專利名稱：一株解淀粉芽孢桿菌菌株的胞外多糖代謝產(chǎn)物提取及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一株解淀粉芽孢桿菌Bacillusamyloliquefaciens C-I菌株的胞外多糖代謝產(chǎn)物提取及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
近年來，采用微生物及其產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)來防治農(nóng)作物真菌病害已成為重要研究方向之一，Caldelra等分離到一株解淀粉芽孢桿菌CCMI 1051 (Bacillusamyloliquefaciens)對根霉 L-122 (Rhizopussp)和哈茨木霉 CCMI 783 (Trichodermaharzianum)等具有強烈的抑制作用[Annals of mic rbilology,2007, 57:29-33] oArrebola等報道解淀粉芽孢桿菌PPCB004可抑制Penicillium crustosum Thom等青霉屬真菌的菌絲延伸，Lee等發(fā)現(xiàn)緩病類芽孢桿菌WJ5 (Paenibacillus Ientimorbus)菌株抑制灰霉(Botrytis cinerea)等多種植物致病菌,其抗真菌活性物質(zhì)分泌于細(xì)胞外，并可被正丁醇提取。研究表明芽孢桿菌及其產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)在植物病害生物防治中具有巨大的應(yīng)用潛力。解淀粉芽孢桿菌是一種與枯草芽孢桿菌親緣性很高的細(xì)菌，在其自身的生長過程中可以產(chǎn)生一系列的代謝產(chǎn)物，這些代謝產(chǎn)物使得解淀粉芽孢桿菌能夠具有廣泛地抑制真菌和細(xì)菌的活性。王英國等人從堆肥中分離到一株解淀粉芽孢桿菌，其對于尖孢鐮刀菌、草莓蛇病菌等植物病原真菌均有很強的抑制作用。李潞濱等人從各地大花惠蘭種植地采集的土樣中篩選出對大花惠蘭根腐病病原菌尖孢鐮刀菌具有拮抗活性的解淀粉芽孢桿菌ZL725。王奕文等人首次從不同甜瓜果實表面分離到一株解淀粉芽孢桿菌，對灰葡萄孢、鏈格孢、尖孢鐮刀菌、黑曲霉和粉紅單端孢等8種果蔬采后病原真菌顯著且廣譜的拮抗作用。姜軍坡等人從健康牛的糞便中篩選出對大腸桿菌有抑制作用的解淀粉芽孢桿菌BN-9。Sutyak等人從酸奶廠的益生菌乳制品中分離出I株解淀粉芽孢桿菌。其細(xì)胞的無菌上清液進行過夜培養(yǎng)后，可以對李斯特菌(Listeria monocytogenes)產(chǎn)生抑菌作用。同時,在臨床試驗中對陰道加德納菌和無乳鏈球菌也有抑制效果，其有效抑菌物質(zhì)為細(xì)菌素。W. S.ffu等人研究了解淀粉芽孢桿菌對秋英科作物細(xì)菌病害的潛在防治效果，通過從2處寄主(試驗田)(C、T)中分離解淀粉芽孢桿菌進行的拮抗劑治療活性菌株源性病原體的實驗以及溫室和田間試驗發(fā)現(xiàn)6株來自于寄主C與I株來自于寄主T的解淀粉芽孢桿菌能夠有效地降低種子和葉片病害的嚴(yán)重性。對解淀粉芽孢桿菌代謝產(chǎn)物，尤其是其胞外多糖的抗人腫瘤方面的研究屬于首次，抗氧化作用的研究屬于首次。多糖抗氧化作用已經(jīng)成為最為活躍的研究課題之一，通常植物和藻類來源的多糖較為普遍，但近些年來，微生物來源的多糖(胞外多糖)引起廣泛關(guān)注，尤其是細(xì)菌和真菌來源的胞外多糖，因其易于分離純化而且產(chǎn)量高等優(yōu)點在工業(yè)生產(chǎn)中頗受青睞。胞外多糖(Exopolysaccharide, EPS)是細(xì)菌細(xì)胞外含糖結(jié)構(gòu)的總稱,包括革蘭氏陰性細(xì)菌胞膜外的多糖成分和革蘭氏陽性菌得肽聚糖，是細(xì)菌在特定環(huán)境調(diào)節(jié)下產(chǎn)生的高分子物質(zhì)。作為細(xì)菌的次生代謝產(chǎn)物，胞外多糖對細(xì)菌的作用主要有使細(xì)菌群集抵抗吞噬；保護細(xì)菌不和抗體結(jié)合；形成群集內(nèi)細(xì)菌交替性生長；幫助細(xì)菌群體向周圍獲得足夠營養(yǎng)。作為與人類生活緊密相關(guān)的一類生物高分子，近年的研究發(fā)現(xiàn)細(xì)菌胞外多糖還具有抗氧化、抗輻射、免疫調(diào)節(jié)、降血糖、降血脂，以及抗腫瘤、抗肝炎病毒等特殊的生物學(xué)活性。近年來，微生物多糖抗氧化活性的研究報道很多，其在體外可以清除自由基，還具有抗脂質(zhì)過氧化的能力；在體內(nèi)則可以提高抗氧化酶的活性，也表現(xiàn)出抗脂質(zhì)過氧化的能力，還可能與通過調(diào)節(jié)機體內(nèi)內(nèi)源性抗氧化劑的活性相關(guān)。另外多糖可以作為一種天然的生物抗氧化劑進行復(fù)配，增強對人體健康的保護作用。微生物多糖在治療和/或抑制腫瘤或在腫瘤輔助診斷、預(yù)后中應(yīng)用，包含解淀粉芽孢桿菌的基因重組或組合物及其抑制真菌、細(xì)菌、抗氧化作用等生物活性及其應(yīng)用上，鮮有報道，該研究為探尋抗腫瘤藥物提供新思路及新研究領(lǐng) 域。有報道稱部分解淀粉芽孢桿菌具有抑菌性質(zhì)(包括真菌和細(xì)菌)，在植物病害生物防治中具有巨大的應(yīng)用潛力，目前關(guān)于解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens C-I的胞外多糖抗人腫瘤相關(guān)方面的研究未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺點，本發(fā)明的目的在于提供一株解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens C_1菌株的胞外多糖代謝產(chǎn)物提取及應(yīng)用，為探尋抗腫瘤藥物開拓了新思路及新研究領(lǐng)域。