專利名稱：生長(zhǎng)因子基因藥物在應(yīng)激性胃腸損傷防治中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因藥物在應(yīng)激性胃腸損傷防治中的應(yīng)用，特別涉及低氧誘導(dǎo)因子-1 α (hypoxia-inducible factor-1 α，HIF-I α )和角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子(keratinocyte growth factor, KGF)的聯(lián)合在預(yù)防和/或治療應(yīng)激性胃腸損傷疾病中的應(yīng)用，更特別涉及其在預(yù)防和/或治療急性應(yīng)激致胃腸損傷疾病中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
胃腸黏膜是營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化、吸收的重要場(chǎng)所，然而多種應(yīng)激因素，包括病原微生物
因素、物理因素、化學(xué)因素、機(jī)械性因素等多種因素，作為應(yīng)激源均易引起胃腸道黏膜損傷。同時(shí)胃腸黏膜屏障作為應(yīng)激反應(yīng)的中心器官之一，參與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸，其損傷的機(jī)制包括胃腸黏膜缺血、缺氧及氧自由基的損傷、細(xì)胞因子的損傷、腸道免疫功能受損和細(xì)胞凋亡。其中缺氧是造成胃腸黏膜損傷的關(guān)鍵，尤其是在高海抜地區(qū)，與低海抜地區(qū)相比，氣候有很大不同，低壓、缺氧、寒冷、干燥、輻射強(qiáng)、氣候多變，這些因素尤其是缺氧，對(duì)進(jìn)入高海抜地區(qū)的人群造成不同程度的胃腸道應(yīng)激性急性損傷。此外，由于氣候環(huán)境的影響，高海抜地區(qū)疾病的發(fā)生、發(fā)展具有獨(dú)特的特征，胃腸黏膜屏障參與多種高原疾病的發(fā)生、生發(fā)展和轉(zhuǎn)歸，其急性應(yīng)激損傷后，輕者產(chǎn)生急性炎癥反應(yīng)，影響動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，胃腸道菌群失調(diào)，產(chǎn)生毒素；重者，胃腸道黏膜形成潰瘍，甚至穿孔，從而嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量，甚至威脅人的生命。另外急性應(yīng)激性胃腸道損傷常作為其他許多疾病的繼發(fā)癥狀出現(xiàn)，其對(duì)其他疾病的發(fā)展、轉(zhuǎn)歸有著重要的決定作用?？傊?，急性應(yīng)激性胃腸道損傷對(duì)人類的健康造成了極大的威脅。因此胃腸道急性應(yīng)激性損傷疾病的防治，尤其是高海拔胃腸道急性應(yīng)激性損傷疾病的防治顯得至關(guān)重要。當(dāng)前胃腸黏膜損傷的治療手段主要有抗生素、微生態(tài)制劑、腸外營(yíng)養(yǎng)、中藥，雖然以上各種治療方法具有一定的治療效果，但未從源頭改變損傷部位缺氧環(huán)境；且由于胃腸黏膜屏障的損傷，吸收功能會(huì)大大降低，有效的藥效濃度很難控制和維持；使胃腸黏膜損傷的修復(fù)不盡如意。而對(duì)原本缺氧高海拔的環(huán)境下的胃腸應(yīng)激損傷的防治更是顯得無力。因此，研究新型的、高效的防治胃腸應(yīng)激性損傷的藥物尤其是防治高海抜胃腸應(yīng)激性損傷的藥物成為當(dāng)今生命科學(xué)亟待解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問題，即預(yù)防和/或治療胃腸道應(yīng)激性損傷，本發(fā)明人作了不懈的努力。結(jié)果意外地發(fā)現(xiàn)，低氧誘導(dǎo)因子-la (HIF-Ia)和角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子(KGF)的聯(lián)合對(duì)于急性應(yīng)激性胃腸道損傷性疾病具有甚為良好的治療效果。具體地說，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，含有同時(shí)攜帶并可在真核細(xì)胞中表達(dá)HIF-Ia基因和KGF基因的重組載體的重組減毒沙門氏菌制劑在經(jīng)ロ服之后，可以將HIF-I α基因和KGF基因兩者轉(zhuǎn)染到胃腸組織細(xì)胞，表達(dá)HIF-I α和KGF活性蛋白，從而對(duì)急性應(yīng)激性胃腸道損傷性疾病特別是缺氧應(yīng)激致胃腸道損傷性疾病及其他急性應(yīng)激因素致胃腸道損傷性疾病起到良好的防治效果。此外，通過急進(jìn)高海抜地區(qū)建立缺氧應(yīng)激致胃腸道損傷模型，并通過ロ服含有同時(shí)攜帶并可在真核細(xì)胞中表達(dá)HIF-I α和KGF基因的重組載體的減毒沙門氏菌制劑進(jìn)行治療，取得了良好的治療防治效果。此外，本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)，HIF-Ια和KGF的聯(lián)合對(duì)其他急性應(yīng)激因素致胃腸道損傷如急性應(yīng)激性潰瘍性結(jié)腸炎、急性應(yīng)激胃潰瘍均具有良好的防治效果?；谝陨习l(fā)現(xiàn)，本發(fā)明人完成了以下發(fā)明。概括地說，本發(fā)明第一方面提供了 HIF-I α和KGF聯(lián)合用于制備預(yù)防和/或治療急性應(yīng)激性胃腸道損傷性疾病的藥物中的用途。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述HIF-I α和KGF以攜帶HIF-I α和KGF基因的重組質(zhì)?；蛑亟M減毒沙門氏菌的形式提供。本發(fā)明第二方面提供了ー種重組載體，其同時(shí)攜帶并可在真核細(xì)胞中表達(dá)HIF-I α基因和KGF基因。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述載體為同時(shí)攜帶并可在真核細(xì)胞中表達(dá)表達(dá)HIF-I α基因和KGF基因的pIRES質(zhì)粒。本發(fā)明第三方面提供了ー種重組細(xì)菌，其含有本發(fā)明第二方面所述的重組載體。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述重組細(xì)菌為重組減毒沙門氏菌。本發(fā)明第四方面提供了ー種藥物組合物，其包含治療有效量的HIF-Ia和KGF，或者包含治療有效量的本發(fā)明第二方面所述的重組載體，或者包含治療有效量的本發(fā)明第三方面所述的重組細(xì)菌。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述藥物組合物為含有同時(shí)攜帶并可在真核細(xì)胞中表達(dá)HIF-I α和KGF基因的pIRES質(zhì)?；蛘吆兴鲑|(zhì)粒的重組減毒沙門氏菌Ty21a。通過采用本發(fā)明的重組質(zhì)?；蛘咧亟M減毒菌，可以有效地治療急性應(yīng)激性胃腸道損傷性疾病，特別是缺氧應(yīng)激致胃腸道損傷性疾病，如高原應(yīng)激反應(yīng)、及其他急性的全身或胃腸道局部缺血缺氧性疾病引起的急性胃腸道損傷。


圖I示出KGF基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果。圖2示出pIRES-HIF-Ι α基因質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果。圖中，M為250 bp DNA LadderMarker, I 為 piRES 質(zhì)粒，2 為 pIRES-HIF-l α，3 為 Nhe I 酶 /Mlu I 酶酶切產(chǎn)物。圖3 示出 pIRES-HIF-1 a-KGF 酶切鑒定結(jié)果。圖中，M 為 250 bp DNA LadderMarker, I 為 piRES 質(zhì)粒，2 為 pIRES-HIF-l a -KGF, 3 為 Xba I/Not I 酶酶切產(chǎn)物，4 為 Nhel酶/Mlu I酶酶切產(chǎn)物。圖4示出用重組減毒沙門氏菌TPHK治療的潰瘍性結(jié)腸炎大鼠的結(jié)腸的一般形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果。圖5示出用重組減毒沙門氏菌TPHK防治的潰瘍性結(jié)腸炎大鼠的結(jié)腸的組織病理學(xué)觀察結(jié)果。圖6示出用重組減毒沙門氏菌TPHK防治的高海拔缺氧腸應(yīng)激損傷大鼠的小腸的組織病理學(xué)觀察結(jié)果。圖7示出用重組減毒沙門氏菌TPHK防治的高海拔缺氧腸應(yīng)激損傷大鼠的血漿丙ニ醛(MDA)的含量檢測(cè)結(jié)果。圖中，舞 vs N(^i，P<0.01;1#vsT(^i，P<0.01;fvsPTPH組，P < O. 01, · vsPTPK 組，P < O. 01 ;O vsTTPH 組，P < O. 05。圖8示出用重組減毒沙門氏菌TPHK防治的高海拔缺氧腸應(yīng)激損傷大鼠的血漿超氧化物歧化酶(SOD)的活力檢測(cè)結(jié)果。圖中，來vs NC組，P < O. 01，合vsTC組，P < O. 01 ；ψ vsPTPH 組，P < O. 01, · vsPTPK 組，P < O. 01 ；# vsTTPH 組，P < O. 01, ★ vsTTPK 組，P
