專利名稱：乳酸脫氫酶檢測試劑盒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種人體內(nèi)酶含量的檢測試劑盒，尤其涉及ー種乳酸脫氫酶測定試劑盒及其制備方法，本發(fā)明還涉及該乳酸脫氫酶測定試劑盒在檢測人體內(nèi)乳酸脫氫酶含量的使用方法，屬于人體內(nèi)乳酸脫氫酶含量的檢測領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
乳酸脫氫酶(LDH)是ー種糖酵解酶，存在于機體所有組織細胞的胞質(zhì)內(nèi)，其中以腎臟含量較高。乳酸脫氫酶是能催化乳酸脫氫生成丙酮酸的酶，幾乎存在于所有組織中。當人體出現(xiàn)急性肝炎、急性心肌梗死、充血性心功能不全、肌營養(yǎng)不良、多發(fā)性肌炎、惡性腫瘤、肝癌、肺癌、急性白血病、淋巴肉瘤、惡性貧血、肝硬化、阻塞性黃疸、腸梗阻等疾病時，血液中的LDH活力會升高；當人體內(nèi)分泌失調(diào)、過度勞累或睡眠不佳時會導(dǎo)致血清中LDH活力會降低，因此可以通過檢測血清中LDH的活力來觀察診斷疾病。 文獻報道了一種用速率法測定血清中乳酸脫氫酶的方法(顏興偉，韓書爐等；速率法測定血清中乳酸脫氫酶，上海醫(yī)學(xué)檢驗雜志，1991)，該方法雖然比較簡單，但是由于所用的輔酶I溶液需要臨時配制，會給檢測工作帶來ー些不必要的麻煩，且每批新配制的試劑無法保證試劑的穩(wěn)定，會對結(jié)果造成一定程度的影響，從而對其推廣應(yīng)用造成了ー些不良影響。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之ー是提供ー種乳酸脫氫酶檢測試劑盒；本發(fā)明的目的之ニ是提供ー種制備所述乳酸脫氫酶檢測試劑盒的方法。本發(fā)明的上述目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的—種乳酸脫氫酶檢測試劑盒，由彼此獨立的試劑I和試劑II組成；其中，試劑I的組分包括生物緩沖劑，金屬離子絡(luò)合物，乳酸脫氫酶的反應(yīng)底物，表面活性剤，乳酸脫氫酶酶活激活劑，防腐劑和水；試劑II的組分包括生物緩沖劑，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化態(tài)，表面活性剤，防腐劑和水。為了達到更好的檢測效果，每I升試劑I中各組分的用量優(yōu)選為生物緩沖劑l-100g，金屬離子絡(luò)合物0. 5-10g,乳酸脫氫酶的反應(yīng)底物0. 05-5g,表面活性劑0. 55-22. 5g，乳酸脫氫酶酶活激活劑0. 01-0. 2g，防腐劑0. 25-lOg，余量為水；進ー步優(yōu)選的，每I升試劑I中各組分的用量為生物緩沖劑5_50g，金屬離子絡(luò)合物0. 8-4g，乳酸脫氫酶的反應(yīng)底物0. 2-lg，表面活性劑0. 25-22g，乳酸脫氫酶酶活激活劑 0. 05-0. lg，防腐剤 0. 75-5g ；最優(yōu)選的，每I升試劑I中各組分的用量為生物緩沖劑23g，金屬離子絡(luò)合物2g，乳酸脫氫酶的反應(yīng)底物0. 5g，表面活性劑5. 5g，乳酸脫氫酶酶活激活劑0. 075g,防腐劑2. 6g0每I升試劑II中各組分的用量優(yōu)選為生物緩沖劑l-100g，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化態(tài)0. 5-15g，表面活性劑0. l_5ml，防腐劑0. l_10g，余量為水；進ー步優(yōu)選的，每I升試劑II中各組分的用量為生物緩沖劑5_50g，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化態(tài)l-10g，表面活性劑0. 