專(zhuān)利名稱(chēng)：一種用于檢測(cè)豬Kobu病毒的檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種可以精確、特異、快速檢測(cè)豬Kobu病毒，具體涉及一種用于檢測(cè)豬Kobu病毒的檢測(cè)試劑盒。
背景技術(shù)：
豬kobu病毒(Kobu virus, PBoV)屬于小核糖核酸病毒科成員，為無(wú)囊膜RNA病毒。Reuter G等于2007年2月從匈牙利某豬場(chǎng)健康豬群中采集60份糞便樣品，經(jīng)檢測(cè)，檢出Kobu病毒陽(yáng)性39份，陽(yáng)性率為65%。亞洲和歐洲的不少學(xué)者已經(jīng)報(bào)道了豬Kobu病毒感染狀況，表明在健康豬群和表現(xiàn)腹瀉癥狀的豬群或血清樣品中均檢出較高的陽(yáng)性率，可見(jiàn)其流行很廣。經(jīng)對(duì)豬Kobu病毒感染豬日齡的調(diào)查，表明幼齡豬較成年豬更易感。對(duì)嚴(yán)重腹瀉仔豬采集的樣本分析發(fā)現(xiàn)，流行性腹瀉、傳染性胃腸炎和輪狀病毒檢測(cè)陽(yáng)性率較低，陽(yáng)性率不足5%,而豬博卡病毒(porcine bocavirus, PBoV)和豬Kobu病毒檢測(cè)陽(yáng)性率達(dá)到 86.6%。由此可見(jiàn)，PBoV和Kobu病毒是這次仔豬腹瀉的罪魁禍?zhǔn)?。但到目前為止，由于?duì)該兩種病毒的認(rèn)識(shí)還不夠深入，尚無(wú)實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)豬Kobu病毒技術(shù)的出現(xiàn)，因此建立一種用于檢測(cè)豬Kobu病毒的熒光定量RT-PCR方法能對(duì)該病毒進(jìn)行快速診斷，對(duì)臨床治療和疾病控制有巨大的意義。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)于1996年由美國(guó)Applied Biosystems公司推出，在反應(yīng)體系中加入熒光分子，通過(guò)熒光信號(hào)的按比例增加來(lái)反應(yīng)DNA量的增加，使PCR產(chǎn)物的實(shí)時(shí)檢測(cè)成為可能。滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡臒晒饣瘜W(xué)物質(zhì)包括DNA結(jié)合染料和熒光標(biāo)記的序列特異引物或探針；專(zhuān)門(mén)的熱循環(huán)儀配備熒光檢測(cè)模塊，用于監(jiān)測(cè)擴(kuò)增時(shí)的熒光，檢測(cè)到的熒光信號(hào)反映了每個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物的量由于該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了 PCR從定性到定量的飛躍，相對(duì)常規(guī)PCR而言，熒光定量PCR的主要優(yōu)點(diǎn)是準(zhǔn)確地確定初始模板拷貝數(shù)和寬的動(dòng)態(tài)范圍內(nèi)和高的靈敏度。熒光定量PCR結(jié)果可以用于定性(判斷一段序列的有無(wú))，也可以用于定量(確定DNA拷貝數(shù))，即qPCR，而常規(guī)PCR只能做半定量。另外，熒光定量PCR的結(jié)果無(wú)需通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳來(lái)評(píng)估，大大節(jié)省實(shí)驗(yàn)時(shí)間，提高實(shí)驗(yàn)效率。還有，由于PCR反應(yīng)和檢測(cè)都在反應(yīng)管中進(jìn)行，樣品污染的幾率大大降低，無(wú)需擴(kuò)增后的實(shí)驗(yàn)操作，目前已得到廣泛應(yīng)用?；谝陨蟽?yōu)點(diǎn)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)至發(fā)明之日起，已被廣泛用于病原的檢測(cè)，如豬瘟病毒、豬圓環(huán)病毒、豬藍(lán)耳病毒、沙門(mén)氏菌、大腸桿菌等病原的檢測(cè)。到目前為止，未發(fā)現(xiàn)運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法檢測(cè)豬Kobu病毒的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)目前檢測(cè)Kobu病毒方法存在的問(wèn)題，本發(fā)明目的在于提供一種用于檢測(cè)豬Kobu病毒的檢測(cè)試劑盒本發(fā)明采用如下技術(shù)方案一種用于檢測(cè)豬Kobu病毒的檢測(cè)試劑盒，檢測(cè)50個(gè)樣品的試劑盒組成如下
