專利名稱：一種培養(yǎng)基及其應(yīng)用與賴氨酸搖瓶發(fā)酵方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種特別適用于賴氨酸搖瓶發(fā)酵的培養(yǎng)基及其在賴氨酸搖瓶發(fā)酵中的應(yīng)用以及使用該培養(yǎng)基進(jìn)行賴氨酸搖瓶發(fā)酵的方法。
背景技術(shù)：
在賴氨酸發(fā)酵過程中，隨著營養(yǎng)物質(zhì)的消耗，發(fā)酵液pH值會(huì)不斷下降，因此需要定時(shí)添加氨水或液氨來控制PH值以保證菌種的正常生長代謝，獲得高含量的賴氨酸。尤其在進(jìn)行賴氨酸的搖瓶發(fā)酵以獲得賴氨酸產(chǎn)量高的菌株時(shí)，目前一般通過人工定時(shí)取樣檢測pH值并滴加氨水或液氨來調(diào)節(jié)pH值。但是人工調(diào)節(jié)pH值不好把握分寸，每次添加氨水或液氨至少需要進(jìn)行2次pH值的測定，調(diào)節(jié)PH值耗費(fèi)的時(shí)間較長且很容易添加過量，從而影響發(fā)酵結(jié)果。而且頻繁取樣檢測會(huì)加大染菌的幾率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種培養(yǎng)基及其在賴氨酸搖瓶發(fā)酵中的應(yīng)用以及使用該培養(yǎng)基進(jìn)行賴氨酸搖瓶發(fā)酵的方法。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，一方面，本發(fā)明提供一種培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基含有碳源、氮源、無機(jī)鹽和水，其特征在于，該培養(yǎng)基還含有指示劑，所述指示劑的變色pH范圍為5. 5-8。另一方面,本發(fā)明提供一種上述培養(yǎng)基在賴氨酸搖瓶發(fā)酵中的應(yīng)用。再一方面，本發(fā)明提供一種賴氨酸搖瓶發(fā)酵方法，該方法包括將賴氨酸發(fā)酵菌種接種到培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，其特征在于，所述培養(yǎng)基為上述培養(yǎng)基。通過上述技術(shù)方案，操作人員不需要進(jìn)行取樣檢測pH值即可以直接根據(jù)培養(yǎng)基的顏色變化確定補(bǔ)加氨水或液氨的時(shí)間和加量，簡化了發(fā)酵操作過程，縮短了調(diào)節(jié)pH值耗費(fèi)的時(shí)間，降低了操作人員的勞動(dòng)強(qiáng)度，進(jìn)而降低了染菌幾率。另外，添加的指示劑不會(huì)對發(fā)酵產(chǎn)生負(fù)面影響。因此，使用本發(fā)明的培養(yǎng)基進(jìn)行賴氨酸搖瓶發(fā)酵時(shí)，發(fā)酵的穩(wěn)定性明顯增強(qiáng)。本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點(diǎn)將在隨后的具體實(shí)施方式
部分予以詳細(xì)說明。
具體實(shí)施例方式以下對本發(fā)明的具體實(shí)施方式
進(jìn)行詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解的是，此處所描述的具體實(shí)施方式
僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。本發(fā)明中，術(shù)語“波美度”是表示溶液濃度的一種方法，是通過波美比重計(jì)檢測溶液得到的度數(shù)；“發(fā)酵液”是指接種了微生物菌種的液體發(fā)酵培養(yǎng)基，經(jīng)過一段時(shí)間的培養(yǎng)后所得產(chǎn)物；“指示劑的變色pH范圍”指的是指示劑的變色pH點(diǎn)所在的范圍。本發(fā)明的培養(yǎng)基含有碳源、氮源、無機(jī)鹽和水，其特征在于，該培養(yǎng)基還含有指示齊U，所述指示劑的變色pH范圍為5. 5-8。
本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的是指示劑一般以溶液的形式使用，可以直接商購獲得，也可以購買粉末狀產(chǎn)品再配制成溶液使用，且配制時(shí)使用的溶劑和配制方法為常規(guī)試劑與方法，例如，中性紅一般以0. 1-0. 3重量％濃度的溶液形式使用，配制方法包括先將0. 1-0. 3克中性紅溶于60ml濃度為100%的乙醇中，再加水至100ml。根據(jù)本發(fā)明，相對于每升培養(yǎng)基，所述指示劑的添加量優(yōu)選為0. 002-0. 012克。當(dāng)指示劑的添加量在上述優(yōu)選范圍內(nèi)時(shí)，顯色明顯且不會(huì)對賴氨酸發(fā)酵產(chǎn)生影響。