5-2ml，防腐劑0. 5-2g;最優(yōu)選的，每I升試劑II中各組分的用量為生物緩沖劑20g，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化態(tài)5g,表面活性劑I. Oml,防腐劑lg。試劑I或試劑II中所述的生物緩沖劑是能夠用于中和酸堿的各種生物緩沖劑，例如可以是三羥甲基甲胺基こ磺酸(TES)、2-(N-嗎啡啉)こ磺酸(MES)、N-(2-羥こ基)哌嗪-N’ -2-こ烷磺酸(HEPES)、三羥甲基甲胺基丙磺酸(TAPS)、哌嗪-1，4- ニ羥基丙磺酸(POPSO)等各種常用生物緩沖液，為了達到更好的檢測效果，試劑I中所述的生物緩沖劑優(yōu)選為三羥甲基甲胺基こ磺酸，試劑II中所述的生物緩沖劑優(yōu)選為2-(N-嗎啡啉)こ磺酸。試劑I中所述的金屬離子絡(luò)合物能夠絡(luò)合檢測樣本中的ニ價金屬離子，以減少ニ價金屬離子造成的干擾；因此，能夠絡(luò)合ニ價金屬離子的各種金屬離子絡(luò)合物均能夠適用 于作為試劑I中的金屬離子絡(luò)合物，例如こニ胺四こ酸ニ鈉，氨基三こ酸、ニ亞こ基三胺五こ酸及其鹽等，本發(fā)明優(yōu)選こニ胺四こ酸ニ鈉(EDTA)作為試劑I中的金屬離子絡(luò)合物。試劑I中所述的乳酸脫氫酶的反應(yīng)底物可以是L-乳酸鋰、丙酮酸等，本發(fā)明優(yōu)選L-乳酸鋰作為試劑I中所述的乳酸脫氫酶的反應(yīng)底物。試劑I或試劑II中所述的表面活性劑主要起到促進檢測樣本中各物質(zhì)的溶解，達到減少樣本濁度對測定結(jié)果的影響的目的；因此，現(xiàn)有的具有增溶性質(zhì)的表面活性劑都可作為試劑I或試劑II中所述的表面活性剤，例如，曲拉通X-100、こ基苯基聚こニ醇等。為了達到更好的效果，試劑I中優(yōu)選將曲拉通X-100和こ基苯基聚こニ醇組合在一起使用，其中，每I升試劑I中曲拉通X-100的用量為0. 05 2. 5m 1，優(yōu)選為0. 15 2ml，最優(yōu)選為0. 5ml ;每I升試劑I中こ基苯基聚こニ醇的用量為0. 5 20g，優(yōu)選為I 10g，最優(yōu)選為IOg0試劑II中所述的表面活性劑優(yōu)選為曲拉通X-100。試劑I所述的乳酸脫氫酶酶活激活劑能夠起到激活乳酸脫氫酶酶活性的作用，從而使檢測反應(yīng)能夠順利進行；因此，任何ー種能夠激活乳酸脫氫酶酶活的激活劑均可作為試劑I中的乳酸脫氫酶酶活激活劑；優(yōu)選的，本發(fā)明中所述的乳酸脫氫酶酶活激活劑為含有Mg2+的無機化合物，更優(yōu)選為MgCl2. 6H20。試劑II中所述的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化態(tài)(MD+)用于在乳酸脫氫酶催化的反應(yīng)過程中被還原為NADH。試劑I或試劑II中所述的防腐劑主要是為了防止細菌滋生導(dǎo)致的產(chǎn)品變質(zhì)，所以任何一種能起到防止細菌滋生作用的防腐劑均能適用于本發(fā)明；優(yōu)選的，本發(fā)明試劑I或試劑II中所述的防腐劑為咪唑烷基服。本發(fā)明檢測試劑盒中所用到的每種組分均能通過商業(yè)途徑從生物試劑公司或醫(yī)藥公司購買得到。本發(fā)明的另外ー個目的是提供ー種制備所述乳酸脫氫酶檢測試劑盒的方法，包括(I)制備試劑I :將各組分溶解于蒸餾水或雙蒸水中，混合均勻，定容至I升；(2)制備試劑II :將各組分溶解于蒸餾水或雙蒸水中，混合均勻，定容至I升；(3)將試劑I和試劑II単獨分裝，密封，即得。
