專利名稱：與番茄黃化卷葉病毒病抗性基因Ty-2緊密連鎖的分子標記的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種與番茄黃化卷葉病毒抗性基因緊密連鎖的分子標記及其應用。
背景技術(shù)：
番爺黃化卷葉病毒(TYLCV)屬于雙生病毒科(Geminiviridae)菜豆金色花葉病毒屬(Begomovirus),主要通過煙粉風(Bemisia tabaci)傳播。TYLCV起源于中東地區(qū)和地中海盆地，主要分布在地中海西部、日本、美國東南部和加勒比海地區(qū)，是一種熱帶、亞熱帶地區(qū)極具毀滅性的番爺病毒病。自1964年被正式命名以來(Cohen and Harpaz 1964),已經(jīng)在中東、歐洲、東南亞、東亞及非洲等眾多國家和地區(qū)相繼造成危害(Czosnek andLaterrot, 1997;Polston and Andersonl997;Moriones and Navas-Castillo, 2000)。自 20世紀90年代起，在中國的浙江、上海、廣西、云南、江蘇、河南、廣東、福建、海南和臺灣等地也相繼在番茄上發(fā)現(xiàn)有TYLCV的危害(蔡健和等，2006 ;何自福等，2007 ;王東生等，2007 ；趙統(tǒng)敏等，2007)。TYLCV對番茄生產(chǎn)存在著嚴重威脅，而選育抗病品種是防治這一病害最有效的方法。研究表明，野生番茄中存在抗TYLCV的基因，其中抗病基因Ty-2在越南、印度、以色列和我國大陸等地特別是亞洲地區(qū)均表現(xiàn)出對TYLCV的較高抗性。Ty-2是一個來自于多毛番茄的單個顯性基因，最初被定位在第11號染色體的長臂約19cM的片段上，2009年被進一步定位在 6.5cM 區(qū)域內(nèi)(Hanson et al.，2006; Ji et al.，2007c; Ji et al.，2009)。鑒于此，對Ty-2基因進行精細定位，獲得與與Ty-2緊密連鎖甚至共分離的分子標記，將為Ty_2的克隆奠定基礎(chǔ)，同時為Ty-2基因的抗病育種提供更緊密連鎖的分子標記。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問題，本發(fā)明的目的在于提供一種與番茄黃化卷葉病毒Ty-2抗性基因緊密連鎖的分子標記。本發(fā)明的另一目的在于提供該分子標記在番茄黃化卷葉病毒抗性基因定位或檢測以及標記輔助育種中的應用。為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供了一種與番茄黃化卷葉病毒Ty-2抗性基因緊密連鎖的分子標記，該分子標記的核苷酸序列如SEQID No. I所不。本發(fā)明還提供了一種擴增與番茄黃化卷葉病毒Ty-2抗性基因緊密連鎖的分子標記的引物對，該引物對序列如下P1:5 ’ -CACACATATCCTCTATCCTATTAGCTG-3，；P2:5 ’ -CGGAGCTGAATTGTATAAACACG-3，。本發(fā)明還提供了一種含有上述分子標記的載體。本發(fā)明還提供了一種與番茄黃化卷葉病毒抗性基因緊密連鎖的分子標記的檢測方法，該方法以抗感番茄黃化卷葉病毒的番茄基因組DNA為模板經(jīng)PCR擴增，得到能同時鑒定父本、母本及其雜合體的基因型的特異譜帶，該特異譜帶包括攜帶抗性基因的植株譜帶和不攜帶抗性基因的植株譜帶，所述攜帶抗性基因的植株譜帶為核苷酸序列如SEQ IDNo. I所示的分子標記。所述不攜帶抗性基因的植株譜帶的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。上述方法中，PCR反應體系為101^反應體系包括正、反向引物各0.411]\1，0.81111(1見1^，2.5111^%(12，1111 IOXbuffer, 0. 25units Taq 聚合酶(New England Biolabs, Ipswich, MA), DNA 模板 15ng。