需要說明的是，本發(fā)明中，指示劑的添加量以指示劑的干重計(jì)，即當(dāng)所述指示劑以溶液形式使用時(shí)，指示劑的添加量不包括其中溶劑的量。根據(jù)本發(fā)明，只要所述指示劑的變色pH范圍在上述范圍內(nèi)即可實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目 的，優(yōu)選地，所述指示劑的變色pH范圍為6. 5-8。優(yōu)選地，所述指示劑為中性紅、溴百里酚藍(lán)、酚紅、苯酚紅和石蕊中的一種。根據(jù)本發(fā)明，所述培養(yǎng)基可以作為種子培養(yǎng)基，也可以作為發(fā)酵培養(yǎng)基，所述種子培養(yǎng)基與發(fā)酵培養(yǎng)基可以相同或不同。根據(jù)本發(fā)明，只要往培養(yǎng)基中添加指示劑即可實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，對培養(yǎng)基的其他成分(碳源、氮源和無機(jī)鹽)無特殊要求，可以采用本領(lǐng)域常規(guī)使用的物質(zhì)，例如，可以用淀粉質(zhì)原料糖化清液、玉米漿、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硫酸銨、蘇氨酸和蛋氨酸等配制種子培養(yǎng)基。根據(jù)本發(fā)明，每升種子培養(yǎng)基中各原料的用量可以在很大范圍內(nèi)改變，優(yōu)選情況下，相對于每升種子培養(yǎng)基，淀粉質(zhì)原料糖化清液的用量可以為30-40克，玉米漿(干重為20-50重量％)的用量可以為70-90克，磷酸氫二鉀的用量可以為0. 5-1. 5克，硫酸鎂的用量可以為0. 4-1. I克,硫酸銨的用量可以為5-15克,蘇氨酸的用量可以為0. 1-0. 6克,蛋氨酸的用量可以為0. 1-0. 3克?？梢杂玫矸圪|(zhì)原料糖化清液、糖蜜、玉米漿、硫酸銨、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、蘇氨酸、蛋氨酸和谷氨酸等配制發(fā)酵培養(yǎng)基。根據(jù)本發(fā)明，每升發(fā)酵培養(yǎng)基中各原料的用量可以在很大范圍內(nèi)改變，優(yōu)選情況下，相對于每升發(fā)酵培養(yǎng)基，淀粉質(zhì)原料糖化清液的用量可以為40-60克，糖蜜的用量可以為30-50克，玉米漿(干重為20-50重量％)的用量可以為20-40克，硫酸銨的用量可以為20-40克，磷酸氫二鉀的用量可以為0. 5-1. 5克，硫酸鎂的用量可以為0. 4-0. 6克,蘇氨酸的用量可以為0. 1-0. 3克,蛋氨酸的用量可以為0. 1-0. 3克,谷氨酸的用量可以為0. 2-0. 4克。所述淀粉質(zhì)原料糖化清液既可以采用干法制糖工藝制備，也可以采用濕法制糖工藝制備。從工藝簡單、設(shè)備投資少，生產(chǎn)成本較低的方面考慮，優(yōu)選通過干法制糖工藝制備。干法制糖工藝是指淀粉質(zhì)原料不經(jīng)浸泡直接進(jìn)行破碎和酶解。干法制糖工藝可以包括將淀粉質(zhì)原料粉碎，將淀粉質(zhì)原料粉碎后的產(chǎn)物調(diào)漿，并加入淀粉酶對淀粉進(jìn)行第一次水解；對第一次水解產(chǎn)物進(jìn)行固液分離，并在得到的液相組分中加入糖化酶進(jìn)行第二次水解，得到淀粉質(zhì)原料糖化清液。其中，所述調(diào)漿的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，優(yōu)選地，調(diào)漿的方法可以包括將淀粉質(zhì)原料粉碎后的產(chǎn)物加入到水中混合均勻，水的加入量使得到的漿液的波美度可以為9-17B6。；所述淀粉質(zhì)原料可以為本領(lǐng)域公知的各種可以用于酶解、發(fā)酵制備賴氨酸的含有淀粉的原料，例如，可以為選自玉米、薯類(如木薯)和小麥中的一種或幾種。本發(fā)明中，所述淀粉質(zhì)原料糖化清液中的葡萄糖含量為96-98重量％。上述種子培養(yǎng)基或發(fā)酵培養(yǎng)基中，所述淀粉質(zhì)原料糖化清液可以由葡萄糖代替，相對于每升種子培養(yǎng)基，葡萄糖的添加量為28-39. 5克；相對于每升發(fā)酵培養(yǎng)基，葡萄糖的添加量為38-60克。本發(fā)明還提供一種上述的培養(yǎng)基在賴氨酸搖瓶發(fā)酵中的應(yīng)用。本發(fā)明的賴氨酸搖瓶發(fā)酵方法包括將賴氨酸發(fā)酵菌種接種到培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，其特征在于，所述培養(yǎng)基為上述的培養(yǎng)基。本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，隨著發(fā)酵過程中硫酸銨等營養(yǎng)物質(zhì)的消耗，發(fā)酵液的pH值逐漸下降，當(dāng)PH值降至5. 4時(shí)，菌種代謝活動(dòng)基本停止且不再產(chǎn)酸，但只要在pH降至5. 4后的3h內(nèi)將發(fā)酵液的pH值調(diào)節(jié)到6. 8-7. 4，菌種又可以基本恢復(fù)產(chǎn)酸能力。因此，選用變色PH范圍為5. 5-8的指示劑即可實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，優(yōu)選情況下，選用變色pH范圍為6. 5-8的指示劑。

