專利名稱：基于微流控芯片系統(tǒng)的模擬體內(nèi)流體剪切力細胞行為研究的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微流控芯片系統(tǒng)領(lǐng)域，具體涉及一種基于微流控芯片系統(tǒng)的模擬體內(nèi)流體剪切力細胞行為研究。
背景技術(shù)：
微流控芯片實驗室作為本世紀一項重要的科學(xué)技術(shù)已經(jīng)在包括生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、化學(xué)、材料學(xué)等多個領(lǐng)域展現(xiàn)了其獨特的優(yōu)勢，更因其同細胞尺寸匹配、環(huán)境同生理環(huán)境相近、傳熱傳質(zhì)快、通量高可以集成等特點而成為新一代細胞研究的重要平臺。隨著近二十年的不斷發(fā)展，基于微流控芯片系統(tǒng)的細胞研究已有很大突破，相關(guān)細胞操作，如細胞的培養(yǎng)、分選、鑒定等已基本都可在芯片上實現(xiàn)。以此為基礎(chǔ)更進一步的細胞學(xué)研究，特別是基于微流控芯片系統(tǒng)的細胞仿生微環(huán)境模擬等研究日益成為關(guān)注的焦點，在微流控芯片系統(tǒng)·上模擬甚至仿生細胞微環(huán)境用于研究細胞的相關(guān)行為，其關(guān)鍵點就是對細胞微環(huán)境進行精確模擬，這同時也是研究細胞與微環(huán)境相互作用的主要內(nèi)容。模擬細胞微環(huán)境，特別是模擬與細胞生物物理因素有關(guān)的諸如流體剪切力、牽張力、基質(zhì)物理性質(zhì)、納米表面等微環(huán)境依靠現(xiàn)有技術(shù)大多存在儀器設(shè)備復(fù)雜龐大，操作繁瑣，對微環(huán)境模擬簡單，不能實現(xiàn)對細胞的實時觀測等問題，而隨著微流控芯片研究的不斷深入，微流控芯片系統(tǒng)或可成為一種用以仿生模擬細胞微環(huán)境的新型平臺技術(shù)，并為同細胞微環(huán)境研究相關(guān)的組織修復(fù)、再造移植及生物仿生等方面提供技術(shù)與理論的支持。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種基于微流控芯片系統(tǒng)的模擬體內(nèi)流體剪切力細胞行為研究，該微流控芯片系統(tǒng)將細胞的接種、長期培養(yǎng)、細胞受流體剪切力刺激、細胞染色及分析檢測過程集成在一塊功能化芯片上完成，實現(xiàn)了在微流控芯片平臺上體內(nèi)極低流體剪切力的模擬及細胞行為分析。細胞及試劑消耗量低，操作簡便，易于檢測。本發(fā)明以外部精確流體注射泵為動力源，以微流控芯片軟刻蝕技術(shù)為基礎(chǔ)，利用流體阻力原理設(shè)計并制造微流體通道阻力網(wǎng)絡(luò)，致使微流控芯片細胞培養(yǎng)微室中的細胞可感受到不同大小的流體剪切力，進而研究細胞行為變化，該微流控芯片系統(tǒng)將細胞的接種、長期培養(yǎng)、細胞受流體剪切力刺激、細胞染色及分析檢測過程集成在一塊功能化芯片上完成，實現(xiàn)了在微流控芯片平臺上體內(nèi)極低流體剪切力的模擬及細胞行為分析。細胞及試劑消耗量低，操作簡便，易于檢測。本發(fā)明提供了一種微流控芯片系統(tǒng)，該系統(tǒng)由兩個基本單元構(gòu)成第一個基本單元為模擬體內(nèi)極低流體剪切力的細胞行為研究微流控芯片，第二個基本單元為模擬體內(nèi)極低流體剪切力的細胞行為研究微流控芯片外圍設(shè)備。