上述方法中，PCR擴增程序為94°C預變5min;94°C變性308，55°〇或601退火45s, 72°C延伸 30-60s, 37 個循環(huán)；72°C延伸 5-lOmin。本發(fā)明還提供了上述分子標記和檢測方法在番茄黃化卷葉病毒抗性基因定位或檢測或標記輔助育種中的應用。本發(fā)明具備的有益效果在于I)本發(fā)明的分子標記進一步定位了番茄黃化卷葉病毒抗性基因Ty-2。標記的特異性強、穩(wěn)定性高，并且標記的篩選方法操作簡便快捷，對檢測設(shè)備和引物模板質(zhì)量要求不高，具有試驗試劑用量少，速度快，成本低，適合大批次、高通量、自動化的優(yōu)點。非常適合現(xiàn)代農(nóng)業(yè)分子育種的實現(xiàn)；2)本發(fā)明為番茄黃化卷葉病毒抗性基因Ty-2的圖位克隆提供了重要的分子遺傳學信息；3)本發(fā)明的番茄黃化卷葉病毒抗性基因Ty-2分子標記引物應用于育種工作中，將大大降低番茄黃化卷葉病毒病流行對番茄生產(chǎn)造成的經(jīng)濟損失，同時減少農(nóng)藥使用量，有益于降低生產(chǎn)成本，具有很大的應用潛力和較高的經(jīng)濟價值。4)本發(fā)明篩選出與Ty-2基因連鎖的SCAR標記，可以有效的用于Ty_2基因的標記輔助選擇，所述分子標記與番茄黃化卷葉病毒抗性基因Ty-2的緊密連鎖距離為2. 2cM。以該標記為路標，可以進行Ty-2基因的精細定位或通過染色體步移法接近Ty-2基因，從而提高選擇的準確性，縮短育種年限，同時也為Ty-2基因的克隆打下基礎(chǔ)。


圖I為本發(fā)明Ty-2基因在不同材料H24 (左邊，Hanson et al.，2000)、Fl雜種H9205 (第 2 個)、E959 (篩選自 H9205 的 F3 代株系，Ji et al.，2009)和 Fll. E504 (右邊，本研究篩選出的重組單株)中的滲透片段。陰影部分代表抗性滲透片段，每個圖譜左邊的數(shù)字代表每個分子標記的遺傳距離，F(xiàn)ll. E504是本研究新構(gòu)建的遺傳圖譜，沒有滲透片段的區(qū)域空白。圖2為本發(fā)明26個重組單株分子標記基因型和重組單株自交系表型鑒定。其中，抗性滲透片段模式黑色表示純合抗病單株，灰色表示純合感病單株，斜線區(qū)域表示那一段的分子基因型表現(xiàn)出雜合。每個柱子上面的數(shù)字表示含有這種基因型的重組單株株數(shù)。R表示所有重組單株自交系所有單株抗??；S表示所有單株感病。圖3為本發(fā)明與抗番茄黃化卷葉病毒抗性基因Ty-2緊密連鎖的分子標記對雜合抗病親本Tyqueen、抗病親本材料E951-7、感病親本材料Horizon檢測結(jié)果。圖中，M:100bpDNA Marker, I :純合抗性親本E951-7, 2 :感病親本Horizon, 3 :雜合抗病親本Tyqueen。圖4為本發(fā)明Ty-2基因標記P1-16與已報道的Ty_2基因標記T0302對課題組轉(zhuǎn)育Ty-2基因的F6代群體材料進行分子標記輔助選擇檢測結(jié)果。圖中，M為IOObpDNAMarker。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的保護范
圍。 若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。實施例I與Ty-2基因緊密連鎖標記的篩選植物材料本實驗所用的抗病雜合體(Ty-2/ty_2)、抗病純合體(Ty-2/Ty_2)和感病純合體(ty_2/ty_2)分別為TyQueen、E951-7和Horizon。TyQueen是一個商業(yè)雜交種。E951-7 (篩選自H9205的F4代株系)是來自智利番茄的近等基因系(NILs)材料，僅在11號染色體含有Ty-2基因的抗性片段(Ji et al.，2009)。Horizon是一個普通栽培番茄材料。標記驗證使用的群體材料l)Ji等(2009)從Heinz Fl hybrid H9205中構(gòu)建的F4代群體，2011年春季篩選了 7,000個群體單株。其中，篩選出在C2 Atlg07960和Ml之間發(fā)生重組的單株26個，26個重組單株的分子標記基因型和表型鑒定結(jié)果如圖2。26個重組單株于2011年4月初移栽到地里，收獲種子以用于表型鑒定。2)為了進一步驗證標記的準確性，利用課題組轉(zhuǎn)育Ty-2基因的F6代櫻桃番茄群體材料進行了驗證，群體鑒定結(jié)果如圖4所示。其是F6代櫻桃番茄群體材料由櫻桃番茄品種金妃與臺灣亞蔬中心引進的含TY2抗病基因的材料CLN3022F2 — 154 — 22 — 5 — 0雜交6代得到的。