試劑A :TRIZ0L20ml、氣仿 5ml、異丙醇 12. 511^751% 乙醇 10ml、RNasa_free 水 Iml ；試劑B:5XPrimeScript Buffer 100 μ l>PrimeScript RT Enzyme Mix I 25 μ I、OligodT Primer 25 μ I、Random 6 mers 100 μ I、RNase Free dH20 250 μ I ；試劑C:上游引物 Pl 25μ1、下游引物 P2 25 μ l.SYBR Green I 染料 500 μ l、ddH20160μ I ；上游引物PI : 5 ’ -GGACCCAGACACTTACGAACA-3，；下游引物P2 :5 ’ -TCGGACCAGAATGGAAAGCA-3 ’。利用試劑A抽提病毒的RNA，試劑B對(duì)其進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，試劑C對(duì)其進(jìn)行熒光定量PCR 反應(yīng)，從而對(duì)Kobu病毒進(jìn)行特異性、定量檢測(cè)。該方法是通過(guò)熒光染料或?qū)CR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，實(shí)時(shí)在線監(jiān)控反應(yīng)過(guò)程，結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分析，計(jì)算待測(cè)樣品模版的初始濃度。采用上述試劑盒進(jìn)行檢測(cè)的方法具體步驟如下I)采用常規(guī)方法提取豬Kobu病毒總RNA2)引物設(shè)計(jì)根據(jù)GenBank中發(fā)表的豬Kobu病毒的3D基因序列(AB624488)，設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，目的基因片段為lOlbp，引物序列如下上游引物PI : 5 ’ -GGACCCAGACACTTACGAACA-3 ’下游引物P2 :5 ’ -TCGGACCAGAATGGAAAGCA-3 ’3)豬Kobu病毒的3D基因RT-PCR擴(kuò)增取豬Kobu病毒總RNA，加入反轉(zhuǎn)錄引物(大連寶生物有限公司)、5XRT Buffer、dNTP/RNasin inhibitor及反轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA ;以反轉(zhuǎn)錄所得的cDNA為模版進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到豬Kobu病毒的3D基因片段，取PCR產(chǎn)物經(jīng)I %瓊脂糖凝膠電泳分析，并純化回收PCR產(chǎn)物；4)豬Kobu病毒的3D基因的克隆與鑒定將回收純化后PCR產(chǎn)物與載體連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞，篩選得到單菌落，挑選單菌落至含抗生素的液體培養(yǎng)基中，過(guò)夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，以提取的重組質(zhì)粒DNA為模版進(jìn)行PCR鑒定，并對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序鑒定；5)標(biāo)準(zhǔn)品模版的制備提取驗(yàn)證正確的陽(yáng)性重組質(zhì)粒，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定陽(yáng)性重組質(zhì)粒的濃度，并計(jì)算基因模版拷貝數(shù)，將重組質(zhì)粒進(jìn)行10倍倍比梯度稀釋?zhuān)沧?個(gè)稀釋度101，102，103，104，105，106，107，將其作為標(biāo)準(zhǔn)品模版；6) SYBR Green I 實(shí)時(shí)定量 PCR 檢測(cè)取標(biāo)準(zhǔn)品模版進(jìn)行SYBR Green I實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增，得到擴(kuò)增動(dòng)力曲線及標(biāo)準(zhǔn)曲線；選取豬Kobu病毒同一濃度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品模版進(jìn)行SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量反應(yīng)，驗(yàn)證此方法上的重復(fù)性與穩(wěn)定性；7)敏感性與特異性試驗(yàn)將已計(jì)算出拷貝數(shù)的質(zhì)粒做10倍倍比稀釋?zhuān)M(jìn)行敏感性試驗(yàn)；分別加入豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、豬流行性腹瀉病毒(PEV)、豬偽狂犬病毒(PRV)、豬瘟病毒(CSFV)、豬藍(lán)耳病毒(PRRSV)核酸作為陽(yáng)性對(duì)照，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照，驗(yàn)證此方法的特異性。
步驟3)所述的PCR擴(kuò)增體系為Premix Ex Tap 12 μ 1，濃度為O. 5 μ moL/L的引物PI、P2各0. 5 μ I, cDNA I μ I,最后用滅菌的雙蒸水補(bǔ)至25 μ I。步驟3)所述的PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?1)95°C 預(yù)變性 5min ；(2)95°C變性50s、55°C退火50s、72°C延伸lmin，此步驟為一個(gè)循環(huán)，共35個(gè)循環(huán)；(3) 72O 延伸 IOmin。步驟6)所述的SYBR Green I實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系為上游引物O. 5 μ 1，下游弓丨物為O. 