專利名稱：來源于里氏木霉的一個蛋白質(zhì)及其基因的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及來源于里氏木霉的一個蛋白質(zhì)及其基因的用途，特別涉及來源于里氏木霉的Trfogl在調(diào)控里氏木霉的胞外蛋白的分泌量中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
絲狀真菌里氏木霉(Trichoderma reesei)是一種嗜溫的腐生真菌,被廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)食品、飼料、紡織、制漿和造紙等行業(yè)用纖維素和半纖維素酶。目前已成為研究纖維素降解的重要模式菌株。里氏木霉是FDA認(rèn)證的安全生產(chǎn)菌株，具有強(qiáng)大的蛋白分泌能力，并且具有與高等哺乳動物相似的糖基化系統(tǒng)，因此里氏木霉也是一種非常理想的重組蛋白表達(dá)宿主。為了進(jìn)一步提高里氏木霉的纖維素酶半纖維素酶產(chǎn)量，同時提高其表達(dá)異源蛋白的分泌量，近年來，如何提高里氏木霉的胞外蛋白合成分泌量成為研究熱點(diǎn)?！つ壳把芯勘砻骼锸夏久估w維素酶基因的表達(dá)調(diào)控是在轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行的，受到轉(zhuǎn)錄激活因子的促進(jìn)和碳代謝抑制蛋白的阻遏，在以往的研究中，人們采用基因克隆、酵母雜交等傳統(tǒng)方法分離、僅僅鑒定了 3個轉(zhuǎn)錄激活因子(Ace2、Hap2/3/5、Xyrl)和2個阻遏蛋白(Cre I ,Ace I)。同時也有研究表明阻遏蛋白的缺失可以顯著提高里氏木霉外分泌蛋白的表達(dá)水平?；诶锸夏久估w維素酶表達(dá)調(diào)控的復(fù)雜性，在其轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程中應(yīng)該還有許多關(guān)鍵的調(diào)控因子仍然沒被發(fā)現(xiàn)。通過對一些具有轉(zhuǎn)錄因子典型結(jié)構(gòu)的蛋白進(jìn)行功能分析，研究其在纖維素酶半纖維素酶生物合成中的作用有望從機(jī)制本身進(jìn)一步提高里氏木霉合成和分泌蛋白的能力。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供來源于里氏木霉的Trfogl蛋白的用途。本發(fā)明所提供的一個用途是Trfogl在調(diào)控里氏木霉(Trichoderma reesei)胞外蛋白分泌量中的應(yīng)用；所述Trfogl是氣基酸序列如序列表中序列2所不的蛋白。其中，序列表中序列2由363個氨基酸殘基組成。Trfogl的理論分子量為40. 8kDa，等電點(diǎn)為 9. 231。所述胞外蛋白包括里氏木霉(Trichoderma reesei)的內(nèi)源蛋白，如纖維素酶和/或半纖維素酶,還可包括導(dǎo)入里氏木霉(Trichoderma reesei)的外源蛋白。其中，在不包含外源蛋白的里氏木霉菌株中，所述調(diào)控里氏木霉(Trichodermareesei)胞外蛋白分泌量可體現(xiàn)為調(diào)控纖維素酶和/或半纖維素酶的分泌量。本申請的實驗證明，將里氏木霉出發(fā)菌株中的Trfogl基因敲除后得到了胞外蛋白分泌量明顯增加，特別是纖維素酶分泌量明顯增加的Trfogl基因敲除株，說明Trfogl是與里氏木霉(Trichoderma reesei)胞外蛋白分泌量相關(guān)的一個蛋白。本發(fā)明還提供了構(gòu)建Trfogl基因敲除株(一種重組里氏木霉菌)的具體方法。本發(fā)明所提供的制備重組里氏木霉菌的方法，包括敲除里氏木霉(Trichodermareesei)中的Trfogl基因得到所述重組里氏木霉菌的步驟,所述Trfogl是氨基酸序列如序列表中序列2所示的蛋白。所述Trfogl基因可為基因組基因也可為cDNA基因，序列表中的序列I為Trfogl的cDNA基因，共有1092bp ;序列表中序列5的第2501-3660為Trfogl的基因組基因，共有1160bp。所述方法中可通過同源重組、隨機(jī)插入突變或RNAi敲除里氏木霉(Trichodermareesei)中的 Trfogl 基因。