<O. 01。圖9示出用重組減毒沙門氏菌TPHK防治的高海拔缺氧腸應(yīng)激損傷大鼠的腸組織中丙ニ醛(MDA)的含量檢測(cè)結(jié)果。圖中パ灰vs NC組，P < O. 01 ；φ vsTC組，P < O. 01 ；Q vsPTPH 組，P < O. 05, ψ' vsPTPH 組，P < O. 01 vsTTPH 組，P < O. 01, ★ vsTTPK 組，P
<O. 01。圖10示出用重組減毒沙門氏菌TPHK防治的高海拔缺氧腸應(yīng)激損傷大鼠的腸組織
中超氧化物歧化酶(SOD)的活力檢測(cè)結(jié)果。圖中，U vsTTPH組，P < O. 05，來vs NC組，P
<O. 01，要 vsTC 組，P < O. 05 ;# vsTC 組，P < O. 01 ;擎 vsPTPH 組，P < O. 01， · vsPTPK組，P < O. 01 vsTTPH 組，P < O. 01, ★ vsTTPK 組，P < O. 01。圖11示出采用ELISA檢測(cè)用重組減毒沙門氏菌TPHK防治的高海拔缺氧腸應(yīng)激損傷大鼠的腸組織中的KGF和HIF-Ia的表達(dá)結(jié)果。圖中，來vs NC組，P < O. 01，螽vsTC組，P < O. 01 灣 vsPTPH 組，P < O. 01, · vsPTPK 組，P < O. 01 ;φ vsTTPH 組，P < O. 05 ；#vsTTPH 組，P < O. 01, ★ vsTTPK 組，P < O. 01。圖12示出用重組減毒沙門氏菌TPHK防治的應(yīng)激性胃黏膜潰瘍大鼠的胃的一般形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果。圖13示出用重組減毒沙門氏菌TPHK防治的應(yīng)激性胃黏膜潰瘍大鼠的胃的病例組織學(xué)觀察結(jié)果。圖 14-17 分別是是 pIRES、pIRES-HIF-l a、piRES-KGF, pIRES-HIF-l a -KGF 的質(zhì)粒圖。序列說明SEQ ID NO :1 :人 HIF-1 α 正向擴(kuò)增引物SEQ ID NO :2:人 HIF-I α 反向擴(kuò)增引物SEQ ID NO 3 :人 HIF-1 a cDNA 序列SEQ ID NO :4 :人KGF正向擴(kuò)增引物SEQ ID NO :5 :人KGF反向擴(kuò)增引物SEQ ID NO :6 :人 KGF cDNA 序列SEQ ID NO :7 :重組質(zhì)粒 pIRES-HIF-l α 序列SEQ ID NO 8 :重組質(zhì)粒 pIRES-HIF-l a -KGF 序列SEQ ID NO 9 =CMV 正向擴(kuò)增引物SEQ ID NO 10 CMV 反向擴(kuò)增引物SEQ ID NO 11 :人 β-actin 正向擴(kuò)增引物SEQ ID NO :12 :人 β -acti 反向擴(kuò)增引物SEQ ID NO 13 :重組質(zhì)粒 pIRES-KGF 序列
具體實(shí)施方式
如上所述，本發(fā)明人在尋求對(duì)急性應(yīng)激性胃腸道損傷的治療和/或預(yù)防方法的過程中，意外地發(fā)現(xiàn)，低氧誘導(dǎo)因子-Ia即HIF-Ια和角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子即KGF的聯(lián)合對(duì)于急性應(yīng)激性胃腸道損傷性疾病具有甚為良好的治療效果。因此在本發(fā)明第一方面，提供了 HIF-Ια和KGF聯(lián)合用于制備預(yù)防和/或治療急性應(yīng)激性胃腸道損傷性疾病的藥物中的用途?！暗脱跽T導(dǎo)因子-1 α ” 或“ HIF-1 α，，是 Semenza (Semenza GL, Wang GLMol CellBiol，1992，12u2) :5447-5454. A nuclear factor induced by hypoxia via de novoprotein synthesis binds to the human erythropoietin gene enhancer at a siterequired for transcriptional activation.)于1992年在低氧誘導(dǎo)的肝細(xì)胞癌細(xì)胞株Hep3B細(xì)胞的核提取物中發(fā)現(xiàn)的ー種蛋白質(zhì)，它能與人紅細(xì)胞生成素(erythropoietin，ΕΡ0)基因的V端增強(qiáng)子的寡核苷酸序列特異性結(jié)合，促進(jìn)EPO轉(zhuǎn)錄。HIF-I屬于低氧誘導(dǎo)因子蛋白家族(HIF)。HIF-I α是受氧濃度調(diào)節(jié)的重要因子，在氧濃度低于6 %時(shí)(相
當(dāng)于氧分壓在46 mmHg)，HIF- α成倍增加，迅速達(dá)到最大值，并與HIF-I β形成結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的HIF-I分子。HIF-Ia隨著缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)而被大量激活。HIF-I是機(jī)體細(xì)胞在低氧環(huán)境中產(chǎn)生的一種結(jié)合DNA蛋白質(zhì)因子，在低氧信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起到ー個(gè)重要的中介作用。在缺氧條件下，HIF促進(jìn)對(duì)一系列的低氧反應(yīng)基因(hypoxia repensive gene, HRG)(袁源、鐘竑.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展.2010，10(5)961-963.缺氧誘導(dǎo)因子-1結(jié)構(gòu)及功能的研究進(jìn)展)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，從而產(chǎn)生一系列的生理適應(yīng)紅細(xì)胞生成增多，攜氧能力增強(qiáng)；血管再生和重建；糖酵解能力增強(qiáng)，使無氧條件下ATP生成增多，以滿足組織細(xì)胞的能量代謝，同時(shí)激活細(xì)胞的自嗷(autophagy) (Junichi Sadoshima. Landes Bioscience, 20084 (4), 402-403.ihe role of autophagy during ischemia/reperfusion ；Marco T,Luana S,Tahira A，etal.Landes Bioscience,2008,4(8) : 1042-1053. Induction of autophagic cell death bya novel molecule is increased by hypoxia ；Chen YQ, Elizabeth S. H, Jeannick C，etal.Landes Bioscience,20084(2) :195-204. Hypoxia induces autophagic cell death inapoptosis-competent cells through a mechanism involving BNIP3 ；Zhang HF，MartaBosch-M，Larissa A. S，et al. The journal of biological chemistry，2008，283(16)10892-10903. Mitochondrial Autophagy Is an HIF-l-dependent Adaptive MetabolicResponse to Hypoxia.),增強(qiáng)細(xì)胞在缺氧條件下的能力，為損傷腸粘膜的修復(fù)爭(zhēng)取更多的時(shí)間。“角質(zhì)生長(zhǎng)因子”或“KGF” 是由 Rubin (Rubin JS, Osada H, Finch Pff, Proc. Natl.Sci. U. S. A. 1989 86 :802-806. Acad.)等首先從人胚胎肺成纖維細(xì)胞M426的培養(yǎng)液中分離純化出來的細(xì)胞因子，具有促進(jìn)小鼠角質(zhì)細(xì)胞有絲分裂的作用。該因子從屬于成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)家族，又稱為FGF-7。KGF是各種上皮組織來源細(xì)胞特異性的旁分泌介質(zhì)，其主要活性是通過間質(zhì)上皮相互交流的作用方式促進(jìn)上皮細(xì)胞的増殖、移行、分化。KGF在整個(gè)胃腸系統(tǒng)中均有表達(dá)，具有刺激胃腸系統(tǒng)的上皮細(xì)胞的増殖和分化的功能，對(duì)保持胃腸系統(tǒng)粘膜的完整性和促進(jìn)損傷修復(fù)有很重要的作用。早期體外研究顯示，KGF刺激角質(zhì)細(xì)胞DNA合成的能力比轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-α和表皮生長(zhǎng)因子EGF強(qiáng)2_10倍。而在上皮發(fā)生損傷時(shí)其表達(dá)量會(huì)迅速増加。