本發(fā)明提供的微流控芯片系統(tǒng)，所述的模擬體內(nèi)極低流體剪切力的細胞行為研究微流控芯片是采用PDMS軟刻蝕及不可逆封接技術(shù)構(gòu)建的雙層微流控芯片。本發(fā)明提供的微流控芯片系統(tǒng)，所述的微流控芯片分為兩部分第一部分為微通道流體阻力網(wǎng)絡(luò)，包括一系列根據(jù)流體阻力原理設(shè)計的不同粗細、長度的微通道；第二部分為多個細胞培養(yǎng)微室，具體結(jié)構(gòu)如圖I所示，細胞培養(yǎng)微室中的細胞將感受流體阻力網(wǎng)絡(luò)形成的不同大小的極低流體剪切力，進而形成細胞響應(yīng)并被檢測。本發(fā)明提供的微流控芯片系統(tǒng)，所述的微通道流體阻力網(wǎng)絡(luò)中的微通道和細胞培養(yǎng)微室的尺寸為高度為10微米厘米，寬度為30微米厘米，橫截面樣式可為矩形、正方形、圓形、半圓形。本發(fā)明提供的微流控芯片系統(tǒng)，所述的微通道和細胞培養(yǎng)微室的數(shù)目各為I個 1000個。本發(fā)明提供的微流控芯片系統(tǒng)，所述細胞培養(yǎng)微室用于細胞培養(yǎng)可進行表面修飾(I)對于在細胞培養(yǎng)微室內(nèi)生存狀態(tài)良好的細胞可不進行表面修飾處理，直接接·種細胞；(2)對于細胞培養(yǎng)微室內(nèi)不易貼附或貼附后狀態(tài)不佳的細胞可對通道內(nèi)表面進行涂覆修飾，涂覆修飾的方法為直接在通道內(nèi)注入用于增加細胞貼附的試劑，待一定時間過后再進行細胞接種，該種試劑是明膠、白明膠、膠原I型、膠原II型、膠原VI型、層粘蛋白之一種或多種；(3)對于模擬微環(huán)境中有特殊要求的，涂覆修飾過程試劑中可添加細胞生長因子，如血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)、成纖維細胞生長因子(FGF)、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)之一種或多種。本發(fā)明提供的微流控芯片系統(tǒng)，所述的微流控芯片外圍設(shè)備是是模擬體內(nèi)極低流體剪切力的細胞行為研究微流控芯片實現(xiàn)各功能的外部支持及細胞行為分析的檢測裝置，主要包括精密注射泵、醫(yī)用注射器、醫(yī)用輸液器、聚苯乙烯管及熒光顯微鏡。本發(fā)明提供的微流控芯片系統(tǒng)，所述的精密注射泵可實現(xiàn)對流體的流速方向的精確控制，并可通過外圍管路引入微流控芯片通道內(nèi)，進而產(chǎn)生流體剪切力刺激。本發(fā)明還提供了基于所述的微流控芯片系統(tǒng)的模擬體內(nèi)流體剪切力細胞行為研究，以微流控芯片軟刻蝕技術(shù)為基礎(chǔ)，以外部精確流體注射泵為流體動力源，精確控制流體流量，利用流體阻力原理設(shè)計并制造微流體通道阻力網(wǎng)絡(luò)，致使流經(jīng)細胞培養(yǎng)微室中的流體產(chǎn)生一定大小的流體剪切力，細胞培養(yǎng)微室中的細胞感受到此流體剪切力，進而發(fā)生行為變化，經(jīng)由細胞染色及分析，實現(xiàn)了在微流控芯片平臺上流體剪切力的構(gòu)建及細胞行為分析。本發(fā)明提供的基于微流控芯片系統(tǒng)的模擬體內(nèi)流體剪切力細胞行為研究，該微流控芯片系統(tǒng)可用于模擬流體剪切力大小范圍為I. 