本發(fā)明的又一目的是提供所述乳酸脫氫酶檢測試劑盒檢測樣品中乳酸脫氫酶含量的檢測方法，包括以下步驟向待檢測樣本(校準管以校準品做樣品，空白以蒸餾水為樣品)中依次加入試劑I和試劑II混勻，其中，待檢測樣品用量為6uL，試劑I用量為180 320uL，試劑II用量為40 120uL ;37°C恒溫60秒后，空白管調(diào)零，波長340nm，測定初始吸光度，然后在120秒內(nèi)準確測定平均每分鐘吸光度變化率AA/min。根據(jù)兩點校準品濃度和對應(yīng)吸光度變化率△ A/min，采用兩點線性校準模式確定工作曲線，樣本吸光度變化在標準工作曲線上相對應(yīng)的濃度值即為測定濃度。本發(fā)明檢測試劑盒采用雙試劑模式有效地避免了非特異性反應(yīng)的干擾，同時可以最大限度減少來自樣本本身濁度的干擾，保證了測定結(jié)果的穩(wěn)定可靠，具有穩(wěn)定性好，精確度高，線性測試范圍寬，重復(fù)性好，抗干擾性強等優(yōu)點。此外，本發(fā)明檢測試劑盒在檢測過程中不需要對樣本進行預(yù)稀釋，方便臨床使用，操作簡單、快速，適用于全自動生化分析儀，具有較大的臨床實用價值。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例來進ー步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而 更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細節(jié)和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。實施例I乳酸脫氫酶檢測試劑盒的制備I、試劑I的制備按所述用量取各組分
三羥甲基甲胺基乙磺酸(TES)23g
乙ニ胺四乙酸ニ鈉(EDTA-2Ha)2g
L-乳酸鋰0. 5g
曲拉通 X-1000,5ml
MgCl2. 6M200. 075g
乙基苯基聚乙ニ醇Wonidet P-40) Sg
咪唑烷基陳2. 6g將上述各組分溶解于蒸餾水或雙蒸水中，定容至I升，密封保存，備用。2、試劑II的制備按所述用量取各組分2-( -嗎啡啉)乙磺酸2 Og
煙酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化態(tài)(NAD+)Sg
曲拉通 X-100I. Oml 味唑烷基脲Ig將上述各組分溶解于蒸餾水或雙蒸水中，定容至I升，密封保存，備用。實施例2乳酸脫氫酶檢測試劑盒的制備I、試劑I的制備按所述用量取各組分
三舞f基甲胺基乙磺酸(TES)ISg
乙ニ胺四乙酸ニ鈉(EDTA-2Na)Ig
L-乳酸裡I, Sg
曲拉通X-100ImI
MgCh. 6H.00. 005g 乙基苯基聚乙ニ醇(NonWet P-40) IOg
咪唑烷基脲5g將上述各組分溶解于蒸餾水或雙蒸水中，定容至I升，密封保存，備用。2、試劑II的制備按所述用量取各組分
2-(N-嗎啡啉)乙磺酸35g
煙酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化態(tài)(NAD+ )Sg
曲拉通X-1002 In I咪唑烷基脲4g將上述各組分溶解于蒸餾水或雙蒸水中，定容至I升，密封保存，備用。實施例3乳酸脫氫酶檢測試劑盒的制備I、試劑I的制備按所述用量取各組分三峯甲基甲驗基乙磺酸《TES)4 Og
乙ニ胺四乙酸ニ鈉(EDTA-2Na)I. Sg
L-乳酸裡2g
曲拉通 X-1000. 8ml
MgCl2. 6H>00. 04g
乙基苯基聚乙ニ醇(Nonidet P-補)15g
咪11 坐烷基脲3g將上述各組分溶解于蒸餾水或雙蒸水中，定容至I升，密封保存，備用。

2、試劑II的制備按所述用量取各組分
2- (N-嗎啡啉)乙磺酸25g
煙酜胺腺嘌呤二核苷酸氧化態(tài)(NAD+)6g
曲拉通 X-1001.6ml
咪唑烷基脲5g將上述各組分溶解于蒸餾水或雙蒸水中，定容至I升，密封保存，備用。實施例4乳酸脫氫酶檢測試劑盒的制備I、試劑I的制備按所述用量取各組分
三羥甲基甲胺基乙磺酸(TES)Ig
乙ニ胺四乙酸ニ鈉(BDTA-2Na)0. Sg