其中，用于發(fā)生同源重組的組件(敲除組件)由Trfogl基因上下游同源臂及在所述Trfogl基因上下游同源臂之間插入的便于篩選轉(zhuǎn)化子的篩選標(biāo)記基因組成。本發(fā)明序列表中的序列5給出了里氏木霉Trfogl基因及其上下游各2500bp的基因組DNA序列，序列表中的序列5的第1-2500位為所述Trfogl基因上游2500bp序列，序列表中的序列5的第3601-6160位為所述Trfogl基因下游2500bp序列，所述Trfogl基因·及其上下游序歹丨J可見如下網(wǎng)站http: //genome, jgj-psf. org/cgi-bin/dispGeneModel db=Trire2&tid=108357o其中，所述同源重組中采用的上游同源臂可選自Trfogl基因及其上游序列，長度至少lOOObp，所述同源重組中采用的下游同源臂可選自Trfogl基因及其下游序列，長度至少lOOObp。在本發(fā)明的實施例中，上游同源臂選自Trfogl基因上游序列，下游同源臂選自Trfogl基因下游序列。所述同源臂具體可為序列表中序列4的第10-1405位(序列5的第787-2182位)，所述同源重組中采用的下游同源臂的核苷酸序列可為序列表中序列4的第3336-4920 位(序列 5 的第 4077-5661 位)。在本發(fā)明的實施例中，所述同源重組通過將序列表中序列4所示的DNA片段(敲除組件)導(dǎo)入所述里氏木霉(Trichoderma reesei)實現(xiàn)。序列表中的序列4的第10-1405位為Trfogl的上游同源臂，第3336-4920位為Trfogl的下游同源臂,第1406-3342位為pyr4表達(dá)盒。其中，pyr4為篩選標(biāo)記基因，是營養(yǎng)選擇性標(biāo)記基因乳清酸核苷_5’ -單磷酸脫羧酶的基因。由上述任一種方法得到的重組里氏木霉菌(Trfogl基因敲除株)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明所提供的另一個用途是用于敲除里氏木霉(Trichoderma reesei)的Trfogl基因的物質(zhì)在提高里氏木霉(Trichoderma reesei)中胞外蛋白分泌量中的應(yīng)用，所述Trfogl是氨基酸序列如序列表中序列2所示的蛋白。其中，所述用于敲除里氏木霉(Trichoderma reesef)的Trfogl基因的物質(zhì)可為下述任一種生物材料I)用于敲除里氏木霉(Trichoderma reesei)的Trfogl基因的DNA片段,所述DNA片段含有Trfogl基因上游同源臂和Trfogl基因下游同源臂，所述Trfogl基因上游同源臂的核苷酸序列為序列表中序列4的第10-1405位，所述Trfogl基因下游同源臂的核苷酸序列為序列表中序列4的第3336-4920位；所述DNA片段具體可為序列表中序列4所示的雙鏈 DNA。2)含有步驟I)的DNA片段的重組載體；該重組載體用于保存敲除組件。3)含有步驟I)的DNA片段的重組細(xì)胞，該重組細(xì)胞用于保存敲除組件。其中，步驟3)中的重組細(xì)胞可為非人的動物細(xì)胞、微生物細(xì)胞或植物細(xì)胞。
本發(fā)明為構(gòu)建胞外蛋白分泌量增加的里氏木霉宿主菌和工程菌提供了技術(shù)基礎(chǔ)。


圖I為Trfogl敲除菌株的PCR鑒定圖譜。圖2為Trfogl敲除菌株和出發(fā)菌株發(fā)酵上清液的SDS-PAGE分析
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑，質(zhì)粒等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。所有引物均由上海生工合成。菌株·里氏木霉菌株TU6 A tku70為尿嘧啶營養(yǎng)缺陷菌株，由奧地利維也納大學(xué)MonikaSchmoll實驗室饋贈，TU6 A tku70即為如下文獻(xiàn)中的KU70. 4轉(zhuǎn)化子(將紅褐肉座菌(Hypocrea jecorina,即 Trichoderma reesei 的有性型)TU-6 菌株中的 tku70 缺失得到的轉(zhuǎn)化子)Gene targeting in a nonhomologous end joining deficient Hypocreajecorina. Zhang Guangtaoa, et al. Journal of Biotechnology 139(2009) 146 - 151。公眾可從中國科學(xué)院微生物研究所獲得該菌株。培養(yǎng)基、試劑I) 土豆培養(yǎng)基PDA (100ml) :20g去皮馬鈴薯，切碎，加入90mL水，煮沸30min，雙層紗布過濾，加入2g葡萄糖和I. 8g瓊脂粉，用水定容至lOOmL，115°C高壓蒸氣滅菌。2)基本培養(yǎng)基(Minimal medium, MM)組成溶劑為水，每升培養(yǎng)基中溶質(zhì)及其質(zhì)量為0. 05g (NH4)2SO4jO. 15g KH2PO4,0. 006g MgSO4,0. 006g CaCl2,0. 00005g FeSO4 *7H20,