將這兩種因子聯(lián)合起來，本發(fā)明人驚喜地發(fā)現(xiàn)，它們可以有效地治療急性應(yīng)激性胃腸道損傷性疾病，并且與分別單獨(dú)使用所述兩種因子相比具有協(xié)同效應(yīng)。正如下文實(shí)施例部分所詳細(xì)記載，在將HIF- α和KGF同時(shí)給予有潰瘍性結(jié)腸炎大鼠(參見實(shí)施例4、圖4和圖5)、高海拔缺氧應(yīng)激腸損傷大鼠(參見實(shí)施例5、圖6、圖7、圖8、圖9和圖10)和應(yīng)激性胃黏膜潰瘍大鼠(參見實(shí)施例6、圖12和圖13)后，其組織學(xué)宏觀和微觀結(jié)構(gòu)和生化指標(biāo)均得到顯著改善。本發(fā)明中使用的術(shù)語“低氧誘導(dǎo)因子-Ia ”或“ HIF-Ia ”可以是人的HIF-Ia，也可以是鼠或其它哺乳動(dòng)物的HIF-I α。優(yōu)選地，本發(fā)明的HIF-I α是人HIF-I α，包括人HIF-I α的ー個(gè)亞群。本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚，“人HIF-I α ”具有本領(lǐng)域公知的含義。本發(fā)明中使用的術(shù)語“角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子”或“KGF”可以是人的角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hKGF)，也可以是鼠或其它哺乳動(dòng)物的KGF。優(yōu)選地，本發(fā)明的KGF是hKGF，包括人KGF的所有分類，例如亞類，亞組，亞群，亞族等。本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚，“hKGF”具有本領(lǐng)域公知
的含義。本發(fā)明中使用的術(shù)語“預(yù)防”和“治療”具有它們一般意義上的含義。在一些實(shí)施方案中，HIF-I α和KGF以同時(shí)攜帶并可在真核細(xì)胞中表達(dá)HIF-I α和KGF基因的重組載體的形式提供。所述載體可以是同時(shí)攜帶并可在真核細(xì)胞中表達(dá)HIF-I α和KGF基因的質(zhì)粒、噬菌體、病毒或粘粒等，優(yōu)選質(zhì)粒。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述質(zhì)?？梢允前逼S青霉素抗性的真核表達(dá)質(zhì)粒，例如本發(fā)明人自行改構(gòu)的pIRES-HIF-l a -KGF(PHK)，或者其他攜帶并可表達(dá)HIF-I α和KGF基因的真核表達(dá)質(zhì)粒如PCDNA3-HIF-1 a -KGF質(zhì)粒。在ー個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述質(zhì)粒為PHK，其序列如SEQ ID N0:8所示。在另ー些實(shí)施方案中，HIF-I α和KGF以含有上述重組載體的重組細(xì)菌的形式提供。所述重組細(xì)菌是對(duì)人體無毒或者減毒的可直接將真核表達(dá)質(zhì)粒帶入動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌，包括但不限于減毒沙門氏菌、減毒雙歧桿菌、減毒大腸桿菌，優(yōu)選沙門氏菌。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，以沙門氏菌作為治療基因HIF-I α和KGF的載體，可以成功地實(shí)現(xiàn)這兩種蛋白在目標(biāo)位點(diǎn)的表達(dá)?；蛑委?gene therapy)是ー種新的治療手段，其被認(rèn)為是21世紀(jì)醫(yī)療革命的關(guān)鍵。該治療方法是通過以下方式實(shí)現(xiàn)治療將治療性蛋白的功能基因?qū)牖颊唧w內(nèi)，使之在其中表達(dá)，從而發(fā)揮治療作用。在這一方法中，合適載體的選擇是基因治療成敗的關(guān)鍵。本發(fā)明人針對(duì)腸道寄生有大量菌群的獨(dú)特微環(huán)境，選用沙門氏菌作為基因治療的載體，成功地將功能基因?qū)塍w內(nèi)并實(shí)現(xiàn)其表達(dá)。沙門氏菌為一群寄生于人和動(dòng)物腸道內(nèi)的無芽孢、革蘭氏陰性直桿菌，可引起人和動(dòng)物腸熱癥、胃腸炎、敗血癥等。減毒后的沙門氏菌仍保持對(duì)腸粘膜組織的強(qiáng)親嗜性。減毒沙門氏菌通過侵襲派伊爾結(jié)(Payer' s pathches,PPs)下的濾泡相關(guān)上皮中的M細(xì)胞，M細(xì)胞對(duì)其進(jìn)行吞飲，進(jìn)而穿過小腸上皮屏障進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。此外，減毒沙門氏菌還可以被樹突狀細(xì)胞(Dendritic cell, DC)直接攝取進(jìn)入機(jī)體(Fournier B, Williams IR, GewirtzAT, et al Infect Immun,2009 ；77 (9) :4121-4129. Toll-like receptor 5-dependentregulation of inflammation in systemic Salmonella enterica Serovar typhimuriuminfection.) 0且減毒沙門氏菌已被實(shí)驗(yàn)性地用做外源抗原基因載體，并已初步證明能直接將真核表達(dá)質(zhì)粒攜帶進(jìn)入動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)，表達(dá)相應(yīng)的蛋白(Chen D, Guo ff, Xu Z, at clSheng Wu Gong Cheng Xue Bao,2009,25(3) :341-347. Construction of a dual-promoterexpression plasmid delivered by Salmonella choleraesuis C500)。因此，特別優(yōu)選地沙門氏菌，所述重組細(xì)菌為包含上述重組載體的減毒沙門氏菌。在ー個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述重組細(xì)菌為本發(fā)明人構(gòu)建的包含同時(shí)攜帶并可在真核細(xì)胞中表達(dá)HIF-I α和KGF基因真核表達(dá)質(zhì)粒(序列如SEQ ID NO 8所示)的減毒沙門氏菌Ty21a 的菌株 Ty21a-pIRES-HI F_l a -KGF (TPHK)。本發(fā)明的TPHK具備對(duì)胃腸道黏膜的親嗜功能，因此在給予到胃腸道之后，其更容易停留于此，并在此表達(dá)治療性HIF-I α和KGF蛋白。因此，與直接給予蛋白或質(zhì)粒相比，給予本發(fā)明的TPHK可以延長(zhǎng)給藥間隔，減少給藥次數(shù)，更有針對(duì)性。另外，由于蛋白或質(zhì)粒的制備、純化和保存相對(duì)繁瑣、昂貴，因此采用本發(fā)明的TPHK可以更為經(jīng)濟(jì)地實(shí)現(xiàn)對(duì)胃腸道損傷的防治。再有，TPHK只在局部分泌KGF和HIF-I α，無進(jìn)入血流而引起誘發(fā)腫瘤的危險(xiǎn)的顧慮。在本發(fā)明中，本發(fā)明采用急進(jìn)高原建立高海拔缺氧腸應(yīng)激損傷模型以及急性應(yīng)激性結(jié)腸炎模型和急性應(yīng)激性胃潰瘍模型，通過灌胃給予TPHK進(jìn)行治療，驗(yàn)證了治療效果。在本發(fā)明中，所述急性應(yīng)激性胃腸道損傷性疾病特別是缺氧應(yīng)激致胃腸道損傷性疾病可以為高原應(yīng)激反應(yīng)及其他急性的全身或胃腸道局部缺血缺氧性疾病繼發(fā)引起的的急性胃腸道損傷；所述的高海拔缺氧應(yīng)激致胃腸道損傷性疾病還可以是直接的急進(jìn)高海抜缺氧應(yīng)激致胃腸道黏膜損傷。所述其他急性應(yīng)激性胃腸道損傷性疾病特別是急性應(yīng)激性潰瘍性結(jié)腸炎、急性應(yīng)激胃潰瘍，可以為物理的如射線、化學(xué)的如各種有機(jī)農(nóng)藥及微生物毒素、微生物的如各種胃腸道致病菌等因素以及極端環(huán)境因素如缺氧、高寒或其他的突發(fā)事件如地震作為應(yīng)激源引起的急性胃腸道損傷性疾病。在本發(fā)明第二方面，提供了ー種重組載體，其同時(shí)攜帶并可在真核細(xì)胞中表達(dá)HIF-I α 和 KGF 基因。所述載體可以是同時(shí)攜帶并可在真核細(xì)胞中表達(dá)HIF- α和KGF基因的質(zhì)粒、噬菌體、病毒或者粘粒，但優(yōu)選質(zhì)粒。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述質(zhì)粒可以是氨芐青霉素抗性的真核表達(dá)質(zhì)粒，例如本發(fā)明人自行改構(gòu)的pIRES-HIF-l a -KGF(PHK)，或者其他攜帶并可在真核細(xì)胞中表達(dá)HIF-Ia和KGF基因的真核表達(dá)質(zhì)粒如pAH質(zhì)粒。在ー個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述質(zhì)粒為PHK，其序列如SEQ ID N0:8所示。所述HIF-I α可以是人的HIF_1 a，也可以是鼠或其它哺乳動(dòng)物的HIF-I α。