1限定的DNA序列具有90%以上同源性，且具有相同功能的DNA序列；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中序列1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。本發(fā)明的啟動(dòng)子根特異表達(dá)調(diào)控及多種激素誘導(dǎo)啟動(dòng)子，如乙烯利前體1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸、細(xì)胞分裂素、水楊酸、脫落酸、赤霉素GA；并且，該啟動(dòng)子可以被非生物環(huán)境脅迫誘導(dǎo)，如干旱高溫脅迫(37℃)、低溫脅迫(4℃)或機(jī)械傷害。
文檔編號(hào)C12N5/10GK102776197SQ20121026210
公開(kāi)日2012年11月14日 申請(qǐng)日期2012年7月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月26日
發(fā)明者唐朝榮, 戚繼艷, 方永軍, 辛魯生, 陽(yáng)江華, 龍翔宇 申請(qǐng)人:中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所