0.000016g MnSO4 H20,0. 000014g ZnSO4 7H20，0. 00002g CoCl203)發(fā)酵培養(yǎng)基在麗培養(yǎng)基中加入下列碳源(如1%纖維素、3%乳糖、1%木聚糖、2%葡萄糖、2%甘油，終濃度)之一，pH 5. 2±0. I。Al、含I. OM山梨醇但不含尿苷的MM培養(yǎng)基平板在MM中加入山梨醇至終濃度為
1.0M，再加入瓊脂制成固體培養(yǎng)基。A2、MM+0. l%Triton XlOO的平板在含有2%葡萄糖的MM中加入Triton XlOO至體積終濃度為0. 1%，再加入瓊脂制成固體培養(yǎng)基。A3、含2%葡萄糖的MM液體培養(yǎng)基在MM中加入葡萄糖至終濃度為2% (質(zhì)量百分濃度)得到的液體培養(yǎng)基。A4、MM+1%微晶纖維素液體培養(yǎng)基在MM中加入微晶纖維素至終濃度為1% (質(zhì)量百分濃度)得到的液體培養(yǎng)基。4)LB培養(yǎng)基溶劑是水，每升培養(yǎng)基中溶質(zhì)及其質(zhì)量百分含量為1%蛋白胨，1%氯化鈉，0. 5%酵母提取物。5)里氏木霉染色體DNA提取緩沖液Tris. Cl pH 8. 5 200raMEDTA pH 8. O 25mMNaCl250mM
SDS2%6)原生質(zhì)體制備及轉(zhuǎn)化相關(guān)試劑0. 2M 磷酸緩沖液 pH7. 4 (每 IOOmL)0. 2M Na2HPO48 ImL0. 2M NaH2PO419mLI. 2mol/L 的 MgSO4 溶液·MgSO4I. 2M磷酸緩沖液pH7. 4IOmM0.6M的山梨醇溶液山梨醇0. 6MTris. Cl pH 7. 00. OlMI. OM的山梨醇溶液山梨醇I. OMCaCl20. OlMTris. Cl pH 7. 50. OlMPEG 溶液PEG400050%CaCl20. 05MTris. Cl pH7. 50. OlM實施例I、敲除里氏木霉Trfogl基因構(gòu)建胞外蛋白分泌量增加的重組里氏木霉菌本實施例中，通過將序列表中序列4所示的DNA片段(敲除組件)導(dǎo)入里氏木霉出發(fā)菌株-里氏木霉菌株TU6 A tku70中通過同源重組將Trfogl基因敲除得到了胞外蛋白分泌量明顯增加，特別是纖維素酶分泌量明顯增加的Trfogl基因敲除株(重組里氏木霉菌)。I、Trfogl基因(含兩側(cè)同源臂)及pyr4基因表達(dá)盒的PCR擴(kuò)增以里氏木霉(Trichodermareesei)菌株QM9414 (ATCC 26921)基因組DNA為模板，引物Fogl-F，F(xiàn)ogl-R擴(kuò)增包含Trfogl兩側(cè)同源臂的Trfogl基因片段(上游同源臂1395bp、Trfogl基因1160bp、下游同源臂1589bp)。擴(kuò)增程序為95°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，61°C退火30s，72°C延2min，30個循環(huán)；最后72°C擴(kuò)展延伸lOmin。將所得PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳，瓊脂糖凝膠電泳試劑盒回收目的條帶，連接至pEASY-Blunt simple載體，形成重組載體pFogl,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a。挑取轉(zhuǎn)化子進(jìn)行鑒定并抽提質(zhì)粒pFogl,進(jìn)行測序，結(jié)果表明Fogl-F和Fogl-R得到的PCR產(chǎn)物的序列如序列表中序列3所示，序列3的第10-1723位為Trfogl基因上游同源臂，第1724-2883位為Trfogl的基因組基因，第2884-4884位為Trfogl基因下游同源臂，第3294-3299位為SalI的識別位點(diǎn)GTCGAC，第1406-1411位為EcoRI的識別位點(diǎn)GAATTC。Trfogl的cDNA基因如序列表中的序列I所示，由1092bp組成，編碼序列表中序列2的蛋白質(zhì)。序列表中的序列2由363個氨基酸殘基組成。