優(yōu)選地，本發(fā)明的HIF-I α是人HIF-1 a，包括人HIF-I α的ー個(gè)亞群。所述KGF可以是人的角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hKGF)，也可以是鼠或其它哺乳動(dòng)物的KGF0優(yōu)選地，本發(fā)明的KGF是hKGF，包括人KGF的所有分類，例如亞類，亞組，亞群，亞族等。在本發(fā)明第三方面，提供了ー種重組細(xì)菌，其含有本發(fā)明第二方面所述的重組載體。所述重組細(xì)菌可以是含有本發(fā)明第二方面所述的重組載體的減毒沙門氏菌或者對(duì)人體無毒或者減毒的可直接將真核表達(dá)質(zhì)粒帶入動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的其他細(xì)菌，所述其他細(xì)菌包括但不限于減毒的雙歧桿菌、減毒的大腸桿菌。所述重組細(xì)菌為含有本發(fā)明第二方面所述的重組載體的減毒沙門氏菌。在ー個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述重組細(xì)菌為本發(fā)明人構(gòu)建的含有同時(shí)攜帶并可在真核細(xì)胞中表達(dá)HIF-I α和KGF基因的真核表達(dá)質(zhì)粒(序列如SEQID Ν0:8 所示)的減毒沙門氏菌(Ty21a)的菌株 Ty21a-pIRES-HIF_l a-KGF (TPHK)。所述HIF-I α可以是人的HIF-1 α，也可以是鼠或其它哺乳動(dòng)物的HIF-I α。優(yōu)選地，本發(fā)明的HIF- α是人HIF-1 a，包括人HIF-I α的ー個(gè)亞群。所述KGF可以是人的角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hKGF)，也可以是鼠或其它哺乳動(dòng)物的KGF0優(yōu)選地，本發(fā)明的KGF是hKGF，包括人KGF的所有分類，例如亞類，亞組，亞群，亞族等。本發(fā)明的TPHK具備對(duì)胃腸道黏膜的親嗜功能，因此在給予到胃腸道之后，其更容易停留于此，并在此表達(dá)治療性HIF-I α和KGF蛋白。因此，與直接給予蛋白或質(zhì)粒相比，給予本發(fā)明的TPHK可以延長(zhǎng)給藥間隔，減少給藥次數(shù)，更有針對(duì)性。另外，由于蛋白或質(zhì)粒的制備、純化和保存相對(duì)繁瑣、昂貴，因此采用本發(fā)明的TPHK可以更為經(jīng)濟(jì)地實(shí)現(xiàn)對(duì)胃腸道損傷的防治。再有，TPHK只在局部分泌KGF和HIF-1 a，無進(jìn)入血流而引起誘發(fā)腫瘤的
危險(xiǎn)的顧慮。本發(fā)明人認(rèn)為，KGF具有促進(jìn)腸黏膜損傷修復(fù)功能，HIF-I α在缺氧條件下誘導(dǎo)分泌一系列的低氧反應(yīng)元件，調(diào)節(jié)機(jī)體低氧適應(yīng)性，增強(qiáng)細(xì)胞的耐受能力，為修復(fù)創(chuàng)造時(shí)間，兩者聯(lián)合應(yīng)用具有治療效果。在本發(fā)明中，本發(fā)明采用急進(jìn)高原建立高海拔缺氧腸應(yīng)激損傷模型以及急性應(yīng)激性結(jié)腸炎模型和急性應(yīng)激性胃潰瘍模型，通過灌胃給予TPHK進(jìn)行治療，驗(yàn)證了治療效果。在本發(fā)明第四方面，提供了ー種藥物組合物，其包含治療有效量的HIF-I α和KGF，或者包含治療有效量的本發(fā)明第二方面所述的重組載體，或者包含治療有效量的本發(fā)明第三方面所述的重組細(xì)菌。所述載體可以是同時(shí)攜帶并可在真核細(xì)胞中表達(dá)HIF-I α和KGF基因的質(zhì)粒、噬菌體、病毒或粘粒等，但優(yōu)選質(zhì)粒。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述質(zhì)?？梢允前逼S青霉素抗性的真核表達(dá)質(zhì)粒，例如本發(fā)明人自行改構(gòu)的pIRES-HIF-l a -KGF(PHK)，或者其他攜帶并可在真核細(xì)胞中表達(dá)HIF-Ia和KGF基因的真核表達(dá)質(zhì)粒如pAH質(zhì)粒。在ー個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述質(zhì)粒為PHK，其序列如SEQ ID N0:8所示。所述重組細(xì)菌可以是包含本發(fā)明第二方面所述的重組載體的減毒沙門氏菌或者對(duì)人體無毒或者減毒的可直接將真核表達(dá)質(zhì)粒帶入動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的其他細(xì)菌，所述其他細(xì)菌包括但不限于減毒的雙歧桿菌、減毒的大腸桿菌。所述重組細(xì)菌為包含本發(fā)明第二方面所述的重組載體的減毒沙門氏菌。在ー個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述重組細(xì)菌為本發(fā)明人構(gòu)建的含有同時(shí)攜帶并可在真核細(xì)胞中表達(dá)HIF-I α和KGF基因真核表達(dá)質(zhì)粒(序列如SEQ IDNO 8 所示)的減毒沙門氏菌 Ty21a 的菌株 Ty21a-pIRES-HIF_l a -KGF (TPHK)。所述HIF-I α可以是人的HIF-1 α，也可以是鼠或其它哺乳動(dòng)物的HIF-I α。優(yōu)選地，本發(fā)明的HIF- α是人HIF-1 a，包括人HIF-I α的ー個(gè)亞群。所述KGF可以人的角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hKGF)，也可以是鼠或其它哺乳動(dòng)物的KGF。優(yōu)選地，本發(fā)明的KGF是hKGF，包括人KGF的所有分類，例如亞類，亞組，亞群，亞族等。文所使用的“治療有效量”指的是足以預(yù)防或改善胃腸道損傷的量。治療有效量或劑量將取決于患者的年齡、性別及體重，以及患者的當(dāng)前醫(yī)療狀況。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠依據(jù)本公開以及這些和其他因素來確定合適的劑量。例如，對(duì)于包含所述重組細(xì)菌的藥物組合物，所述重組細(xì)菌的治療有效量為5X 106-5X IO9 cfu/kg，優(yōu)選為1-9X108 cfu/kg。
任選地，所述藥物組合物還可以包含可藥用輔助劑，例如賦形劑、穩(wěn)定劑、防腐剤、載體等。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述藥物組合物為ロ服膠囊制劑。根據(jù)本發(fā)明，所述藥物組合物可以有效地預(yù)防和/或治療急性應(yīng)激性胃腸道損傷性疾病特別是缺氧應(yīng)激致胃腸道損傷性疾病，例如高原應(yīng)激反應(yīng)以及其他急性的全身或胃腸道局部缺血性疾病引起的胃腸道損傷疾??；高海拔缺氧應(yīng)激致胃腸道損傷性疾病還可以是直接的急進(jìn)高海拔缺氧應(yīng)激致胃腸道黏膜損傷。所述其他急性胃腸道損傷性疾病包括急性應(yīng)激性潰瘍性結(jié)腸炎、急性應(yīng)激胃潰瘍，可以為物理的如射線、化學(xué)的如各種有機(jī)農(nóng)藥及微生物毒素、微生物的如各種胃腸道致病菌等因素以及高原應(yīng)激如高海拔各種特殊的自然環(huán)境因素或其他的突發(fā)事件作為應(yīng)激源引起的急性胃腸道損傷性疾病。通過本發(fā)明，可以更科學(xué)、更有效地治療急性應(yīng)激性胃腸道損傷性疾病。在目前針對(duì)急性應(yīng)激性胃腸道損傷性疾病特別是缺氧應(yīng)激致胃腸道損傷性疾病臨床治療不盡如意的情況下，本發(fā)明提供了一種新的治療途徑，并且比以往的治療手段更為科學(xué)、療效更明確。
實(shí)施例下面通過具體實(shí)施例進(jìn)ー步說明本發(fā)明。但是，應(yīng)當(dāng)理解為，這些實(shí)施例僅僅是用于更詳細(xì)具體地說明之用，而不應(yīng)理解為用于以任何形式限制本發(fā)明。這些實(shí)施例描述了攜帶并可表達(dá)HIF-I α和KGF基因的重組質(zhì)粒或重組減毒沙門氏菌的制備以及急性應(yīng)激性胃腸道損傷性疾病的治療作用，以進(jìn)ー步闡述本發(fā)明。本發(fā)明對(duì)試驗(yàn)中所使用到的材料以及試驗(yàn)方法進(jìn)行一般性和/或具體的描述。雖然為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的所使用的許多材料和操作方法是本領(lǐng)域公知的，但是本發(fā)明仍然在此作盡可能詳細(xì)描述。本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚，在下文中，如果未特別說明，本發(fā)明所用材料和操作方法是本領(lǐng)域公知的。實(shí)施例I.重組減毒沙門氏菌SPH的構(gòu)津與制備I. HIFl a cDNA 的克隆按文獻(xiàn)報(bào)道(MiyazawaK, et al BBRC，1989，163 :967-973 ；Nakamura T, etal. Progress in Growth Factor Research 1991,3:67-85)的人低氧誘導(dǎo)因子 hypoxiainducible factor-1 α , HIFl α ) cDNA序列設(shè)計(jì)引物，并在正向引物中引入Nhe I酶切位點(diǎn)，反向引物中引入Mlu I酶切位點(diǎn)。