L-乳酸鋰G. 05g
曲拉通)(-1000. OSnilMgCl2JH2O0. Olg
乙基苯基聚乙ニ醇(Nonidet P-40)0. Sg
咪唑烷基脲G. 25g將上述各組分溶解于蒸餾水或雙蒸水中，定容至I升，密封保存，備用。2、試劑II的制備按所述用量取各組分2-( -嗎啡啉〉乙磺酸Ig
煙醜胺腺嘌呤二核魯酸氧化態(tài)(NAD+ )0. Sg
曲拉通 X-1000. Iml 味唑烷基脲0. Ig
將上述各組分溶解于蒸餾水或雙蒸水中，定容至I升，密封保存，備用。實施例5乳酸脫氫酶檢測試劑盒的制備I、試劑I的制備按所述用量取各組分
三羥甲基甲驗基乙磺《4 (TES)IOOg
乙ニ驗四こ酸ニ鈉(EDTA-2跑)IOg
L-乳酸鋰Sg
衝拉通 X-1002. 5ml
MgCl2. 6H2O0. 2 g
乙基笨基聚乙ニ醇(Nonidet P-40)20g
咪唑烷基鳳I Og將上述各組分溶解于蒸餾水或雙蒸水中，定容至I升，密封保存，備用。2、試劑II的制備按所述用量取各組分
2-(N-嗎啡啉)乙磺酸IOOg
煙酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化態(tài)(NAD+ )15g 曲拉通X-1005ml
咪唑烷基脲IOg將上述各組分溶解于蒸餾水或雙蒸水中，定容至I升，密封保存，備用。實施例6乳酸脫氫酶檢測試劑盒的制備I、試劑I的制備按所述用量取各組分三摩甲基甲黢基乙磺酸(TES)SOg
乙ニ胺四乙酸ニ鈉(EDTA-2Na)4g
レ乳酸鋰Ig
曲拉通X-1 002 ml
MgCl,. 61-1,00. I g
乙基苯基聚乙ニ醇(Nonidet P-40)IOg
咪唑烷基緣Sg將上述各組分溶解于蒸餾水或雙蒸水中，定容至I升，密封保存，備用。

2、試劑II的制備按所述用量取各組分
2-0-嗎緋啉)乙磺酸IOOg
煙酰胺腺嘌呤二核香酸氣化態(tài)(WAD+)ISg
曲拉通X-1005ml
咪唑烷基藤IOg將上述各組分溶解于蒸餾水或雙蒸水中，定容至I升，密封保存，備用。實施例7乳酸脫氫酶檢測試劑盒的制備I、試劑I的制備按所述用量取各組分
三羥甲基甲胺基乙磺酸(TES)Sg
乙ニ胺四乙酸ニ鈉(EDTA-2Na)0. 8|
L-乳酸鋰0. 2g
曲拉通)(-1000. 15ml
MgCl2. 6H200. 05 g
乙基笨基聚乙ニ醇(Nonidet P-40)Ig
咪唑烷基脲0. 75g將上述各組分溶解于蒸餾水或雙蒸水中，定容至I升，密封保存，備用。2、試劑II的制備按所述用量取各組分
權(quán)利要求
1.一種乳酸脫氫酶檢測試劑盒，其特征在于由彼此獨立的試劑I和試劑II組成；其中，試劑I的組分包括生物緩沖劑，金屬離子絡(luò)合物，乳酸脫氫酶的反應(yīng)底物，表面活性齊U，乳酸脫氫酶酶活激活劑，防腐劑和水；試劑II的組分包括生物緩沖劑，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化態(tài)，表面活性劑，防腐劑和水。
2.按照權(quán)利要求I所述的乳酸脫氫酶檢測試劑盒，其特征在于每I升試劑I中各組分的用量為生物緩沖劑Ι-lOOg，金屬離子絡(luò)合物O. 5-10g，乳酸脫氫酶的反應(yīng)底物O.05-5g，表面活性劑O. 55-22. 5g，乳酸脫氫酶酶活激活劑O. 01-0. 2g，防腐劑O. 25-10g,余量為水； 每I升試劑II中各組分的用量為生物緩沖劑l-100g，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化態(tài)O.5-15g，表面活性劑O. l_5ml，防腐劑O. l_10g，余量為水。