0X10_9dyne/CnTldyne/Cm2的流體剪切力。本發(fā)明提供的模擬體內(nèi)極低流體剪切力的細胞行為研究微流控系統(tǒng)，能夠?qū)崿F(xiàn)間充質(zhì)干細胞的長期貼附培養(yǎng)，利用模擬的體內(nèi)極低流體剪切力可促使間充質(zhì)干細胞成骨分化及運動相關(guān)蛋白的表達，其結(jié)果如圖2、3所示。在該系統(tǒng)上對間充質(zhì)干細胞進行成骨分化機制研究，發(fā)現(xiàn)該種極低流體剪切力可通過干預(yù)細胞的骨架蛋白進而促進其成骨分化。如圖4分別所示。本發(fā)明提供的模擬體內(nèi)極低流體剪切力的細胞行為研究微流控系統(tǒng)，其間充質(zhì)干細胞的相關(guān)檢測方法為(I)成骨分化檢測方法堿性磷酸酯酶ALP染色，骨橋蛋白OPN染色。(2)細胞骨架蛋白檢測方法細胞骨架纖維蛋白F-actin染色。本發(fā)明提供的用于模擬體內(nèi)極低流體剪切力的細胞行為研究微流控系統(tǒng)，操作簡便，試劑及細胞消耗量低，易于對細胞進行觀察檢測，是一種用于仿生模擬細胞微環(huán)境的新型平臺技術(shù)。


圖I模擬體內(nèi)極低流體剪切力的細胞行為研究微流控芯片結(jié)構(gòu)圖，其中I為微通道流體阻力網(wǎng)絡(luò)，2為細胞培養(yǎng)微室；
·
圖2間充質(zhì)干細胞受極低流體剪切力刺激下成骨分化結(jié)果圖；圖3間充質(zhì)干細胞受極低流體剪切力刺激下運動行為實時照片；圖4間充質(zhì)干細胞通過ROCK途徑感受極低流體剪切力刺激的機制示意圖；圖5骨祖細胞受極低流體剪切力刺激下的細胞形態(tài)；圖6軟骨細胞受極低流體剪切力刺激下的細胞形態(tài)。
具體實施例方式下面的實施例將對本發(fā)明予以進一步的說明，但并不因此而限制本發(fā)明。制備模擬體內(nèi)極低流體剪切力的細胞行為研究微流控芯片的材料為PDMS聚合物，等離子體不可逆封接。制備后的芯片通道加水高壓滅菌，再置于無菌工作臺內(nèi)晾干。以小鼠胚胎間充質(zhì)干細胞為例，芯片液路通道無需涂敷，依次用75%乙醇、無菌二次水、PBS、含胎牛血清15%的a -MEM培養(yǎng)基潤洗并保證通道內(nèi)無氣泡殘留。小鼠胚胎間充質(zhì)干細胞在無菌一次性培養(yǎng)瓶中傳代培養(yǎng)，實驗時用胰酶消化，調(diào)節(jié)合適密度從細胞加樣口用移液槍注射入細胞培養(yǎng)微室內(nèi)，待24小時細胞完全貼壁后替換新鮮培養(yǎng)劑。若進行化學(xué)誘導(dǎo)劑同力學(xué)刺激共同作用的實驗，則24小時之后替換誘導(dǎo)分化培養(yǎng)劑，成骨采用LG-DMEM+10%FBS+0. I μ M地塞米松+50 μ g/ml抗壞血酸+IOOmM β -甘油磷酸鈉。調(diào)整精確注射泵的流量，使達到極低流體剪切力的范圍，方式為持續(xù)灌流，灌流24小時之后可考察其運動行為，灌流7天之后可考察成骨堿性磷酸酶ALP的分泌，灌流14天之后可考察其骨橋蛋白OPN的情況。染色步驟為用PBS替換芯片通道內(nèi)的培養(yǎng)基，并洗滌3次，用多聚甲醛固定細胞20分鐘，PBS沖洗3次。成骨堿性磷酸酯酶ALP染色為細胞固定之后用PBS沖洗，換用Tris緩沖液沖洗，在通道內(nèi)加入現(xiàn)配的ALP染色液，15分鐘之后用Tris沖洗3次拍照，計算堿性磷酸酯酶(藍色)的光強度用以表征成骨分化的強弱。空白組為不施加力學(xué)刺激的情況。