5 μ I, SYBR Premix Ex Tap II聚合酶10 μ I,模版I μ I，滅菌去離子水8 μ I。步驟6)所述的SYBR Green I實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)程序 (1)95°C 預(yù)變性 5min ；(2)95°C變性10s、55°C退火15s、72°C延伸15s，此步驟為一個(gè)循環(huán)，共45個(gè)循環(huán)；當(dāng)反應(yīng)結(jié)束后先加熱至95°C，然后在降至55°C，開(kāi)始以O(shè). 5°C /s遞增至95°C檢測(cè)熒光信號(hào)得出擴(kuò)增產(chǎn)物的溶解曲線。本發(fā)明的有益效果I、擴(kuò)增曲線呈現(xiàn)出良好的S型，只出現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物特異性的單個(gè)峰，產(chǎn)物的Tm值都在78-79°C之間，說(shuō)明沒(méi)有引物二聚體及非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)；2、檢測(cè)的靈敏度可達(dá)10拷貝/微升，且具有很好的重復(fù)性；3、該方法與對(duì)照組的TGEV、PEV、PRV、CSFV, PRRSV不發(fā)生交叉反應(yīng)，具有良好的特異性；4、該方法起始模版濃度與Ct值之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率為-3. 537，擴(kuò)增效率為91.8%，相關(guān)系數(shù)R2為O. 992，說(shuō)明此反應(yīng)體系具有很高的精確度和良好的穩(wěn)定性；5、與常規(guī)的PCR比較，不但可以定性檢測(cè)豬Kobu病毒，也可以定量檢測(cè)豬Kobu病毒，而且能夠檢測(cè)出常規(guī)PCR無(wú)法檢測(cè)的病料，同時(shí)也免去了 DNA水平電泳的步驟，更加省時(shí)，且操作簡(jiǎn)單。


圖I為豬Kobu病毒的3D基因RT-PCR擴(kuò)增電泳2為豬Kobu病毒實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增動(dòng)力曲線；圖3為豬Kobu實(shí)時(shí)定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖4為豬Kobu實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增產(chǎn)物溶解曲線；圖5為熒光定量PCR檢測(cè)豬Kobu病毒的重復(fù)性結(jié)果；圖6熒光定量PCR檢測(cè)豬Kobu病毒的特異性結(jié)果。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。實(shí)施例I豬Kobu病毒總RNA提取取陽(yáng)性感染豬的血清400 μ 1，加入400 μ I的Trizol，劇烈振蕩l_2min，使其充分混勻；加入100 μ I氯仿/異戊醇(24 I)，劇烈振蕩混勻30s，12000rpm離心5min ;將上清小心轉(zhuǎn)移到無(wú)菌EP管中，加入200 μ I無(wú)水乙醇，混勻；將上述溶液全部轉(zhuǎn)移到放于2ml的收集管內(nèi)的GenClean柱中，室溫放置2min, 8000rpm離心Imin ;小心取出柱子,棄去收集管中的廢液，將柱子放回收集管；在柱子上加入450 μ I RPEsolution (漂洗液加5倍無(wú)水乙醇)，IOOOOrpm,室溫離心30s ;倒掉廢液，重復(fù)洗滌一次，小心取出柱子，棄去收集管中的廢液，將柱子放回收集管中，12000rpm室溫離心3min ;將柱子放入新EP管，加DEPC (預(yù)先預(yù)熱)20 μ I于柱中；封口膜封口，水浴70°C 2-3min, 12000rpmlmin即得到豬Kobu病毒總RNA樣品，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其0D260值及0D280值，計(jì)算出其0D260/0D280。測(cè)得樣品的濃度為4 μ g/ μ I，取5 μ I提取總RNA，用DEPC水稀釋成O. 2 μ g/ μ I。實(shí)施例2引物設(shè)計(jì)根據(jù)GenBank中發(fā)表的豬Kobu病毒的3D基因序列(ΑΒ624488)，利用Primer5. O軟件設(shè)計(jì)一對(duì)引物，用設(shè)計(jì)的引物可以擴(kuò)增3D基因部分片段(Kobu-3D)101bp。引物序列如下 上游引物PI : 5 ’ -GGACCCAGACACTTACGAACA-3 ’下游引物P2 :5 ’ -TCGGACCAGAATGGAAAGCA-3 ’引物由大連寶生物生物技術(shù)有限公司合成。