利用引物Flpyr-F, Flpyr-R 以里氏木霉(Trichoderma reesei)菌株QM9414(ATCC26921)基因組DNA為模板擴(kuò)增營養(yǎng)選擇性標(biāo)記基因乳清酸核苷-5’-單磷酸脫羧酶的pyr4基因表達(dá)盒片段，擴(kuò)增程序為95°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，64°C退火30s，72°C延lmin，30個循環(huán)；最后72°C擴(kuò)展延伸lOmin。將所得PCR產(chǎn)物于I %瓊脂糖凝膠電泳，瓊脂糖凝膠電泳試劑盒回收目的條帶，連接至pEASY-Blunt simple載體,形成重組載體pFlpyr4,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a。挑取轉(zhuǎn)化子進(jìn)行鑒定并抽提質(zhì)粒pFlpyr4,進(jìn)行測序,結(jié)果表明Flpyr-F和Flpyr-R得到的PCR產(chǎn)物的序列如序列表中序列4的第1406-3335位所示。所用到的引物序列如下Fogl-F CCGCTCGAGGACTTTGCCTGTGCTCCATGATCAGFogl-R ATAGTTTAGCGGCCGCTGTATAGTTAGTTTCTTGCCTCTCFlpyr-F:CCGGAATTCCA ACTGCATCCA A ACCATCCT·
Flpyr-R:ACGCGTCGACCTCACCCCCAAAGTCGCAATAT2、里氏木霉Trfogl敲除載體的構(gòu)建及敲除組件的獲得分別用限制性內(nèi)切酶SalI和EcoRI消化質(zhì)粒pFogl和pFlpyr4,回收pFogl消化產(chǎn)生的5. 9kb的片段和pFlpyr4消化產(chǎn)生的I. 9kb的片段，將這兩個片段進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑取轉(zhuǎn)化子進(jìn)行測序鑒定，即得到Trfogl基因的敲除載體pBFlpyr4。以質(zhì)粒pBFlpyr4為模板，引物Fogl-F，F(xiàn)ogl-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為95°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，61°C退火30s，72°C延2min，30個循環(huán)；最后72°C擴(kuò)展延伸lOmin。PCR擴(kuò)增所得的產(chǎn)物即為包含Trfogl基因上下游同源臂以及pyr4基因表達(dá)框的敲除組件片段，其序列如序列表中的序列4，序列4的第1-34位為Fogl-F，第4896-4935位為Fogl-R的反向互補(bǔ)序列，第10-1405位為Trfogl的上游同源臂,第3336-4920位為Trfogl的下游同源臂，第1406-3335位為pyr4表達(dá)盒。3、里氏木霉菌株Tu6 A tku70的原生質(zhì)體制備A.取新鮮培養(yǎng)的斜面或平板(培養(yǎng)基是PDA)上的里氏木霉菌株Tu6 A tku70孢子，用適量無菌水洗滌孢子制成孢子懸液，200目篩子過濾除去殘余的菌絲。將過濾的孢子懸液接種至裝有IOOmL MM培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，28°C培養(yǎng)13h_14h，至菌絲伸展。B.將培養(yǎng)液經(jīng)200目篩子過濾，收集菌體，無菌水洗滌2-3次，最后用I. 2M的MgS04溶液洗滌一次，讓溶液自然流盡。C.將篩子上的菌體沖洗到裝有15mL裂解液的三角瓶中(裂解液是含有150mg的裂解酶和15mg纖維素酶的I. 2M MgSO4溶液)，30°C反應(yīng)I. 5h，顯微鏡下觀察原生質(zhì)體產(chǎn)生的情況，Ih后每隔IOmin取樣觀察一次。D.