正向引物的寡核苷酸序列為5' -cat gctagc caccga ttc accatg gag ggc~3/ (SEQ ID NO :1),反向引物的寡核苷酸序列為 5' -gtc acgcgttea gtt aac ttg ate caa age tctg-3' (SEQ ID NO :2)。在本文中，如果未特別說明，所提及引物均為Takara公司所合成。用25ml的細(xì)胞培養(yǎng)瓶1640培養(yǎng)基(Gibco)于三氣培養(yǎng)箱37°C 5% CO2條件下，誘導(dǎo)培養(yǎng)Hela細(xì)胞，細(xì)胞生長(zhǎng)貼壁率達(dá)到80%時(shí)，棄去培養(yǎng)液。每瓶細(xì)胞用PBS(PH=7.4)沖洗I次，各加Iml Trizol裂解5min左右，加200 μ I氯仿，充分顛倒混勻，靜置5min,4 °C 12000rpm 離心 IOmin,轉(zhuǎn)移上清至 DEPC (diethypyrocarbonate,焦碳酸ニ こ酷)水處理過的I. 5ml EP管，加5倍體積的冰無水こ醇_20°C沉淀過夜。次日，4°C 12000rpm離心lOmin，棄去こ醇超凈臺(tái)吹干，加入20 μ I DEPC水完全融解RNA。取I μ I RNA加入DEPC水99 μ I (100倍稀釋)，紫外分光光度計(jì)下測(cè)OD26。及OD28tl。計(jì)算OD26tl / OD28。的比值，留取比值在I. 8-2. O的樣本進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。根據(jù)公式RNA 濃度(μ g / ml) =OD260X40X 100,計(jì)算 RNA 的濃度 O. I μ g / μ I,
并進(jìn)行電泳檢測(cè)。取10 μ I總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成CDNA (方法參見PrimcScrippRT
reagent Kit (Perfect Real Time)試劑盒(購自Takara公司)操作說明)。反應(yīng)體系RNA(I μ g) 10 μ I, 5XPrimeScript TM buffer 4 μ I, Random 6 mers (100 μ Μ) I μ I, OligodT Primer (50 μ Μ) I μ I,PrimeScript TM RT Enzyme Mix I I μ I,無 RNase 水補(bǔ)足 20 μ I。反應(yīng)參數(shù):37°C，15min，85°C 5s。將合成的cDNA分別以上述特異引物(SEQ ID No 1和SEQ ID NO :2，)和人
β-actin引物(SEQ ID NO :11和SEQ ID No 12)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，鑒定cDNA模板質(zhì)量。HIF-Ia反應(yīng)體系:cDNA模板10μ l，HIF-la上游引物(20 μ Μ)和下游引物(20 μ Μ)各2μ 1，TaKaRa Taq (5U / μ I) O. 5 μ 1，dNTP (各 2. 5mM) 4 μ 1，10 XPCR buffer 5μ1，滅菌蒸餾水補(bǔ)足50μ I反應(yīng)條件退火溫度，94°C預(yù)變性5min ;94°C變性30s，60°C退火30s，72°C延伸3min, 30 個(gè)循環(huán)；最后 72°C 延伸 lOmin。β -actin 反應(yīng)體系cDNA 模板 10μ 1，β -aetin上游引物(20 μ Μ)和下游引物(20 μ Μ)各 2μ1，TaKaRa Taq (5U / μ 1)0. 5 μ 1，dNTP (各2. 5mM) 4 μ I, IOXPCR buffer 5 μ I,滅菌蒸懼水補(bǔ)足50 μ I。反應(yīng)條件94°C預(yù)變性5min ;94°C變性30s，60°C退火30s，72°C延伸lmin，30個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸IOmin0 1%瓊脂糖電泳，擴(kuò)增出HIF-Ia在大約2500bp左右處有ー特異條帶，β -actin在大約200bp處有ー很亮的特異性條帶，如圖I所示。測(cè)定人HIF-Ia cDNA序列(上海生エ生物工程技術(shù)服務(wù)公司)。將測(cè)得的人HIF-IacDNA序列與文獻(xiàn)報(bào)道的人HIF-Ia cDNA序列進(jìn)行比較分析。結(jié)果表明，克隆的人HIF-I αcDNA序列與文獻(xiàn)報(bào)道的人HIF-1 a cDNA序列完全一致，其序列如SEQ ID NO 3所示。2.攜帶人HIF- α基因的質(zhì)粒的構(gòu)津在上述電泳膠中切掉2500_3000bp的條帶，用回收試劑盒(TIANgel MidiPurification Kit,購自 TIANGEN 公司)回收。用 Nhe I (購自 Takara)和 Mlu I 酶(購自Takara)酶對(duì)pIRES載體(獸研所惠贈(zèng)，其質(zhì)粒圖如圖14所示)進(jìn)行酶切，然后將其與上述PCR產(chǎn)物進(jìn)行連接，連接反應(yīng)體系純化的PCR產(chǎn)物2 μ L，載體1.5 μ L，Solution I0. 5yL, T4連接酶I μ L，滅菌蒸餾水補(bǔ)足10yL，16°C連接12h。所得的重組質(zhì)粒命名為pIRES-HIF-l α，其質(zhì)粒圖如圖15所示。測(cè)定人重組質(zhì)粒pIRES-HIF-l α序列(上海生エ生物工程技術(shù)服務(wù)公司)，如SEQID NO 7 所示。3.攜帶HIF- α基因的減毒沙門氏菌菌株的制備3. I電穿孔轉(zhuǎn)化將減毒沙門氏菌Ty21a (購于北京生物制品檢定所，編號(hào)50218)凍存菌液50 μ L接種于5ml不含抗生素的LB培養(yǎng)液，震蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期(菌液A值約0. 4)，4°C條件下，4000r. min-1離心收集菌體，用預(yù)冷的無菌去離子水洗滌細(xì)胞2次，洗滌后的細(xì)菌懸于Iml冰預(yù)冷的無菌去離子水。用電穿孔法(Μμ Itiporator 4308 Eppendorf電轉(zhuǎn)儀)將pIRES-HIFl α質(zhì)粒0. 2 μ g轉(zhuǎn)化200 μ L預(yù)處理的減毒沙門氏菌。電穿孔條件電壓2. 5kV,電容25 μ F，電阻200 Ω，放電時(shí)間O. 5s。加入SOC培養(yǎng)基1ml，37°C輕柔震蕩培養(yǎng)45min,涂布于含氨節(jié)青霉素(lOOmg. L-1)固體LB培養(yǎng)基平皿,37°C培養(yǎng)16h后各挑取2個(gè)菌落進(jìn)行鑒定。3. 2陽性工程菌的篩選從培養(yǎng)板各挑取2個(gè)單菌落，分別接種于3mL含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，37°C震搖培養(yǎng)。轉(zhuǎn)入pIRES-HIFla質(zhì)粒的減毒沙門氏菌菌株的篩選通過氨芐青霉素抗性、PCR (利用菌液為模板，擴(kuò)增真核表達(dá)啟動(dòng)子CMV及目的基因HIFl a )及提取質(zhì)粒后通過Nhe 1/Mlu I雙酶切鑒定；轉(zhuǎn)入pIRES的減毒沙門氏菌菌株的篩選通過卡那霉素抗性及PCR篩選(利用菌液為模板，擴(kuò)增真核表達(dá)啟動(dòng)子CMV)。擴(kuò)增真核表達(dá)啟動(dòng)子CMV的引物為上游 5' -CCC agt aca tga cct tat ggg-31 (SEQ ID NO :9)，下游 5' -gga gac ttg gaaate ccc gt-3' (SEQ ID NO :10)，PCR 參數(shù)為94で 30sec,55°C 30sec,72°C lmin，循環(huán)數(shù)