實(shí)施例3豬Kobu病毒的3D基因RT-PCR擴(kuò)增取5μ1 RNA樣品加DEPC水補(bǔ)足11μ 1，然后加入反轉(zhuǎn)錄引物1μ I 70°C水浴lOmin，后迅速置冰上5min，稍離心；取出依次加入5XBuffer 4 μ I, dNTP 2μ I,RNasinhibiter I μ I,瞬時(shí)離心；42°C水浴2min,快速加入I μ I反轉(zhuǎn)錄酶，封口膜封好；42°C水浴60min，轉(zhuǎn)至70°C水浴15min，反轉(zhuǎn)錄結(jié)束；取反轉(zhuǎn)錄所得的cDNA為模版進(jìn)行PCR擴(kuò)增；PCR擴(kuò)增體系為Premix Ex Tap 12 μ 1，濃度為 O. 5 μ mol/L 引物P1、P2各O. 5 μ 1，cDNA 1μ 1，最后用滅菌的雙蒸水補(bǔ)至25μ I ;PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?1)95°C 預(yù)變性 5min ；(2) 95°C變性50s、55°C退火50s、72°C延伸lmin，此步驟為I個(gè)循環(huán)，共35個(gè)循環(huán)；(3) 72O 延伸 IOmin ;取5μ I PCR產(chǎn)物用I %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR結(jié)果，結(jié)果顯示擴(kuò)增出一條片段大小為IOlbp特異性條帶(如圖I所示)，按DNA凝膠回收試劑盒(北京天跟生物技術(shù)有限公司)說(shuō)明書(shū)回收PCR產(chǎn)物。實(shí)施例4豬Kobu病毒的3D基因的克隆與鑒定(I)將回收純化后PCR產(chǎn)物與PMDT19 simple載體相連，連接反應(yīng)體系為solution I5. 0 μ I
純化PCR產(chǎn)物I. O μ I PMDT19 simple vector 0. 5 μ I
ddH203. 5 μ
總體積10 μ I 將上述反應(yīng)體系混勻后4°C連接過(guò)夜，連接產(chǎn)物直接用于轉(zhuǎn)化；(2)取100 μ 1DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，加入連接產(chǎn)物5 μ 1，冰浴30min，42°C熱應(yīng)激90s，冰浴5min，加入950 μ I不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基，37°C 250r/min振蕩培養(yǎng)50min，8000rpm離心5min,棄上清液,加入200 μ I液體培養(yǎng)基重懸沉淀,再加入42 μ I IPTG (mg/mL)和42 μ ΙΧ-gal (20mg/mL)，混勻，均勻涂布于含有60 μ g/mLAmp的LB固體平板上，37 °C培養(yǎng)12h ；(3)挑選單菌落，接入含50 μ g/mL Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37 °C過(guò)夜培養(yǎng)，采用質(zhì)粒提取試劑盒(北京天跟生物技術(shù)有限公司)，提取質(zhì)粒，以提取的質(zhì)粒為模版進(jìn)行PCR鑒定，并用I %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR結(jié)果，去PCR驗(yàn)證正確的陽(yáng)性質(zhì)粒送大連寶生物有限公司測(cè)序鑒定，將測(cè)序驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒命名為PMDT-K0BU。實(shí)施例5標(biāo)準(zhǔn)品模版的制備挑選測(cè)序正確的陽(yáng)性克隆，接入含50 μ g/mL Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37°C過(guò)夜培養(yǎng)，用堿裂解法提取重組質(zhì)粒PMDT-K0BU，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)并計(jì)算質(zhì)粒濃度，按下面公式計(jì)算拷貝數(shù)基因模版拷貝數(shù)=DNA濃度/DNA分子量X 6. 02 X IO23經(jīng)計(jì)算得PMDT-K0BU質(zhì)粒的拷貝數(shù)，根據(jù)得到的結(jié)果，將重組質(zhì)粒進(jìn)行10倍倍比稀釋?zhuān)玫綕舛葹?I X IO7,1 X IO6,1 X IO5,1 X IO4,1 X IO3,1 X IO2,1 X IO1 拷貝數(shù) / 微升的重組質(zhì)粒，將其作為標(biāo)準(zhǔn)品模版；實(shí)施例6SYBR Green I實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)(I)分別取濃度為 I X IO7,1 X IO6,1 X IO5,1 X IO4,1 X IO3,1 X IO2,1 X IO1 拷貝數(shù) /
微升的重組質(zhì)粒為模版進(jìn)行SYBR Green I實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增，得到擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)曲線、標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖2及圖3所示，標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)R2為O. 992，標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率為-3. 537，擴(kuò)增效率為91. 8%0其中PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為上游引物O. 5 μ 1，下游引物O. 