專利名稱：志賀菌分離、鑒定的試劑盒、制備和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是針對(duì)腸道病原菌中志賀菌屬的試劑盒和使用方法，特別涉及志賀菌屬(包括A群痢疾志賀、B群福氏志賀、C群鮑氏志賀、D群宋內(nèi)志賀)的同步分離和鑒定試劑盒、制備和應(yīng)用，利用選擇性分離培養(yǎng)基對(duì)應(yīng)生長(zhǎng)的典型菌落形態(tài)、簡(jiǎn)易生化和特異性酶-底物反應(yīng)組合試驗(yàn)鑒定所有志賀菌。
背景技術(shù)：
志賀菌屬目前分4個(gè)群，常見(jiàn)的為福氏志賀菌和宋內(nèi)志賀菌，由于其在遺傳學(xué)、生物學(xué)特征上和諸多腸桿菌科內(nèi)的多數(shù)非病原菌或 條件病原菌存在生物學(xué)和遺傳學(xué)相似性導(dǎo)致許多實(shí)驗(yàn)室在實(shí)際工作中無(wú)法通過(guò)簡(jiǎn)單的微生物常規(guī)分離方法達(dá)到分離到所有志賀菌的預(yù)期效果；其次，從不同技術(shù)屬性和分工的實(shí)驗(yàn)室能力要求角度考量，存在對(duì)志賀菌屬(包括A群痢疾志賀、B群福氏志賀、C群鮑氏志賀、D群宋內(nèi)志賀)在不同檢材中分離的技術(shù)要求和方法的敏感性要求。中國(guó)專利申請(qǐng)201010550372. 3公開(kāi)了“沙門菌和志賀菌同步分離、鑒定的試劑盒、制備和應(yīng)用”，具體說(shuō)是一種對(duì)沙門菌和志賀菌同時(shí)進(jìn)行分離、檢測(cè)和鑒定的程序，可應(yīng)用于食品和其它糞便類樣品中沙門菌和志賀菌的同步檢測(cè)。但是該方法篩選病原菌的檢測(cè)流程還存在一定局限性，無(wú)法滿足不同類型實(shí)驗(yàn)室的專業(yè)實(shí)驗(yàn)室的特殊的技術(shù)要求；在處理不同類型的標(biāo)本上沒(méi)有使實(shí)驗(yàn)室的材料與方法的績(jī)效比達(dá)到預(yù)期效果。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種一次可同步分離A-D群志賀菌并利用生化和酶反應(yīng)試驗(yàn)鑒定的試劑盒、制備和應(yīng)用。主要解決現(xiàn)有志賀菌分離方法存在的漏檢率高、鑒定步驟繁復(fù)且成本較高、篩選結(jié)果不夠直觀的技術(shù)難題。本發(fā)明適用不同類型實(shí)驗(yàn)室(臨床實(shí)驗(yàn)室和公共衛(wèi)生實(shí)驗(yàn)室)對(duì)不同類型標(biāo)本選擇不同的檢測(cè)流程，通過(guò)對(duì)標(biāo)本有效增菌的預(yù)處理或直接專一性分離平板配合簡(jiǎn)單的糖生化發(fā)酵反應(yīng)模式和細(xì)菌特異性酶-底物反應(yīng)特征建立一套行之有效的分離和特異性鑒別試驗(yàn)，達(dá)到對(duì)A-D群志賀菌同步篩選分離和簡(jiǎn)易鑒定的效果。本發(fā)明的技術(shù)方案為志賀菌分離、鑒定的試劑盒試劑盒，包括
I、通用型非選擇性增菌液胰酪胨大豆胨肉湯(TSB)。成分胰化酪蛋白胨17.0g，植物蛋白胨3. Og,氯化鈉5. Og, K2HPO4 2. 5g,葡萄糖2. 5g,蒸懼水1000ml,加熱溶解后矯正pH至7·3±0·2 (按冷卻至25°C后測(cè)量值為標(biāo)準(zhǔn))。經(jīng)15磅壓力15分鐘(121°C )滅菌后分裝225mL/瓶備用。2、10倍濃縮通用型非選擇性增菌液胰酪胨大豆胨肉湯(TSB)。成分胰化酪蛋白胨17. Og,植物蛋白胨3. Og,氯化鈉5. Og, K2HPO4 2. 5g,葡萄糖2. 5g,蒸懼水100ml,加熱溶解后矯正pH至7. 3±0. 2 (按冷卻至25°C后測(cè)量值為標(biāo)準(zhǔn))。經(jīng)15磅壓力15分鐘(121°C)滅菌后分裝IOmL/瓶備用。3、志賀菌增菌液胰化酪蛋白胨20. 0g，氯化鈉5. Og, K2HPO4 2. Og, KH2PO4 2. Og,葡萄糖l.Og，吐溫-80 I. 5ml，蒸餾水1000ml，15磅壓力15分鐘，121 °C滅菌，新生霉素50mg (分裝前加入)，ρΗ7. 0±0· 2,分裝9mL/無(wú)菌試管備用。4、液體石蠟油商品化化學(xué)純礦物油或液體石蠟油分裝12ml/管，置65°C烘烤滅菌2h備用，用以營(yíng)造相對(duì)厭氧的環(huán)境有利志賀菌的增殖。5、木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂平板(XLD):成分瓊脂13. 5g，乳糖7. 5g，蔗糖