其他染色為熒光免疫方法染色，使用對應(yīng)抗體即可。實施例I利用實驗室自行設(shè)計并制作的微流控芯片系統(tǒng)，構(gòu)型如圖I所示，通道尺寸深度為50 μ m，寬度為50 μ m到Imm不等，共可產(chǎn)生4個不同大小的流體剪切力，在注射泵流速為9 μ L/h的情況下，流體剪切力理論計算后分別為7. 7X 10_3，9. 9X 10_4，I. 4X 10_4and2. 9X10_5dyne/Cm2。芯片接種小鼠胚胎間充質(zhì)干細胞，接種密度I X IO5個/ML，24小時細胞貼壁之后換用含胎牛血清15%的a -MEM培養(yǎng)基，施加流體剪切力，7天之后成骨ALP染色，顯微鏡拍照，Image Pro軟件分析。其結(jié)果如圖3所示,在不同大小的流體剪切力作用下間充質(zhì)干細胞的成骨分化行為有所差別，可以看出來的是7. 7X10-3dyne/cm2的流體剪切力作用下成骨最強，且14天之后OPN表達為陽性。實施例2利用實驗室自行設(shè)計并制作的微流控芯片系統(tǒng)，構(gòu)型如圖I所示，通道尺寸深度為50 μ m，寬度為50 μ m到Imm不等，共可產(chǎn)生4個不同大小的流體剪切力，在注射泵流速為9 μ L/h的情況下，流體剪切力理論計算后分別為7. 7X 10_3，9. 9X 10_4，I. 4X 10_4and2. 9X10_5dyne/Cm2。芯片接種小鼠胚胎間充質(zhì)干細胞，接種密度I X IO5個/ML，24小時細胞貼壁之后換用LG-DMEM+10%FBS+0. I μ M地塞米松+50 μ g/ml抗壞血酸+IOOmM β -甘油磷酸鈉成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基，施加流體剪切力，7天之后成骨ALP染色，14天之后成骨OPN染色，顯微鏡拍照，Image Pro軟件分析。在不同大小的流體剪切力作用下間充質(zhì)干細胞的成骨分化行為有所差別，可以看出來的是7. 7X 10_3dyne/Cm2的流體剪切力作用下成骨ALP和OPN表達最強?！嵤├?骨祖細胞利用實驗室自行設(shè)計并制作的微流控芯片系統(tǒng)，其流體剪切力范圍為7. 7 X ΙΟ-3, 9. 9X 10_4，I. 4X l(T4and2. 9X l(T5dyne/cm2。芯片接種骨祖細胞系細胞 3T3-E1，接種密度I X IO5個/ML，24小時細胞貼壁之后，每天換液，并施加流體剪切力刺激，力學(xué)刺激7天之后檢測成骨特征性標志物ALP，發(fā)現(xiàn)流體剪切力可促進骨祖細胞向成骨方向分化。實施例4軟骨細胞利用實驗室自行設(shè)計并制作的微流控芯片系統(tǒng)，通道尺寸深度為100 μ m，寬度為ΙΟΟμ 到2mm不等，其流體剪切力范圍為O. 5,0. 1,0. 02,0. 001 dyne/cm2 芯片接種大鼠軟骨細胞，接種密度I X IO5個/ML，24小時細胞貼壁之后，每天換液，并施加流體剪切力刺激，力學(xué)刺激3天之后可檢測軟骨特征性標志物一型膠原、二型膠原、蛋白多糖，發(fā)現(xiàn)流體剪切力可維持軟骨細胞的表型。
權(quán)利要求
1.一種微流控芯片系統(tǒng)，其特征在于該系統(tǒng)由兩個基本單元構(gòu)成第一個基本單元為模擬體內(nèi)極低流體剪切力的細胞行為研究微流控芯片，第二個基本單元為模擬體內(nèi)極低流體剪切力的細胞行為研究微流控芯片外圍設(shè)備。