本發(fā)明中，所述賴氨酸發(fā)酵菌種可以為本領(lǐng)域常規(guī)使用的賴氨酸發(fā)酵菌種，例如可以為谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)、大腸桿菌(Escherichia Coli)和黃色短桿菌(Brevibacterium fIavum)中的至少一種。本發(fā)明中，對所述賴氨酸搖瓶發(fā)酵的條件沒有特殊限定，優(yōu)選情況下，所述發(fā)酵的條件包括溫度為30-38°C，pH值為6. 8-7. 4，時(shí)間為28_36h，搖床的轉(zhuǎn)速為180_210rpm。本發(fā)明中，在搖瓶發(fā)酵過程中，可以通過添加氨水和/或液氨的方式調(diào)節(jié)pH值為6. 8-7. 4。本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，使用上述發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行賴氨酸搖瓶發(fā)酵時(shí)，每2小時(shí)觀察發(fā)酵液的顏色變化并補(bǔ)加氨水和/或液氨時(shí)(本文中的每2小時(shí)表示如果8:00am觀察發(fā)酵液的顏色變化并補(bǔ)加了氨水和/或液氨，那么等到10:00am時(shí)再觀察發(fā)酵液的顏色變化并補(bǔ)加氨水和/或液氨，依此類推)，可以獲得較佳的發(fā)酵結(jié)果并在最大程度上減輕操作人員的勞動(dòng)強(qiáng)度。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，賴氨酸發(fā)酵菌種在被接種至培養(yǎng)基中之前，采用常規(guī)方法將賴氨酸發(fā)酵菌種依次經(jīng)過菌種活化和種子培養(yǎng)。種子培養(yǎng)的培養(yǎng)程度可以通過取樣顯微鏡鏡檢、OD (optical density)值測定對產(chǎn)賴氨酸微生物的生長進(jìn)行觀察，當(dāng)通過上述方法觀察菌體形態(tài)正常、測定OD值達(dá)到0. 08以上時(shí)停止培養(yǎng)，將此時(shí)的種子液稱為成熟種子液。然后再將成熟種子液接入培養(yǎng)基中。因此，本發(fā)明中，賴氨酸發(fā)酵菌種的接種量為12-18體積％，指的是接入發(fā)酵培養(yǎng)基中的成熟種子液的體積占接入成熟種子液后發(fā)酵培養(yǎng)基體積的12-18%。以下將通過實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。以下實(shí)施例中，成熟種子液的培養(yǎng)方法包括配制種子培養(yǎng)基(具體組成為相對于每升培養(yǎng)基，葡萄糖的用量為35克，玉米漿(干重為35重量％)的用量為80克，磷酸氫二鉀的用量為I. 0克，硫酸鎂的用量為0. 5克，硫酸銨的用量為10克，蘇氨酸的用量為0. 2克，蛋氨酸的用量為0. 2克)，121°C、102. 9kPa滅菌30分鐘，將活化后的黃色短桿菌菌種(菌株原種FB42購自江南大學(xué))接入冷卻后的種子培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中120分鐘后，根據(jù)菌體生長情況每隔60分鐘取樣鏡檢并測定OD值，當(dāng)鏡檢菌體形態(tài)正常且OD值達(dá)到0. 8時(shí)停止培養(yǎng)，得到成熟種子液。以下實(shí)施例中，發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為相對于每升發(fā)酵培養(yǎng)基，葡萄糖的用量為50克，糖蜜(產(chǎn)地新疆)的用量為40克，玉米漿(干重為35重量％)的用量為30克，硫酸銨的用量為30克,磷酸氫二鉀的用量為I. 0克,硫酸鎂的用量為0. 5克,蘇氨酸的用量為0. 2克，蛋氨酸的用量為0. 2克，谷氨酸的用量為0. 3克，適量的指示劑，調(diào)節(jié)pH值為6. 8。以下實(shí)施例中，按照GB10794-89標(biāo)準(zhǔn)檢測發(fā)酵液中的賴氨酸含量(以賴氨酸鹽酸鹽計(jì));按照GB/T5009. 