為 30，72°C延伸 5min。擴(kuò)增 HIFl α 的引物為 SEQ ID NO :1 和 SEQ ID NO :2。PCR 參數(shù)為94°C 60sec,55°C 60sec,72°C 90sec，循環(huán)數(shù)為 30，72で延伸 7min。3. 3工程菌TPH的制備將攜帶HIFl α基因真核表達(dá)載體的減毒沙門氏菌菌種(TPH)接種于含氨芐青霉素(O. lmg/mL)的LB培養(yǎng)基中，35 37oC 8% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h做為一代菌種，將ー代菌種接種至含完全培養(yǎng)基的克氏瓶中擴(kuò)大培養(yǎng)做為ニ代菌種，并在無菌條件下取一代菌種和ニ代菌種樣涂片，革蘭氏染色后顯微鏡下可見呈革蘭氏陰性桿菌，長(zhǎng)鏈多，菌形一致。將ニ代克氏瓶菌種刮于IOOmL滅菌生理鹽水菌種瓶中，比濁結(jié)果為1.7X1010f/mL，30L發(fā)酵罐發(fā)酵12h后3000 r/min離心20min,收集菌體73g,加入70mL脫脂牛奶充分混勻，置于不銹鋼盤中冷凍干燥，制備成無菌干粉約26g。實(shí)施例2.攜帶KGF基因的重組減毒沙門氏菌(Ty21a-DlRES_KGF (TPK))的構(gòu)津與制備I. KGF cDNA 的克降按文獻(xiàn)報(bào)道(RubinJS, et al Proc Natl Acad Sei USA1989. 86 :302-306 ；FinchPff,et al Science 1989,245(49 19) :752-755)的人 KGF cDNA 序列設(shè)計(jì)引物，在正向引物中引入Xbal酶切位點(diǎn)，反向引物中引入NotI酶切位點(diǎn)。正向引物的寡核苷酸序列為5’-TATTCTCAGAATGAGCTATGATTACATGGAAG-3’ (SEQ ID NO :4)，反向引物的寡核苷酸序列為 5’_GACGCGGCCGCTTAAGTGATTGCCATAGGCAG-3’ (SEQ ID NO :5)。從人胎盤 cDNA文庫(購自 Clontech)克隆人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子(KGF)基因。反應(yīng)體系模板cDNAly 1，KGF上游引物(20 μ M)和下游引物(20 μ Μ) # I μ I, dNTP 3 μ 1，10XPCR buffer 5 μ I,TaKaRa Taq(5U/ μ 1)0. 5 μ 1，滅菌蒸餾水補(bǔ)足50 μ I。PCR參數(shù)為94°C預(yù)變性5min ;94°C變性30s，56°C退火30s，72°C延伸lmin，30個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸lOmin。然后，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳。電泳結(jié)果參見圖2。測(cè)定人KGF cDNA序列(上海生エ生物工程技術(shù)服務(wù)公司)。將測(cè)得的人KGF cDNA序列與文獻(xiàn)報(bào)道的人KGF cDNA序列進(jìn)行比較分析。結(jié)果表明，克隆的人KGF cDNA序列與文獻(xiàn)報(bào)道的人KGF cDNA序列完全一致，其序列如SEQ ID N0:6所示。2.攜帶人KGF基因的質(zhì)粒的構(gòu)津在上述電泳膠中切掉400bp左右的條帶，用回收試劑盒(TIANgel MidiPurif ication Kit,購自 TIANGEN 公司)回收。用 Xba I (購自 Takara)和 Not I 酶(購自Takara)酶對(duì)pIRES載體進(jìn)行酶切，然后將其與上述PCR產(chǎn)物進(jìn)行連接，連接反應(yīng)體系純化的PCR產(chǎn)物2 μ L，載體I. 5 μ L，溶液I O. 5 μ L，Τ4連接酶I μ L，滅菌蒸餾水補(bǔ)足10 μ L，16°C連接12h。所得的重組質(zhì)粒命名為pIRES-KGF，其質(zhì)粒圖如圖16所示。測(cè)定人重組質(zhì)粒pIRES-KGF序列(上海生エ生物工程技術(shù)服務(wù)公司)，如SEQ IDNO 13所示。3.攜帶KGF基因的減毒沙門氏菌菌株的制備3. I電穿孔轉(zhuǎn)化將減毒沙門氏菌Ty21a(購于北京生物制品檢定所，編號(hào)50218)凍存菌液50 μ L接種于5ml不含抗生素的LB培養(yǎng)液，震蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期(菌液A值約O. 4)，4°C條
件下，4000r. min-1離心收集菌體，用預(yù)冷的無菌去離子水洗滌細(xì)胞2次，洗滌后的細(xì)菌懸于Iml冰預(yù)冷的無菌去離子水。用電穿孔法(Μμ Itiporator 4308 Eppendorf電轉(zhuǎn)儀)將pIRES-KGF質(zhì)粒O. 2 μ g轉(zhuǎn)化200 μ L預(yù)處理的減毒沙門氏菌。電穿孔條件電壓2. 5kV，電容25 μ F，電阻200 Ω，放電時(shí)間O. 5s。加入SOC培養(yǎng)基1ml，37°C輕柔震蕩培養(yǎng)45min，涂布于含氨芐青霉素(lOOmg. L-1)固體LB培養(yǎng)基平皿，37°C培養(yǎng)16h后各挑取2個(gè)菌落進(jìn)行鑒定。3. 2陽性工程菌的篩選從培養(yǎng)板各挑取2個(gè)單菌落，分別接種于3mL含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，37°C震搖培養(yǎng)。轉(zhuǎn)入pIRES-KGF質(zhì)粒的減毒沙門氏菌菌株的篩選通過氨芐青霉素抗性、PCR(利用菌液為模板，擴(kuò)增真核表達(dá)啟動(dòng)子CMV及目的基因KGF)及提取質(zhì)粒后通過XbaL和Not I雙酶切鑒定；轉(zhuǎn)入pIRES的減毒沙門氏菌菌株的篩選通過卡那霉素抗性及PCR篩選(利用菌液為模板，擴(kuò)增真核表達(dá)啟動(dòng)子CMV)。擴(kuò)增真核表達(dá)啟動(dòng)子CMV的引物為SEQ ID NO 9和SEQID NO 10, PCR 參數(shù)為94°C 30sec，55°C 30sec，72°C lmin，循環(huán)數(shù)為 30，72°C延伸 5min。擴(kuò)增 KGF 的引物為 SEQ ID NO :4 和 SEQ ID NO :5。PCR 參數(shù)為94°C 60sec，55°C 60sec,72°C 90sec，循環(huán)數(shù)為 30，72°C延伸 7min。3.3工程菌TPK的制備將攜帶KGF基因真核表達(dá)載體的減毒沙門氏菌菌種(TPK)接種于含氨芐青霉素(0. lmg/mL)的LB培養(yǎng)基中，于35_37°C、8% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h做為一代菌種，將一代菌種接種至含完全培養(yǎng)基的克氏瓶中擴(kuò)大培養(yǎng)做為ニ代菌種，并在無菌條件下取一代菌種和ニ代菌種樣涂片，革蘭氏染色后顯微鏡下可見呈革蘭氏陰性桿菌，長(zhǎng)鏈多，菌形一致。將ニ代克氏瓶菌種刮于IOOmL滅菌生理鹽水菌種瓶中，比濁結(jié)果為I. TXlOVmLf/mLdOL,酵罐發(fā)酵12h后40000r/min離心20min，收集菌體70g，加入70mL脫脂牛奶充分混勻，置于不銹鋼盤中冷凍干燥，制備成無菌干粉約20g。實(shí)施例3.攜帶HIF-I α基因和KGF基因的重組減毒沙門氏菌(Ty2la-pIRES-HIFl a -KGF (TPHK))的構(gòu)津與制備I.攜帶人KGF和HIF-I α雙基因質(zhì)粒的構(gòu)建將實(shí)施例2中KGF基因的PCR產(chǎn)物切膠回收，與pIRES-HIF-l α載體的Xba I和Not I (均購自Takara)雙酶切產(chǎn)物連接，并將所得重組質(zhì)粒命名為pIRES_HIF_l a -KGF,其質(zhì)粒圖如圖17所示。測(cè)定人HIFl a cDNA序列(上海生エ生物工程技術(shù)服務(wù)公司)。所得pIRES-HIF-l a -KGF 的序列如 SEQ ID NO 8 所示。3.含有真核表達(dá)質(zhì)粒pIRES-HIF-l a -KGF的減毒沙門氏菌菌株(Ty21a-pIRES-HIFl a -KGF (TPHK))的篩選與制備3. I.電穿孔轉(zhuǎn)化將減毒沙門氏菌Ty21a凍存菌液50 μ L接種于5ml不含抗生素的LB培養(yǎng)液，震蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期(菌液A值約O. 4)，4°C條件下，4000r. mirT1離心收集菌體，用預(yù)冷的無菌去離子水洗滌細(xì)胞2次，洗滌后的細(xì)菌懸于Iml冰預(yù)冷的無菌去離子水。用電穿孔法(Multiporator 4308 Eppendorf 電轉(zhuǎn)儀)將 pIRES-HIF-l a -KGF 質(zhì)粒 O. 2 μ g 轉(zhuǎn)化 200 μ L經(jīng)預(yù)處理的減毒沙門氏菌。電穿孔條件電壓2. 5kV，電容25 μ F，電阻200 Ω，放電時(shí)間