當(dāng)原生質(zhì)體大量產(chǎn)生并且仍有大量菌絲存在時，加等體積0.6M的山梨醇溶液終止反應(yīng)，200目篩子過濾除去殘余的菌絲，室溫3000rpm離心IOmin收集原生質(zhì)體沉淀。E.沿著沉淀一側(cè)倒去上清，原生質(zhì)體沉淀用I. OM山梨醇溶液重懸，室溫3000rpm離心IOmin0F.重復(fù)步驟E，棄上清將原生質(zhì)體懸浮于200 ii L I. OM山梨醇溶液中，得到里氏木霉菌株Tu6 A tku70的原生質(zhì)體，血球板計數(shù)器觀察并計數(shù)。4、Trfogl敲除組件轉(zhuǎn)化里氏木霉菌株Tu6 A tku70原生質(zhì)體A.將步驟2用引物Fogl-F和Fogl-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得的敲除組件(其序列如序列表中的序列4)進(jìn)行回收并用2倍體積的無水乙醇及1/10體積的3. OM醋酸鈉(pH5. 2)過夜沉淀，用70%乙醇洗滌2次，用滅菌ddH20溶解，使敲除組件的濃度達(dá)每微升微克級。B.將一定量(體積不超過20 U L)制備好的敲除組件加入到步驟3)制備的里氏木霉菌株Tu6 A tku70原生質(zhì)體中，輕輕混勻，再往其中加入50 u LPEG4000,再次混勻，冰上放置30min ;設(shè)對照，對照用等體積的無菌水代替DNA。C.再往上述管中各加入ImL PEG4000，混勻，室溫放置20min。D.加入ImL I. OM山梨醇溶液，混勻后分四次與四支4ml融化的麗培養(yǎng)基(58°C以下)混和，立即鋪于含I. OM山梨醇但不含尿苷的MM培養(yǎng)基平板上，30°C培養(yǎng)4 7天。在不含尿苷的MM培養(yǎng)基中，只有轉(zhuǎn)入pyr4的菌株才能生長。5、轉(zhuǎn)化子的篩選及分子鑒定·待轉(zhuǎn)化子長出后，將其轉(zhuǎn)移至PDA平板上，28 °C培養(yǎng)3_5天有孢子生成后，將平板上的孢子用無菌水將孢子洗下來制備成孢子懸液，做梯度稀釋后，將其涂布在MM+0. l%Triton XlOO的平板上分單孢。待菌絲長出后，抽提基因組DNA，PCR鑒定陽性轉(zhuǎn)化子，所用鑒定引物如下FlVup-F:ACTGCCGATTAGAGTGGAGTGGTTFlVup-R:GGAAGGTTCATATATGGTCCTGACFldown-F:GCGAGGGAGTTGCTTTAATGTCGGFldown-R:CACCCATGTCGAACCGGTGAGAGC。序列表中的序列5是Trfogl及其上下游2500bp的片段。FlVup-F對應(yīng)于序列5的第567-590位，F(xiàn)ldown-R對應(yīng)于序列5的5703位。Fldown-F對應(yīng)于序列4的第3178-3201位，F(xiàn)lVup-R對應(yīng)于序列4的1532-1555位。序列5的第787位對應(yīng)于序列4的第10位，為Trfogl的上游同源臂第I位；序列5的第5661位對應(yīng)于序列4的4920位，為Trfogl的下游同源臂的最后I位。其中，F(xiàn)IVup-F，F(xiàn)ldown-R引物分別結(jié)合于敲除組件中同源臂的外側(cè)序列，F(xiàn)lVup-R, Fldown-F分別與pyr4表達(dá)盒的上下游結(jié)合，如果trfogl敲除組件定點(diǎn)整合在trfogl位點(diǎn)，則FIVup-F，F(xiàn)lVup-R引物對理論上應(yīng)該擴(kuò)增出1769bp的片段，F(xiàn)ldown-F，F(xiàn)ldown-R引物對應(yīng)該擴(kuò)增出1812bp的片段。而原始菌株里氏木霉菌株Tu6 A tku70不會擴(kuò)增出相關(guān)的條帶。用FlVup-F和FlVup-R擴(kuò)增出1769bp的PCR產(chǎn)物，且用Fldown-F和Fldown-R擴(kuò)增出1812bp的PCR產(chǎn)物的菌株即為Trfogl敲除菌株，其PCR鑒定結(jié)果如圖I。圖I中，泳道I :里氏木霉菌株Tu6 A tku70DNA為模板，引物FIVup-F，F(xiàn)lVup-R的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；泳道2 =Trfogl敲除菌株DNA為模板，引物FIVup-F，F(xiàn)lVup-R的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；泳道