7-2008的方法測定發(fā)酵液中還原性糖的濃度；pH值的檢測使用梅特勒DeLTA320pH計(jì)；轉(zhuǎn)化率(％)=產(chǎn)酸量/耗糖量X 100%，其中，產(chǎn)酸量等于發(fā)酵終點(diǎn)發(fā)酵液中的賴氨酸含量X發(fā)酵終點(diǎn)體積；耗糖量等于發(fā)酵培養(yǎng)基中還原性糖質(zhì)量減去發(fā)酵終點(diǎn)發(fā)酵液中還原性糖質(zhì)量；賴氨酸搖瓶發(fā)酵的穩(wěn)定性通過計(jì)算發(fā)酵結(jié)束后三個(gè)500ml三角燒瓶中發(fā)酵液中賴氨酸含量的標(biāo)準(zhǔn)差來判斷，標(biāo)準(zhǔn)差值越小，表明搖瓶發(fā)酵的穩(wěn)定性越高，標(biāo)
準(zhǔn)差的計(jì)算公式為
權(quán)利要求
1.一種培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基含有碳源、氮源、無機(jī)鹽和水，其特征在于，該培養(yǎng)基還含有指示劑，所述指示劑的變色pH范圍為5. 5-8O
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的培養(yǎng)基，其中，所述指示劑的變色pH范圍為6.5-8。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的培養(yǎng)基，其中，相對于每升培養(yǎng)基，所述指示劑的添加量為O. 002-0. 012 克。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)所述的培養(yǎng)基，其中，所述指示劑為中性紅、溴百里酚藍(lán)、酚紅、苯酚紅和石蕊中的一種。
5.權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)所述的培養(yǎng)基在賴氨酸搖瓶發(fā)酵中的應(yīng)用。
6.一種賴氨酸搖瓶發(fā)酵方法，該方法包括將賴氨酸發(fā)酵菌種接種到培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，其特征在于，所述培養(yǎng)基為權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)所述的培養(yǎng)基。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中，所述賴氨酸發(fā)酵菌種為谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)、大腸桿菌(Escherichia Coli)和黃色短桿菌(Brevibacterium fIavum)中的至少一種。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中，所述搖瓶發(fā)酵的條件包括溫度為30-38°C，pH值為6. 8-7. 4，時(shí)間為28-36h，搖床的轉(zhuǎn)速為180_210rpm。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中，在所述搖瓶發(fā)酵過程中，通過添加氨水和/或液氨的方式調(diào)節(jié)PH值為6. 8-7. 4。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種培養(yǎng)基及其在賴氨酸搖瓶發(fā)酵中的應(yīng)用與利用該培養(yǎng)基的賴氨酸搖瓶發(fā)酵方法，該培養(yǎng)基含有碳源、氮源、無機(jī)鹽和水，其特征在于，該培養(yǎng)基還含有指示劑，所述指示劑的變色pH范圍為5.5-8。通過上述技術(shù)方案，操作人員不需要進(jìn)行取樣檢測pH值即可以直接根據(jù)培養(yǎng)基的顏色變化確定補(bǔ)加氨水或液氨的時(shí)間和加量，簡化了發(fā)酵操作過程，縮短了調(diào)節(jié)pH值耗費(fèi)的時(shí)間，降低了操作人員的勞動(dòng)強(qiáng)度，進(jìn)而降低了染菌幾率。另外，添加的指示劑不會(huì)對發(fā)酵產(chǎn)生負(fù)面影響。因此，使用本發(fā)明的培養(yǎng)基進(jìn)行賴氨酸搖瓶發(fā)酵時(shí)，發(fā)酵的穩(wěn)定性明顯增強(qiáng)。
文檔編號(hào)C12R1/19GK102766662SQ20121026847
公開日2012年11月7日 申請日期2012年7月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月30日
發(fā)明者馮志菲, 盧宗梅, 吳曉艷, 張軍華, 熊結(jié)青 申請人:中糧生物化學(xué)(安徽)股份有限公司