0.5s。加入SOC培養(yǎng)基lml，37°C輕柔震蕩培養(yǎng)45min，涂布于含氨芐青霉素(lOOmg.じ1)固體LB培養(yǎng)基平皿，37°C培養(yǎng)16h后各挑取2個(gè)菌落進(jìn)行鑒定。3. 2.陽件工程菌菌株 Tv21a-pIRES-HIF-l a -KGF 的篩詵從培養(yǎng)板各挑取2個(gè)單菌落，分別接種于3mL含氨芐青霉素O. lmg/ml的LB培養(yǎng)液中，37°C在ZD-85恒溫振蕩器(國華企業(yè))搖菌擴(kuò)增培養(yǎng)。轉(zhuǎn)入pIRES-HIF-l a -KGF的減毒沙門氏菌菌株的篩選通過氨芐青霉素抗性、PCR(利用菌液為模板，擴(kuò)增真核表達(dá)啟動(dòng)子CMV及目的基因HIF-I α和KGF)及提取質(zhì)粒后Xba I/Notl酶或Nhel/Mlu I酶酶切鑒定(圖3)。擴(kuò)增真核表達(dá)啟動(dòng)子CMV的引物為SEQ ID NO :9和SEQ ID N0:10;PCR參數(shù)為:94°C預(yù)變性30sec ;55°C變性30sec，72°C延伸lmin，30個(gè)循環(huán)；72°C延伸5min。擴(kuò)增 HIF-I α 的引物 SEQ ID NO :1 和 SEQ ID NO :2。PCR 參數(shù)為94°C變性 60sec，55°C退火60sec，72°C延伸 90sec，30 個(gè)循環(huán)；72°C延伸 7min。擴(kuò)增 KGF 的引物為 SEQ ID NO :4 和 SEQID NO :5，PCR 參數(shù)為:94°C預(yù)變性 5min ;94°C變性 30s，56°C退火 30s，72°C延伸 lmin, 30 個(gè)循環(huán)；72°C延伸lOmin。HIF-I α反應(yīng)體系菌液模板10μ l，HIF_la上游引物(20 μ M)和下游引物(20 μ Μ)各 2μ I, dNTP 4μ 1,10XPCR buffer 5 μ LTaKaRa Taq (5U/ μ 1)0. 5 μ 1，滅菌蒸餾水補(bǔ)足 50μ1。退火溫度 64°C，94°C 5min ;94°C 30s, 60 °C 30s, 72 °C 3min。將篩選的陽性工程菌株命名為Tyl21 a -pIRES-HIFl a -KGF(簡(jiǎn)稱ΤΡΗΚ)。3.工程菌 Ty21a-pIRES-HIF-l a -KGF 的制備將攜帶HIF-I α基因和KGF基因的真核表達(dá)載體的減毒沙門氏菌菌種(Ty21a-pIRES-HIF-l a -KGF)接種于含氨芐青霉素(0. lmg/ml)的LB培養(yǎng)基中，于35-37°C,8% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，作為一代菌種。將一代菌種接種至含完全培養(yǎng)基的克氏瓶中擴(kuò)大培養(yǎng)，作為ニ代菌種。在無菌條件下取一代菌種和ニ代菌種樣涂片，革蘭氏染色后顯微鏡下可見呈革蘭氏陰性桿菌，長(zhǎng)鏈多，菌形一致。將ニ代克氏瓶菌種刮于IOOmL滅菌生理鹽水菌種瓶中，比濁結(jié)果為I. 7X 101°個(gè)/mL，30L發(fā)酵罐發(fā)酵12_14h后4000r/min離心20min。收集菌體70g，加入70mL脫脂牛奶充分混勻，置于不銹鋼盤中冷凍干燥，制備成無菌干粉約20g。實(shí)施例4.重組減毒沙門氏菌TPHK治療大鼠潰瘍性結(jié)腸炎的效果觀察I.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及模型Wistar健康大鼠50只，體重180_220g，清潔級(jí)，由甘肅中醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心(SPF)提供。50只Wistar大鼠實(shí)驗(yàn)前禁食不禁水48h，隨機(jī)取40只大鼠于第3天使其吸入こ醚麻醉。于仰臥位將ー根聚こ烯管(直徑約2mm)經(jīng)肛門插入腸道,深度8cm。將150mg/kg 2,4,6-三硝基苯橫酸(2,4,6-trinitro picrylsulfonic acid, TNBS)與 50% こ醇等體積溶液(V/V)注入腸道，保持肛門高位5min，以防止液體流出。余下的10只大鼠以等量生理鹽水取代TNBS灌腸液灌腸，其余過程均相同。2.動(dòng)物分組及治療將TNBS灌腸的40只大鼠隨機(jī)分為5組TPHK治療組、TPK治療組、TPH治療組、模型對(duì)照組(TC組)。生理鹽水灌腸大鼠設(shè)為正常對(duì)照組(NC組)，每組50只。灌腸后第3天開始灌胃治療，隔日一次，每只O. 5ml菌液，連續(xù)給藥3次。TPK、TPH、TPHK菌液分別接種于含氨節(jié)青霉素O. lmg/ml的LB培養(yǎng)基中在恒溫振蕩器中搖菌擴(kuò)增,9h后收集菌體,PBS洗滌后，用100g/L NaHCO3溶液懸浮，調(diào)整細(xì)菌數(shù)為2 X IO9Cfu (菌落形成単位)/mL，立即灌胃。模型對(duì)照組和正常對(duì)照組給予同體積100g/L NaHC03。 3.樣品采集和處理連續(xù)灌胃3次，次日3%戊巴比妥鈉40mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，仰臥位固定于操作板上，之后常規(guī)碘酒、酒精消毒腹部皮膚，無菌開腹。取自距回盲部5 IOcm以上部分的小腸樣品2cm用于病理組織學(xué)測(cè)定。4.病理組織學(xué)檢測(cè)操作步驟大鼠處死后立即取小腸標(biāo)本10%中性福爾馬林固定24hI脫水24h后,石臘包埋、切片I脫蠟ニ甲苯I、ニ甲苯 II 各 IOmin ;ニ甲苯 IIIlOminI水化無水こ醇I、無水こ醇11、95%こ醇、85%こ醇各IminI流水沖洗I復(fù)染蘇木素lmin，清水沖洗I分化I %的酒精鹽酸涮幾下，清水沖洗I返藍(lán)10%氨水IOsec清水沖洗I伊紅液(95 %こ醇溶液)I 3minI脫水85%こ醇、95%こ醇、無水こ醇I、無水こ醇II各2minI透明ニ甲苯I、ニ甲苯II、ニ甲苯III各2min
I封片樹脂封片I光學(xué)顯微鏡觀察分析。4. I 一般形態(tài)學(xué)觀察NC組大鼠腸管黏膜皺襞紋理清晰，未見糜爛及潰瘍。TC組大鼠腸管變粗，腸壁部分甚至膨脹巨大變薄，腸管黏膜壞死組織，潰瘍及糜爛面的上面有灰黒色膜狀物附著，其附
近黏膜充血、水腫明顯。TPH和TPK治療組較模型組有所改善，但大鼠腸壁仍有輕度充血。TPHK治療組較TC組和TPH、TPK治療組在形態(tài)上均有顯著改善(圖4)。4. 2組織學(xué)觀察光鏡下觀察大鼠結(jié)腸組織可見，NC組黏膜、腺體結(jié)構(gòu)清晰，黏膜下血管豐富；TC組黏膜糜爛、剝脫程度較重，潰瘍數(shù)量多，潰瘍面大，黏膜及黏膜下層有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，腺體破壞，組織壞死，未見明顯增生現(xiàn)象；TPK和TPH治療組與TC組比較結(jié)腸黏膜炎癥充血、水腫、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度減輕，潰瘍面縮??；ΤΡΗΚ組較其他各組結(jié)腸黏膜炎癥充血、水腫、炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)明顯降低，潰瘍面顯著縮小或完全消失，腸腺增生，潰瘍底部可見黏膜下層有新生肉芽組織增生，且有豐富的毛細(xì)血管增生(圖5)。5.實(shí)驗(yàn)結(jié)論本實(shí)驗(yàn)觀察到TPHK對(duì)Wistar大鼠潰瘍性結(jié)腸炎難愈合創(chuàng)面修復(fù)有良好的促進(jìn)作用，表現(xiàn)在能明顯減輕TNBS誘發(fā)潰瘍性結(jié)腸炎模型大鼠的癥狀及炎癥，促進(jìn)黏膜上皮細(xì)胞的再生，加快損傷部位血運(yùn)的重建，對(duì)已形成的黏膜損傷及潰瘍有促修復(fù)作用。實(shí)施例5.重組TPHK治療大鼠高海拔缺氧腸應(yīng)激損傷的效果觀察I.材料I. I主要試劑3%戊巴比妥鈉、丙ニ醛(MDA)測(cè)試盒(南京建成)、超氧化物歧化酶(SOD)測(cè)試盒(南京建成)、KGF ELISA檢測(cè)試劑盒(R&D) ,HIFl ELISA檢測(cè)試劑盒(R&D)。I. 2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物Wistar大鼠，質(zhì)量為200_220g，雄性大鼠，清潔級(jí)，由蘭州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。I. 3實(shí)驗(yàn)菌株減毒沙門氏菌(Ty21a)、攜帶HIF- α基因的減毒沙門氏菌(TPH)、攜帶KGF基因的減毒沙門氏菌(TPK)、攜帯人HIF-I α基因和KGF的減毒沙門氏菌(TPHK)，后三者按照上述實(shí)施例制備。I. 4 儀器酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(南京華東電子集団醫(yī)療裝備有限責(zé)任公司)紫外/可見分光光度計(jì)(uvlOOl，上海天美科學(xué)儀器有限公司)Electronic Balance(AUW120D, SHIMADZU CORPORATION JANPAN)80-2離心機(jī)(上海手術(shù)機(jī)械廠)MM-2A微型振蕩器(北京市長(zhǎng)風(fēng)儀器儀表公司)超速低溫臺(tái)式離心機(jī)(Heraeus,德國)。Olympus BX5ITF 光學(xué)顯微鏡(日本 Olympus 公司)
P310型數(shù)碼相機(jī)(日本Olympus公司)97-1型磁力加熱攪拌器(江蘇周莊科研儀器廠)熱恒溫水浴箱(上海醫(yī)療器械七廠)ZD-85恒溫振蕩器(國華企業(yè))2.方法2. I動(dòng)物分組及防治健康雄性Wistar大鼠64只，體重200 220克。動(dòng)物購進(jìn)后在本單位動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室