7.5g,硫代硫酸鈉6. 8g, L-賴氨酸5. Og,氯化鈉5. Og,木糖3. 5g,酵母浸出物3. Og,脫氧膽酸鈉2. 5g，枸櫞酸鐵銨O. 8g，酚紅O. 08g，蒸餾水1000ml，加熱溶解后矯正pH至7. 5±0· 2(按冷卻至25°C后測(cè)量值為標(biāo)準(zhǔn))。經(jīng)15磅壓力15分鐘(121°C)滅菌后傾注無(wú)菌平皿置冰箱中，備用。
6、酶顯色瓊脂平板成分瓊脂17. 0g，胰化酪蛋白胨lO.Og，蛋白胨10. 0g，酵母浸出物3. Og,氯化鈉5. Og, 5-溴-4-氯-3-吲哚-β -D-吡喃半乳糖苷250mg,辛酸鹽250mg,磺胺抑制劑0. 5g,蒸懼水1000ml。酶顯色瓊脂平板配方的配制取瓊脂粉5g、胰蛋白胨10g、蛋白胨10g、酵母粉3g、氯化鈉5g置990ml蒸餾水中加熱溶解煮沸2次后，稱取5-溴-4-氯-3-吲哚-β -D-吡喃半乳糖苷250mg溶解于5mlTri. HCl (ρΗ8· 0)，稱取辛酸鹽250mg溶解于5ml蒸餾水中，待加熱培養(yǎng)基冷卻至50°C—并加入酶底物溶液后混勻，調(diào)整pH至7.2 (按冷卻至25°C后測(cè)量值為標(biāo)準(zhǔn))。傾注無(wú)菌平板置冰箱中，備用。7、志賀菌生化鑒定管配方
第一管成分瓊脂14. Og,牛肉膏2. Og,酵母浸出物2. Og,葡萄糖I. Og,蛋白胨15. Og,甘露醇10. Og,尿素10. Og,重量百分濃度為0. 2%麝香草酚藍(lán)溶液10ml，重量百分濃度為
0.2%溴麝香草酚藍(lán)溶液12. 5ml，重量百分濃度為0. 2%甲酚紅溶液4ml，蒸餾水1000ml ； 第一管配制
I)、取瓊脂14. 0g、牛肉膏2. Og及蒸餾水1000ml，混合后加熱溶解，并用數(shù)層紗布過(guò)濾。2)、再取酵母浸出粉2. 0g、葡萄糖I. 0g、蛋白胨15. 0g、甘露醇10. Og及尿素
10.0g，混入已溶解的瓊脂中。充分搖勻，使全部溶解。再加入重量百分濃度為15%氫氧化鈉約I. 5ml，矯正pH至7. I (按冷卻至25°C后測(cè)量值為標(biāo)準(zhǔn))。3)、然后加入指示劑重量百分濃度為0. 2%溴麝香草酚藍(lán)溶液12. 5ml、重量百分濃度為0. 2%甲酚紅溶液4ml、重量百分濃度為0. 2%麝香草酚藍(lán)溶液10ml。4)、混合后,充分搖勻。分裝于13X IOOmm的試管內(nèi)，每管約3ml。5)、置高壓滅菌器內(nèi)，經(jīng)10磅壓力10分鐘的滅菌。6)、滅囷后,制成斜面,底部宜厚。待凝固后，直于冰箱中，備用。表I指示劑所需量及其配制
指示劑名稱 I所需重量I加N/20氫氧化鈉溶液I蒸餾水量I敏感范圍(pH) I色澤改變(酸一堿)
溴麝香草酉分藍(lán) O- 2g 6. 4ml_93. 6ml 6. Q-7. 6_黃一藍(lán)_
甲酚紅10.6ml89.4ml~ 7.2-8.8黃一紅
麝香草g分藍(lán) |o.2g |8.6ml|91.4ml |l. 2-2.8I紅一黃—
第二管成分瓊脂3. 0g，胰化酪蛋白胨10. 0g，蛋白胨10. 0g，氯化鈉5. 0g，重量百分濃度為10%Na2HP042. 5ml，蔗糖10. 0g，重量百分濃度為1%硫代硫酸鈉溶液2. 5ml，重量百分濃度為0. 2%溴麝香草酚藍(lán)溶液5ml，蒸餾水1000ml。第二管的配制
I)、取瓊脂3. 0g，加入IOOOrnl的蒸餾水中，加熱溶解，并用數(shù)層紗布過(guò)濾。