3.按照權(quán)利要求2所述的乳酸脫氫酶檢測試劑盒，其特征在于每I升試劑I中各組分的用量為生物緩沖劑5-50g，金屬離子絡(luò)合物O. 8-4g，乳酸脫氫酶的反應(yīng)底物O. 2-lg，表面活性劑O. 25-22g，乳酸脫氫酶酶活激活劑O. 05-0. Ig,防腐劑O. 75_5g ； 每I升試劑II中各組分的用量為生物緩沖劑5-50g，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化態(tài)l-10g，表面活性劑O. 5-2ml，防腐劑O. 5_2g。
4.按照權(quán)利要求3所述的乳酸脫氫酶檢測試劑盒，其特征在于每I升試劑I中各組分的用量為生物緩沖劑23g，金屬離子絡(luò)合物2g，乳酸脫氫酶的反應(yīng)底物O. 5g，表面活性劑5. 5g，乳酸脫氫酶酶活激活劑O. 075g,防腐劑2. 6g ； 每I升試劑II中各組分的用量為生物緩沖劑20g，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化態(tài)5g，表面活性劑I. 0ml，防腐劑lg。
5.按照權(quán)利要求1-4任何一項的乳酸脫氫酶檢測試劑盒，其特征在于試劑I中所述的生物緩沖劑為三羥甲基甲胺基乙磺酸，試劑II中所述的生物緩沖劑為2-(N-嗎啡啉)乙磺酸。
6.按照權(quán)利要求1-4任何一項的乳酸脫氫酶檢測試劑盒，其特征在于所述的金屬離子絡(luò)合物是乙二胺四乙酸二鈉；所述乳酸脫氫酶的反應(yīng)底物是L-乳酸鋰或丙酮酸。
7.按照權(quán)利要求1-4任何一項的乳酸脫氫酶檢測試劑盒，其特征在于試劑I中所述的表面活性劑由曲拉通X-100和乙基苯基聚乙二醇組成；其中，每I升試劑I中曲拉通X-100的用量為O. 05-2. 5ml，優(yōu)選為O. 15_2ml，最優(yōu)選為O. 5ml ;每I升試劑I中乙基苯基聚乙二醇的用量為O. 5-20g，優(yōu)選為l-10g，最優(yōu)選為IOg ;試劑II中所述的表面活性劑為曲拉通X-100。
8.按照權(quán)利要求1-4任何一項的乳酸脫氫酶檢測試劑盒，其特征在于試劑I中所述乳酸脫氫酶酶活激活劑為含有Mg2+的無機化合物，優(yōu)選為MgCl2. 6H20。
9.按照權(quán)利要求1-4任何一項的乳酸脫氫酶檢測試劑盒，其特征在于試劑I或試劑II中所述的防腐劑為咪唑烷基脲。
10.一種制備權(quán)利要求1-4任何一項所述乳酸脫氫酶檢測試劑盒的方法，包括(I)制備試劑I :將各組分溶解于蒸餾水或雙蒸水中，混合均勻，定容至I升；(2)制備試劑II :將各組分溶解于蒸餾水或雙蒸水中，混合均勻，定容至I升；(3)將試劑I和試劑II單獨分裝，密封，即得。
全文摘要
本發(fā)明公開了乳酸脫氫酶檢測試劑盒及其制備方法。本發(fā)明試劑盒由彼此獨立的試劑Ⅰ和試劑Ⅱ組成；其中，試劑Ⅰ的組分包括生物緩沖劑，金屬離子絡(luò)合物，乳酸脫氫酶的反應(yīng)底物，表面活性劑，乳酸脫氫酶酶活激活劑，防腐劑和水；試劑Ⅱ的組分包括生物緩沖劑，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化態(tài)，表面活性劑，防腐劑和水。本發(fā)明檢測試劑盒采用雙試劑模式有效避免了非特異性反應(yīng)的干擾，同時可最大限度減少來自樣本本身濁度的干擾，保證了測定結(jié)果的穩(wěn)定可靠，具有穩(wěn)定性好，精確度高，線性測試范圍寬，重復(fù)性好，抗干擾性強等優(yōu)點。此外，本發(fā)明檢測試劑盒在檢測過程中不需對樣本進行預(yù)稀釋，方便臨床使用，操作簡單、快速，適用于全自動生化分析儀。
文檔編號C12Q1/32GK102766677SQ20121027038
公開日2012年11月7日 申請日期2012年7月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月31日
發(fā)明者華權(quán)高, 舒芹, 許可 申請人:武漢生之源生物科技有限公司