飼養(yǎng)I周，適應(yīng)后投入實(shí)驗(yàn)。隨機(jī)分為TPHK治療組(TTPHK組),PTHK預(yù)防組(PTPHK組)、TPH治療組(TTPH組)、TPH預(yù)防組(PTPH組)、TPK治療組(TTPK組)、TPK預(yù)防組(PTPK組)、模型對(duì)照組(TC組)和正常對(duì)照組(NC組)，每組8只動(dòng)物。將TPK、TPH和TPHK菌種分別接種于含氨芐青霉素O. lmg/ml的LB培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)，8h后收集菌液，PBS洗滌后，用10%的NaHCO3溶液懸浮，調(diào)整細(xì)菌數(shù)為lX109cfu/ml，灌胃。TTPH組、TTPK組和TTPHK組建模后開始灌胃IO9Cfu/只，每隔一天灌胃一次，共4次，7天后處死大鼠；PTPH組、PTPK組和PTPHK組于建模前第3天開始灌胃IO9Cfu/只，每隔I天灌胃I次，共4次，7天后處死；R組于建模4天后處死；C組于建模第4天處死。2. 2模型制作采用急進(jìn)海拔為3800m的馬銜山之后通過腸系膜上動(dòng)脈缺血再灌注(I/R)建立高海抜缺氧應(yīng)激致大鼠腸黏膜損傷模型。具體操作大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉40mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，仰臥位固定于操作板上，消毒后取腹正中切ロ長(zhǎng)約3cm，用溫鹽水紗布將腸管推向左側(cè)腹腔，暴露右腎內(nèi)上方的腸系膜根部，找到腸系膜上動(dòng)脈(superior mesenteric artery, SMA)SMA),在其根部用無創(chuàng)傷血管夾夾閉阻斷SMA 60min，造成腸缺血模型，然后松夾，再灌注60min，之后關(guān)閉腹腔，并腹腔注射IOml/生理鹽水。2. 3樣品采集和處理依據(jù)上述指定時(shí)間，用3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠心臟采血5ml :常規(guī)碘酒、酒精消毒腹部皮膚，無菌開腹，全血離心(4°C /1000rpm/20min)后分裝血漿，_80°C冰箱保存?zhèn)溆糜谏治?、S0D、MDA檢測(cè)。小腸組組織樣品取自距回盲部5-lOcm以上部分，2cm用于組織病理學(xué)學(xué)測(cè)定，IOcm在液氮中凍存，用于ELISA測(cè)定。3.結(jié)果3. I臟器功能的檢測(cè)血漿AST (天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶)、ALT (丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶)、BUN (尿素)、UREA (肌酐)、CK-MB (肌酸激酶同エ酶)使用7170自動(dòng)生化分析儀測(cè)，結(jié)果如下(表I)。
權(quán)利要求
1.HIF-I α和KGF聯(lián)合用于制備預(yù)防和/或治療急性應(yīng)激性胃腸道損傷性疾病的藥物中的用途。
2.權(quán)利要求I的用途，其中所述HIF-Ia和KGF以同時(shí)攜帶并可在真核細(xì)胞中表達(dá)HIF-I a和KGF基因的重組真核表達(dá)質(zhì)粒的形式提供。
3.權(quán)利要求2的用途，其中所述重組真核表達(dá)質(zhì)粒為pIRES-HIF-1a -KGF(PHK)，其序列如SEQ ID NO 8所示。
4.權(quán)利要求I的用途，其中所述HIF-Ia和KGF以含有權(quán)利要求2所述的重組真核表 達(dá)質(zhì)粒并可直接將所述重組真核表達(dá)質(zhì)粒帶入動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的重組細(xì)菌的形式提供。
5.權(quán)利要求4的用途，其中所述重組細(xì)菌為減毒沙門氏菌或者對(duì)人體無毒或者減毒的可直接將真核表達(dá)質(zhì)粒帶入動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的其他細(xì)菌，所述其他細(xì)菌包括但不限于減毒的雙歧桿菌、減毒的大腸桿菌。
6.權(quán)利要求5的用途，其中所述減毒沙門氏菌為含有PIRES-HIF-1a -KGF質(zhì)粒的Ty21a 菌株，即 TPHK, pIRES-HIF-l a -KGF 質(zhì)粒的序列如 SEQ ID NO 8 所示。
7.權(quán)利要求1-6任ー項(xiàng)的用途，其中所述HIF-Ia和KGF是人源HIF_1a和KGF或者鼠或其他哺乳動(dòng)物的HIF-I a和KGF，優(yōu)選人源HIF-I a和KGF。
8.權(quán)利要求I的用途，其中所述急性應(yīng)激性胃腸道損傷性疾病是缺氧應(yīng)激致胃腸道損傷性疾病，包括高海拔缺氧應(yīng)激致胃腸道損傷性疾病以及其他急性應(yīng)激性胃腸道損傷疾病；所述高海拔缺氧應(yīng)激致胃腸道損傷性疾病包括直接的急進(jìn)高海拔缺氧應(yīng)激致胃腸道黏膜損傷。
9.權(quán)利要求8的用途，其中所述其他急性應(yīng)激性胃腸道損傷性疾病包括急性應(yīng)激性潰瘍性結(jié)腸炎、急性應(yīng)激胃潰瘍，還包括物理的如射線、化學(xué)的如各種有機(jī)農(nóng)藥及微生物毒素、微生物的如各種胃腸道致病菌等因素以及高原應(yīng)激如高海拔各種特殊的自然環(huán)境因素或其他的突發(fā)事件作為應(yīng)激源引起的急性胃腸道損傷性疾病。
10.一種重組真核表達(dá)質(zhì)粒，其同時(shí)攜帶并可在真核生物中表達(dá)HIF-I a和KGF基因。
11.權(quán)利要求10的重組真核表達(dá)質(zhì)粒，其中所述載體為pIRES-HIF-1a -KGF(PHK)，其序列如SEQ ID NO 8所示。
12.權(quán)利要求10或11的重組真核表達(dá)質(zhì)粒，其中所述HIF-Ia和KGF基因是人源HIF-Ia和KGF或者鼠或其他哺乳動(dòng)物的HIF-I a和KGF，優(yōu)選人源HIF_1 a和KGF。
13.—種重組細(xì)菌，其含有權(quán)利要求10-12任一項(xiàng)所述的重組真核表達(dá)質(zhì)粒并可直接將所述真核表達(dá)質(zhì)粒帶入動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)。
14.權(quán)利要求13所述的重組細(xì)菌，其中所述重組細(xì)菌為減毒沙門氏菌或者對(duì)人體無毒或者減毒的可直接將真核表達(dá)質(zhì)粒帶入動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的其他細(xì)菌，所述其他細(xì)菌包括但不限于減毒的雙歧桿菌、減毒的大腸桿菌。
15.權(quán)利要求14的重組細(xì)菌，其中所述減毒沙門氏菌為所述減毒沙門氏菌為含有pIRES-HIF-1 a -KGF 質(zhì)粒的 Ty21a 菌株，即 TPHK, pIRES-HIF-l a -KGF 的序列如 SEQ ID NO 8所示。
16.權(quán)利要求13至15任一項(xiàng)的重組細(xì)菌，其中所述HIF-Ia和KGF為人源HIF-Ia和KGF或者鼠或其他哺乳動(dòng)物的HIF-I a和KGF，優(yōu)選人源HIF_1 a和KGF。
17.ー種藥物組合物，其包含治療有效量的HIF-I a和KGF，或者包含治療有效量的權(quán)利要求10-12任一項(xiàng)所述的重組真核表達(dá)質(zhì)粒，或者包含治療有效量的權(quán)利要求13-16任一項(xiàng)所述的重組細(xì)菌。
18.權(quán)利要求17的藥物組合物，用于治療急性應(yīng)激性胃腸道損傷性疾病特別是缺氧應(yīng)激致胃腸道損傷性疾病可以為高原應(yīng)激反應(yīng)、及其他急性的全身或胃腸道局部缺血缺氧性疾病引起的急性胃腸道損傷；所述的高海拔缺氧應(yīng)激致胃腸道損傷性疾病還可以是直接的急進(jìn)高海拔缺氧應(yīng)激致胃腸道黏膜損傷。
19.權(quán)利要求18的藥物組合物，其中所述其他急性應(yīng)激性胃腸道損傷性疾病特別是急性應(yīng)激性潰瘍性結(jié)腸炎、急性應(yīng)激胃潰瘍，可以為物理的如射線、化學(xué)的如各種有機(jī)農(nóng)藥及微生物毒素、微生物的如各種胃腸道致病菌等因素以及高原應(yīng)激如高還發(fā)各種特殊的自然環(huán)境因素或其他的突發(fā)事件作為應(yīng)激源引起的急性胃腸道損傷性疾病。
20.權(quán)利要求17-19任一項(xiàng)的藥物組合物，其中還包含可藥用輔助劑，例如賦形劑、穩(wěn)定劑、防腐劑、載體。
21.權(quán)利要求17-20任一項(xiàng)的藥物組合物，其中所述藥物組合物為ロ服膠囊制劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及預(yù)防和/或治療急性應(yīng)激性胃腸道損傷性疾病的細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因藥物，HIF-1α和KGF基因在制備用于預(yù)防和/或治療急性應(yīng)激性胃腸道損傷性疾病的藥物中的用途。本發(fā)明還涉及包含所述HIF-1α和KGF的藥物組合物。本發(fā)明可以有益地預(yù)防和/或治療急性應(yīng)激性胃腸道損傷性疾病。
文檔編號(hào)C12R1/19GK102813941SQ201210263919
公開日2012年12月12日 申請(qǐng)日期2012年7月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月27日
發(fā)明者哈小琴, 楊志華, 彭俊華, 鄧芝云, 董菊子, 趙勇, 張媛媛 申請(qǐng)人:厚樸生物科技(蘇州)有限公司