2)、再取胰化酪蛋白胨lO.Og、蛋白胨lO.Og、氯化鈉5. Og、重量百分濃度為10%Na2HP042. 5ml、蔗糖10. Og及硫代硫酸鈉溶液2. 5ml，混合后，加入已溶解的瓊脂中，充分搖勻，使全部溶解，再加入重量百分濃度為15%氫氧化鈉溶液約I. 5ml左右，矯正pH至7. 6(按冷卻至25°C后測(cè)量值為標(biāo)準(zhǔn))。3)、溴麝香草酚藍(lán)的配制取溴麝香草酚藍(lán)0. 2g、N/10氫氧化鈉溶液5ml及蒸餾水95ml,混合后，放在掠色瓶中，備用。4)、加重量百分濃度為0. 2%溴磨香草酹藍(lán)5ml。充分搖勻，分裝于13X IOOmm的試管內(nèi)，每管約3ml。5)、置高壓滅菌器內(nèi)，經(jīng)10磅壓力10分鐘的滅菌，取出后，置于冰箱中，備用。8、硫化氫濾紙條硫化氫濾紙條的制備選取細(xì)薄的濾紙剪成3X 50mm的長(zhǎng)條，浸在飽和的醋酸鉛溶液中(重量百分濃度為35%醋酸鉛飽和)，取出后放于平皿中，置56°C烘箱中約3h，烤干備用。如硫化氫陽(yáng)性，此紙條在試管內(nèi)懸掛末端顯黑色。
9、吲哚濾紙條Π引哚濾紙條的制備濾紙條(同上述大小)浸于對(duì)一二甲氨基苯甲醒5. 0g、甲醇50ml、磷酸IOml的混合液中，取出后放于平皿中，置56°C烘箱中約4h,稍微烤干即取出，保存室溫內(nèi)備用。此紙條經(jīng)對(duì)一二甲氨基苯甲醛染成淡黃色，如靛基質(zhì)陽(yáng)性，此紙條在試管內(nèi)懸掛末端顯紅色。志賀菌分離、鑒定的試劑盒使用方法
I、標(biāo)本采集和處理
I)、糞便挑取糞便標(biāo)本直接接種木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂平板，36°c培養(yǎng)18h-24h觀察菌落生長(zhǎng)結(jié)果；若有典型菌落生長(zhǎng)者分別挑選2-3個(gè)單個(gè)菌落同時(shí)于接種志賀菌生化鑒定管和酶顯色瓊脂平板，36°C培養(yǎng)18h-24h觀察，判斷依據(jù)見(jiàn)表2 :
表2簡(jiǎn)易生化和特異性酶-底物反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果
權(quán)利要求
1.志賀菌同步分離、鑒定的試劑盒，包括通用型非選擇性增菌液、10倍濃縮通用型非選擇性增菌液、志賀菌增菌液、木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂平板、酶顯色瓊脂平板、志賀菌生化鑒定管、硫化氫濾紙條和吲哚濾紙條，其特征是還包括液體石蠟油。
2.權(quán)利要求I所述志賀菌同步分離、鑒定的試劑盒制備方法，首先包括通用型非選擇性增菌液、10倍濃縮通用型非選擇性增菌液、志賀菌增菌液、木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂平板、酶顯色瓊脂平板、志賀菌生化鑒定管、硫化氫濾紙條和吲哚濾紙條制備，其特征是還包括使用液體石蠟油營(yíng)造相對(duì)厭氧的環(huán)境有利志賀菌的增殖步驟液體石蠟油商品化化學(xué)純礦物油或液體石蠟油分裝12ml/管，置65°C烘烤滅菌2h備用。
3.權(quán)利要求I所述試劑盒在水中志賀菌同步分離、鑒定中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求I所述試劑盒在食品中志賀菌同步分離、鑒定中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明是針對(duì)腸道病原菌中志賀菌屬的試劑盒和使用方法，主要解決現(xiàn)有志賀菌分離方法存在的漏檢率高、鑒定步驟繁復(fù)且成本較高、篩選結(jié)果不夠直觀的技術(shù)難題。本發(fā)明試劑盒包括通用型非選擇性增菌液、10倍濃縮通用型非選擇性增菌液、志賀菌增菌液、木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂平板、酶顯色瓊脂平板、志賀菌生化鑒定管、硫化氫濾紙條和吲哚濾紙條，其特征是還包括液體石蠟油。利用選擇性分離培養(yǎng)基對(duì)應(yīng)生長(zhǎng)的典型菌落形態(tài)、簡(jiǎn)易生化和特異性酶-底物反應(yīng)組合試驗(yàn)鑒定所有志賀菌。
文檔編號(hào)C12R1/01GK102816828SQ20121026844
公開(kāi)日2012年12月12日 申請(qǐng)日期2012年8月1日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月1日
發(fā)明者許學(xué)斌, 袁政安, 金匯明 申請(qǐng)人:上海市疾病預(yù)防控制中心