3:里氏木霉菌株Tu6 A tku70DNA為模板，引物Fldown-F，F(xiàn)ldown-R的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；泳道
4Trfogl敲除菌株DNA為模板，引物Fldown-F, Fldown-R的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。6、對照株、敲除菌株發(fā)酵液蛋白表達(dá)分泌差異分析得到遺傳穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化株后，將對照株里氏木霉菌株Tu6 A tku70與Trfogl敲除菌株轉(zhuǎn)至PDA平板上產(chǎn)孢，然后用無菌水洗滌孢子制備成濃度為IO8個/mL的孢子懸液，取ImL孢子懸液接種于250mL三角瓶中的50mL含2%葡萄糖的MM液體培養(yǎng)基中，28°C，200rpm預(yù)培養(yǎng)48h,四層紗布過濾菌體,分別稱取I. 8克菌體于50mL MM+1%微晶纖維素液體培養(yǎng)基中，28°C，200rpm震蕩培養(yǎng)168h，期間，從48h開始，每隔24h取發(fā)酵上清液(胞外發(fā)酵液)，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。里氏木霉菌株Tu6 A tku70和Trfogl敲除菌株的培養(yǎng)條件及接種量完全相同。每次取樣的里氏木霉菌株Tu6 A tku70和Trfogl敲除菌株的發(fā)酵上清液體積相同。每次取樣，里氏木霉菌株Tu6 A tku70和Trfogl敲除菌株各取三瓶。結(jié)果表明，發(fā)酵48h，72h，96h，120h, 144h，168h，Trfogl敲除菌株均比里氏木霉菌株Tu6 A tku70胞外蛋白分泌量明顯提高(圖2)。圖2中，Tu6ku70為里氏木霉菌株Tu6 A tku70, A Trfogl為rfogl敲除菌株。并對120h發(fā)酵上清液的總蛋白濃度和濾紙酶活進(jìn)行了測定。具體測定方法如下I)考馬斯亮蘭法(Bradford法)測發(fā)酵液的蛋白濃度a. Bradford濃染液的配制將IOOmg考馬斯亮藍(lán)G-250溶于50m 195%乙醇,加入IOOml濃磷酸,然后,用蒸懼水補(bǔ)充至200ml。b.標(biāo)準(zhǔn)曲線蛋白質(zhì)樣本的準(zhǔn)備用牛血清清蛋白(BSA)，配制成I. 0mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)·蛋白質(zhì)溶液，并用去離子水稀釋成一系列梯度的蛋白質(zhì)溶液。c.按I :5用蒸餾水稀釋濃染料結(jié)合溶液，如出現(xiàn)沉淀，過濾除去。d.每個樣本加5ml稀釋的染料結(jié)合溶液，作用5min。染液與蛋白質(zhì)結(jié)合后，將由紅色變?yōu)樗{(lán)色，在595nm波長下測定其吸光度，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。e.用同樣的反應(yīng)體系對120h的發(fā)酵液上清進(jìn)行反應(yīng)，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出發(fā)酵液上清的總蛋白濃度。結(jié)果表明Trfogl敲除菌株的120h發(fā)酵上清液的總蛋白濃度為4. 42±0. 29mg/ml,明顯高于其出發(fā)株里氏木霉菌株Tu6 A tku70的總蛋白濃度，里氏木霉菌株Tu6 A tku70的120h發(fā)酵上清液的總蛋白濃度為3. 14±0. 23mg/ml。2)濾紙酶酶活測定采用Whatman I號濾紙，參照IUPAC標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行測定。取發(fā)酵上清液100 yl，加入到IOmL含0. 05%苯甲酸鈉的檸檬酸一梓檬酸鈉緩沖液(0. 05M、pH 4.8)中，得到稀釋101倍的酶液。將Whatman I號濾紙制成6cm長、Icm寬的形狀(50mg左右),折成4折,成M型。將濾紙條置于試管底部，加入含0. 05%苯甲酸鈉的檸檬酸一梓檬酸鈉緩沖液(0. 05M、pH4. 8) I. 5mL，50°C水浴平衡后，加入已經(jīng)稀釋的酶液0. 