接種鑒定參照Griffiths和Scott (2001)的方法。苗子2 3片真葉期或插條生根后，將其放置于放有帶毒煙粉虱的生長室內(nèi)，兩周后殺死帶毒的煙粉虱，之后將苗子移栽到溫室或大田中，觀察病情結(jié)果。分子標記本試驗中所用的分子標記都是基于PCR反應的SCAR或CAPS標記，分子標記 C2_Atlg07960、TG36、T0386A、cLEN_ll_F24 和 T0302 來自 SGN 網(wǎng)站(http: //www.solgenomic. org),根據(jù)番爺基因組序列新設(shè)計開發(fā)出來的標記引物有Pl_16、2-1、5_3、cLl、cL2、Ml、M2 和 M3。C2_Atlg07960(82. 5cM)(Ji et al.，2009)和 T0302(89cM)(Garciaet al. , 2007)被用作篩選重組單株的側(cè)翼標記。本研究利用了一對F0D>3的分子標記TG36 (84cM)和TG105 (90cM)計算出番茄基因組IcM ^ lOOkb，然后對本研究中用到的所有分子標記的遺傳距離進行了估算(圖I)。
權(quán)利要求
1.一種與番爺黃化卷葉病毒Ty_2抗性基因緊密連鎖的分子標記,該分子標記的核苷酸序列如SEQ ID No. I所示。
2.擴增權(quán)利要求I所述分子標記的引物。
3.如權(quán)利要求2所述的引物，該引物序列如下Pl :5’ -CACACATATCCTCTATCCTATTAGCTG-3’ ；P2 :5’ -CGGAGCTGAATTGTATAAACACG-3’。
4.一種含有權(quán)利要求I所述分子標記的載體。
5.使用權(quán)利要求I所述分子標記的檢測方法，其特征在于，該方法以抗感番茄黃化卷葉病毒的番茄基因組DNA為模板經(jīng)PCR擴增，得到能同時鑒定父本、母本及其雜合體的基因型的特異譜帶，該特異譜帶為攜帶抗性基因的植株譜帶和不攜帶抗性基因的植株譜帶，所述攜帶抗性基因的植株譜帶為權(quán)利要求I所述的分子標記。
6.如權(quán)利要求5所述的檢測方法，其特征在于，所述不攜帶抗性基因的植株譜帶的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。
7.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述PCR體系如下10yL反應體系包括正、反向引物各 O. 4μΜ，0. 8mM dNTPs，2. 5mMMgCl2, I μ I IOX buffer, O. 25units Taq 聚合酶，DNA 模板 15ng。
8.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述PCR擴增的程序均為94°C預變5min;94°C變性 30s, 55°C或 60°C退火 45s, 72°C延伸 30_60s, 37 個循環(huán)；72°C延伸 5-10min;保存溫度4°C。
9.權(quán)利要求I所述分子標記在番茄黃化卷葉病毒抗性基因定位、檢測或標記輔助育種中的應用。
10.權(quán)利要求5-8任意一項所述檢測方法在番茄黃化卷葉病毒抗性基因定位、檢測或標記輔助育種中的應用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種與番茄黃化卷葉病毒Ty-2抗性基因緊密連鎖的分子標記，該分子標記的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本發(fā)明篩選出與Ty-2基因連鎖的SCAR標記，可以有效的用于Ty-2基因的標記輔助選擇，所述分子標記與番茄黃化卷葉病毒抗性基因Ty-2的緊密連鎖距離為2.2cM。以該標記為路標，可以進行Ty-2基因的精細定位或通過染色體步移法接近Ty-2基因，從而為Ty-2基因的克隆打下基礎(chǔ)。
文檔編號C12N15/11GK102766626SQ20121027065
公開日2012年11月7日 申請日期2012年7月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月31日
發(fā)明者國艷梅, 杜永臣, 楊曉慧, 王孝宣, 高建昌 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所