為了達到上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為一株解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens C-1菌株的胞外多糖代謝產(chǎn)物，對其16srRNA序列進行PCR擴增片段，測序后進行NCBI數(shù)據(jù)庫的細(xì)菌16s rRNA序列比對，證實該分離株屬于解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens,命名為解淀粉芽孢桿菌C-I，其16s rRNA序列NCBI登錄號為JN974457，該菌現(xiàn)保存于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏號為 CCTCC Ν0:Μ 2012177?！杲獾矸垩挎邨U菌Bacillus amyloliquefaciens C_1產(chǎn)胞外多糖發(fā)酵、多糖的提取C_1菌株在LB+1%葡萄糖的固體培養(yǎng)基上的菌苔呈白色、、濕潤、飽滿；經(jīng)過濃縮、沉淀、除蛋白、透析后得到B. amyloliquefaciens C-I胞外多糖提純產(chǎn)物,產(chǎn)量為380mg/L,其中的糖蛋白濃度為0. 7%。—株解淀粉芽孢桿菌B. amyloliquefaciens C_1胞外多糖的體外抗氧化活性B. amyloliquefaciens C-I胞外多糖還原能力見表I表I
權(quán)利要求
1.一株解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens C-1,其特征在于對其16srRNA序列進行PCR擴增片段，測序后進行NCBI數(shù)據(jù)庫的細(xì)菌16s rRNA序列比對，證實該分離株屬于解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens,命名為解淀粉芽孢桿菌C-1,其16s rRNA序列NCBI登錄號為JN974457，該菌現(xiàn)保存于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏號為 CCTCC NO:M 2012177。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一株解淀粉芽孢桿菌Bacillusamyloliquefaciens C_l,其特征在于產(chǎn)胞外多糖發(fā)酵、多糖的提取，G-14菌株在LB+1%葡萄糖的固體培養(yǎng)基上的菌苔呈白色、濕潤、飽滿；經(jīng)過濃縮、沉淀、除蛋白、透析后得到B. amyloliquefaciens C-I胞外多糖提純產(chǎn)物，產(chǎn)量為380mg/L，其中的糖蛋白濃度為0. 7%。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述一株解淀粉芽孢桿菌Bacillusamyloliquefaciens C_l,其特征在于B. amyloliquefaciens C-I胞外多糖還原能力見表I 表I
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述一株解淀粉芽孢桿菌Bacillusamyloliquefaciens C_l,其特征在于B. amyloliquefaciens C-I胞外多糖對DPPH自由基的清除作用見表2 表2
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述一株解淀粉芽孢桿菌Bacillusamyloliquefaciens C_l,其特征在于B. amyloliquefaciens C-I胞外多糖對輕自由基 OH的清除作用見表3 表3
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述一株解淀粉芽孢桿菌Bacillusamyloliquefaciens C_l，其特征在于胞外多糖對超氧陰離子02—的清除作用見表4 表4
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述一株解淀粉芽孢桿菌Bacillusamyloliquefaciens C_l，其特征在于脂質(zhì)過氧化抑制作用見表5 表5
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述一株解淀粉芽孢桿菌Bacillusamyloliquefaciens C_l，其特征在于解淀粉芽孢桿菌對人腫瘤細(xì)胞增殖的抑制結(jié)果見表6和表7 表6解淀粉芽孢桿菌提純的胞外多糖2. 5mg/ml對不同人腫瘤細(xì)胞生長的抑制率％
全文摘要
一株解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciens C-1菌株的胞外多糖代謝產(chǎn)物提取及應(yīng)用，其16s rRNA擴增片段經(jīng)測序后進行NCBI數(shù)據(jù)庫的細(xì)菌16s rRNA序列比對，證實該分離株屬于解淀粉芽孢桿菌B.amyloliquefaciens，其16s rRNA序列NCBI登錄號為JN974457，該菌現(xiàn)保存于中國典型培養(yǎng)物保藏中(CCTCC)，具有胞外多糖還原能力、對DPPH自由基的清除、對羥自由基·OH的清除作用、對超氧陰離子O2-的清除作用、脂質(zhì)過氧化抑制作用、對人腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用，為探尋抗腫瘤藥物開拓了新思路及新研究領(lǐng)域。
文檔編號C12P19/04GK102816716SQ20121026866
公開日2012年12月12日 申請日期2012年7月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月31日
發(fā)明者羅文娟, 韓蓓, 李旭, 劉翠翠, 韓蓁, 羅國剛, 張彥民 申請人:西安交通大學(xué)