2.按照權(quán)利要求I所述的微流控芯片系統(tǒng)，其特征在于所述的模擬體內(nèi)極低流體剪切力的細胞行為研究微流控芯片是采用PDMS軟刻蝕及不可逆封接技術(shù)構(gòu)建的雙層微流控-H-* I I心/T O
3.按照權(quán)利要求I或2所述的微流控芯片系統(tǒng)，其特征在于所述的微流控芯片分為兩部分第一部分為微通道流體阻力網(wǎng)絡(luò)，由微通道組成；第二部分為細胞培養(yǎng)微室。
4.按照權(quán)利要求3所述的微流控芯片系統(tǒng)，其特征在于所述的微通道流體阻力網(wǎng)絡(luò)中的微通道和細胞培養(yǎng)微室的尺寸為高度為10微米 I厘米，寬度為30微米 I厘米，橫截面樣式可為矩形、正方形、圓形、半圓形。
5.按照權(quán)利要求3所述的微流控芯片系統(tǒng)，其特征在于所述的微通道和細胞培養(yǎng)微室的數(shù)目各為I個 1000個。
6.按照權(quán)利要求I所述的微流控芯片系統(tǒng)，其特征在于所述的微流控芯片外圍設(shè)備是是模擬體內(nèi)極低流體剪切力的細胞行為研究微流控芯片實現(xiàn)各功能的外部支持及細胞行為分析的檢測裝置，主要包括精密注射泵、醫(yī)用注射器、醫(yī)用輸液器、聚苯乙烯管和熒光顯微鏡。
7.按照權(quán)利要求6所述的微流控芯片系統(tǒng)，其特征在于所述的精密注射泵可實現(xiàn)對流體的流速方向的精確控制，并可通過外圍管路引入微流控芯片通道內(nèi)，進而產(chǎn)生流體剪切力刺激。
8.基于權(quán)利要求I所述的微流控芯片系統(tǒng)的模擬體內(nèi)流體剪切力細胞行為研究，其特征在于以微流控芯片軟刻蝕技術(shù)為基礎(chǔ)，以外部精確流體注射泵為流體動力源，精確控制流體流量，利用流體阻力原理設(shè)計并制造微流體通道阻力網(wǎng)絡(luò)，致使流經(jīng)細胞培養(yǎng)微室中的流體產(chǎn)生一定大小的流體剪切力，細胞培養(yǎng)微室中的細胞感受到此流體剪切力，進而發(fā)生行為變化，經(jīng)由細胞染色及分析，實現(xiàn)了在微流控芯片平臺上流體剪切力的構(gòu)建及細胞行為分析。
9.按照權(quán)利要求8所述的基于微流控芯片系統(tǒng)的模擬體內(nèi)流體剪切力細胞行為研究，其特征在于所述的流體剪切力大小范圍為I. OX 10_9dyne/cm2 ldyne/cm2。
全文摘要
一種基于微流控芯片系統(tǒng)的模擬體內(nèi)流體剪切力細胞行為研究，以外部精確流體注射泵為動力源，以微流控芯片軟刻蝕技術(shù)為基礎(chǔ)，利用流體阻力原理設(shè)計并制造微流體通道阻力網(wǎng)絡(luò)，致使微流控芯片細胞培養(yǎng)微室中的細胞可感受到不同大小的流體剪切力，進而研究細胞行為變化，該微流控芯片系統(tǒng)將細胞的接種、長期培養(yǎng)、細胞受流體剪切力刺激、細胞染色及分析檢測過程集成在一塊功能化芯片上完成，實現(xiàn)了在微流控芯片平臺上體內(nèi)極低流體剪切力的模擬及細胞行為分析。
文檔編號C12M1/34GK102787071SQ20121026472
公開日2012年11月21日 申請日期2012年7月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月27日
發(fā)明者秦建華, 高興華 申請人:中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所