5 μ 1，SYBR PremixExTapII聚合酶10 μ 1，模版I μ 1，滅菌去離子水8 μ I ;PCR反應(yīng)程序?yàn)?1)95°C 預(yù)變性 5min ；(2)95°C變性10s、55°C退火15s、72°C延伸15s，此步驟為一個(gè)循環(huán)，共45個(gè)循環(huán)；當(dāng)反應(yīng)結(jié)束后先加熱至95°C，然后降至55°C，開(kāi)始以O(shè). 5°C /s遞增至95°C檢測(cè)熒光信號(hào)得出擴(kuò)增產(chǎn)物的溶解曲線，如圖4所示，標(biāo)準(zhǔn)品的溶解溫度都在78-79°C之間；(3)選取豬Kobu病毒同一濃度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品模版進(jìn)行SYBR Green I實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)，驗(yàn)證此方法的重復(fù)性與穩(wěn)定性，結(jié)果顯示如圖5所示，兩次試驗(yàn)所得的S曲線相似，其Ct值十分接近，說(shuō)明本方法具有良好的重復(fù)性與穩(wěn)定性；(4)將已計(jì)算出拷貝數(shù)的質(zhì)粒做10倍倍比稀釋?zhuān)M(jìn)行敏感性試驗(yàn)，結(jié)果顯示，濃度為10拷貝/微升時(shí)，仍可以得到S型熒光曲線；(5) SYBR Green I實(shí)時(shí)定量PCR體系中分別加入豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、豬流行性腹瀉病毒(PEV)、豬偽狂犬病毒(PRV)、豬瘟病毒(CSFV)、豬藍(lán)耳病毒(PRRSV)核酸作為陽(yáng)性對(duì)照，同時(shí)以水作為陰性對(duì)照，驗(yàn)證此方法的特異性，試驗(yàn)結(jié)果如圖6所示，陽(yáng)性對(duì)照及陰性對(duì)照均無(wú)S型曲線，只有以重組質(zhì)粒PMDT-K0BU為模版的PCR擴(kuò)增，有S型曲線，說(shuō)明本方法具有很好的特異性。
應(yīng)當(dāng)理解的是，對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，可以根據(jù)上述說(shuō)明加以改進(jìn)或變換，而所有這些改進(jìn)和變換都應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種用于檢測(cè)豬KobU病毒的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，檢測(cè)50個(gè)樣品的試劑盒組成如下試劑 A TRIZ0L 20ml、氣仿 5ml、異丙酉享 12. 511^751% 乙醇 10ml、RNasa-free 水 Iml ；試劑 B :5XPrimeScript Buffer 100 μ I、PrimeScript RT Enzyme Mix I 25 μ I、OligodT Primer 25 μ I、Random 6 mers 100 μ I、RNase Free dH20 250 μ I ；試劑 C :上游引物 Pl 25 μ I、下游引物 P2 25 μ I, SYBR Green I 染料 500 μ I、ddH20160μ I ；上游引物 Pl :5’ -GGACCCAGACACTTACGAACA-3’ ；下游引物 P2 :5’ -TCGGACCAGAATGGAAAGCA-3’。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種用于檢測(cè)豬Kobu病毒的檢測(cè)試劑盒，檢測(cè)50個(gè)樣品的試劑盒組成如下試劑ATRIZOL 20ml、氯仿5ml、異丙醇12.5ml、75％乙醇10ml、RNasa-free水1ml；試劑B5×PrimeScript Buffer 100μl、PrimeScript RT Enzyme Mix I 25μl、Oligo dT Primer 25μl、Random 6 mers 100μl、RNase Free dH2O 250μl；試劑C上游引物P1 25μl、下游引物P2 25μl、SYBR Green I染料500μl、ddH2O 160μl；上游引物P15’-GGACCCAGACACTTACGAACA-3’；下游引物P25’-TCGGACCAGAATGGAAAGCA-3’。利用本試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增曲線呈現(xiàn)出良好的S型，只出現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物特異性的單個(gè)峰，產(chǎn)物的Tm值都在78-79℃之間，說(shuō)明沒(méi)有引物二聚體及非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)；檢測(cè)的靈敏度可達(dá)10拷貝/微升，且具有很好的重復(fù)性。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102925586SQ20121027160
公開(kāi)日2013年2月13日 申請(qǐng)日期2012年8月2日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月2日
發(fā)明者徐志文, 李雪梅, 朱玲, 劉孟良, 周遠(yuǎn)成 申請(qǐng)人:四川農(nóng)業(yè)大學(xué), 四川川嬌生態(tài)豬業(yè)股份有限公司