5mL (空白先不加)，混合均勻，使管內(nèi)溶液浸沒濾紙。50°C水浴保溫I小時，迅速冷卻。向各試管中加入3mL DNS試劑，再向空白中加酶液0. 5mL，混合均勻。在沸水中煮lOmin，迅速冷卻，用蒸餾水定容至25mL。以0號管為參比，測定540nm的吸光度。ImL液體酶，在50°C、pH 4. 8的條件下，每分鐘水解濾紙底物，產(chǎn)生Iumol還原糖(以葡萄糖計)所需要的酶量定義為一個國際單位濾紙酶活(FPU/ml)。結(jié)果表明Trfogl敲除菌株的120h發(fā)酵上清液的纖維素酶濾紙酶活為0. 41 ±0. 03FPU/ml,明顯高于其出發(fā)株里氏木霉菌株Tu6 A tku70的纖維素酶濾紙酶活(里氏木霉菌株Tu6 A tku70的120h發(fā)酵上清液的纖維素酶濾紙酶活為0. 29±0. 02FPU/ml)。
權(quán)利要求
1.Trfogl在調(diào)控里氏木霉(Trichoderma reesei)胞外蛋白分泌量中的應(yīng)用； 所述Trfogl是氨基酸序列如序列表中序列2所示的蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其特征在于所述調(diào)控里氏木霉(Trichodermareesei)胞外蛋白分泌量為調(diào)控纖維素酶分泌量。
3.制備重組里氏木霉菌的方法，包括敲除里氏木霉(Trichodermareesei)中的Trfogl基因得到所述重組里氏木霉菌的步驟，所述Trfogl是氨基酸序列如序列表中序列2所示的蛋白。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述方法中通過同源重組、隨機(jī)插入突變或RNAi敲除里氏木霉(Trichoderma reesei)中的Trfogl基因。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述同源重組中采用的上游同源臂的核苷酸序列為序列表中序列4的第10-1405位，所述同源重組中采用的下游同源臂的核苷酸序列為序列表中序列4的第3336-4920位。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述同源重組通過將序列表中序列4所示的DNA片段導(dǎo)入所述里氏木霉(Trichoderma reesei)實現(xiàn)。
7.由權(quán)利要求3-6中任一所述方法得到的重組里氏木霉菌。
8.用于敲除里氏木霉(Trichodermareesei)的Trfogl基因的物質(zhì)在提高里氏木霉(Trichoderma reesei)中胞外蛋白分泌量中的應(yīng)用，所述Trfogl是氨基酸序列如序列表中序列2所示的蛋白。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于所述用于敲除里氏木霉(Trichodermareesei)的Trfogl基因的物質(zhì)為權(quán)利要求10所述的生物材料。
10.下述任一種生物材料 1)用于敲除里氏木霉(Trichodermareesei)的Trfogl基因的DNA片段,含有Trfogl基因上游同源臂和Trfogl基因下游同源臂，所述Trfogl基因上游同源臂的核苷酸序列為序列表中序列4的第10-1405位，所述Trfogl基因下游同源臂的核苷酸序列為序列表中序列4的第3336-4920位；所述DNA片段具體為序列表中序列4所示的雙鏈DNA ； 2)含有步驟I)的DNA片段的重組載體； 3)含有步驟I)的DNA片段的重組細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明公開了里氏木霉的一個蛋白質(zhì)及其基因的用途。該用途為Trfog1在調(diào)控里氏木霉(Trichoderma reesei)胞外蛋白分泌量中的應(yīng)用；所述Trfog1是氨基酸序列如序列表中序列2所示的蛋白。本發(fā)明為構(gòu)建胞外蛋白分泌量增加的里氏木霉宿主菌和工程菌提供了技術(shù)基礎(chǔ)。
文檔編號C12N15/09GK102787108SQ201210264070
公開日2012年11月21日 申請日期2012年7月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月27日
發(fā)明者秦麗娜, 董志揚(yáng) 申請人:中國科學(xué)院微生物研究所