專(zhuān)利名稱(chēng)：一種啟動(dòng)子及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
大豆原產(chǎn)我國(guó)，豆科大豆屬一年生草本植物，是世界上廣泛栽培的重要的糧食和油料作物，干旱、鹽堿等環(huán)境脅迫對(duì)大豆的生長(zhǎng)發(fā)育具有重要影響，嚴(yán)重時(shí)會(huì)造成大豆大規(guī)模減產(chǎn)。解析大豆抵抗逆境的分子機(jī)制，培育耐逆性強(qiáng)的大豆品種是目前大豆育種的主要目標(biāo)之一。目前，應(yīng)用基因工程育種已經(jīng)成為增強(qiáng)作物耐逆性的重要手段。高等植物在應(yīng)答環(huán)境脅迫時(shí)啟動(dòng)了多種應(yīng)答網(wǎng)絡(luò)，目前已成為提高大豆產(chǎn)量及保證農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要途徑之一。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種啟動(dòng)子及其應(yīng)用。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案如下。—種啟動(dòng)子，其具有序列表中SEQ ID NO :2所不的核苷酸序列。擴(kuò)增上述啟動(dòng)子的引物對(duì)，其序列分別如序列表中SEQ ID NO 7和SEQ ID NO 8所示。上述啟動(dòng)子的應(yīng)用，是在鹽脅迫誘導(dǎo)下驅(qū)動(dòng)目的基因表達(dá)；目的基因是⑶S基因；具體操作步驟如下A、啟動(dòng)子的克隆根據(jù)啟動(dòng)子的序列SEQ ID N0:2設(shè)計(jì)引物對(duì)，根據(jù)載體PCAMBIA3301的多克隆位點(diǎn)，引物末端分別引入EcoRI和BglII酶切識(shí)別位點(diǎn)，以CTAB法提取的大豆測(cè)序品種Williams82的DNA為模板，PCR擴(kuò)增啟動(dòng)子；引物序列為5，-CGGAATTC GATCTACTTAAGTCAATAAC-3，；5' -GAAGATCT CGTGGCGCTTCTTTTTTTTA-3’ ；PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行I %瓊脂糖凝膠電泳，采用上海生エ膠回收試劑盒回收純化1113bb左右的條帶；連T載體，挑陽(yáng)性克隆，測(cè)序；B、重組表達(dá)載體的構(gòu)建①提取含有正確測(cè)序的Promoter序列的T載體質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶EcoRI和BglII酶切，回收酶切產(chǎn)物；②用限制性內(nèi)切酶EcoRI和BglII酶切空載體PCAMBIA3301，回收載體骨架；③用T4連接酶將步驟I的酶切產(chǎn)物和步驟2的載體骨架連接；
④將步驟3的連接產(chǎn)物熱激轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5 a菌株，37°C過(guò)夜培養(yǎng)，挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序；測(cè)序結(jié)果表明，得到了重組質(zhì)粒pCAMBIA3301-P: AUS ；C、農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化采用液氮凍溶法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，具體操作如下a.取出凍存的200 U I感受態(tài)細(xì)胞，融化后加入5_10 U I質(zhì)粒DNA，輕彈管壁混勻，冰上放20-30min ；b.放入液氮中5min后取出，將管轉(zhuǎn)入37°C、5min融化后，加入800 u I LB液體培養(yǎng)基，28°C低速振蕩4-5h ；d. 10000rpm,30sec,去上清,加IOOii I LB液體培養(yǎng)基,懸浮菌體后涂板；e.置28°C培養(yǎng)至白色轉(zhuǎn)化子長(zhǎng)出，用于毛狀根的轉(zhuǎn)化； D、農(nóng)桿菌K599介導(dǎo)的毛狀根轉(zhuǎn)化以大豆品種吉林小粒I號(hào)為材料，取種子材料用氯氣消毒10小時(shí)后,在B5培養(yǎng)基上萌發(fā)5天，待子葉剛要張開(kāi)時(shí)切下子葉，在子葉節(jié)處縱橫切割數(shù)刀，浸在活化的農(nóng)桿菌K599中侵染30min后，將外植體轉(zhuǎn)至1/2MS培養(yǎng)基上共培生長(zhǎng)3天后，再轉(zhuǎn)至1/2MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)毛狀根，7天后，毛狀根長(zhǎng)出，取根進(jìn)行⑶S染色分析；E、脅迫處理及⑶S染色將轉(zhuǎn)基因毛狀根浸沒(méi)在1/2MS培養(yǎng)基、150mM NaCl中進(jìn)行脅迫處理；3，6，24h后進(jìn)行GUS染色，以1/2MS培養(yǎng)基中的毛狀根作為對(duì)照；F、結(jié)果⑶S染色結(jié)果表明，在NaCl處理?xiàng)l件下⑶S基因表達(dá)上調(diào)。采用上述技術(shù)方案所產(chǎn)生的有益效果在于實(shí)施例I的試驗(yàn)顯示將本發(fā)明提供的啟動(dòng)子插入到攜帯有GUS基因的載體PCAMBIA3301內(nèi)，能夠驅(qū)動(dòng)⑶S基因在大豆毛狀根中表達(dá)。


圖I為pCAMBIA3301-P: AUS的在鹽脅迫下的⑶S染色結(jié)果；l，Ck ;2，150mM NaCl處理。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例詳細(xì)說(shuō)明了本發(fā)明。本發(fā)明所使用的各種原料及各項(xiàng)設(shè)備均為常規(guī)市售產(chǎn)品，均能夠通過(guò)市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)直接獲得。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。本發(fā)明的基因來(lái)源于大豆屬大豆。實(shí)施例I(I)啟動(dòng)子的克隆根據(jù)基因的啟動(dòng)子序列(見(jiàn)SEQ ID NO 2)設(shè)計(jì)引物對(duì)，根據(jù)載體pCAMBIA3301多克隆位點(diǎn)，引物末端分別引入EcoRI和BglII酶切識(shí)別位點(diǎn)，以CTAB法提取的大豆測(cè)序品種Williams82的DNA為模板，PCR擴(kuò)增基因的啟動(dòng)子；引物序列為
5，-CGGAATTC GATCTACTTAAGTCAATAAC-3，(SEQ ID NO :7);5’-GAAGATCT CGTGGCGCTTCTTTTTTTTA-3’ (SEQ ID NO :8);PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行I %瓊脂糖凝膠電泳，采用上海生エ膠回收試劑盒回收純化1113bb左右的條帶； T載體(pMD19-T)，挑陽(yáng)性克隆，測(cè)序；
(2)重組表達(dá)載體的構(gòu)建①提取含有正確測(cè)序的Promoter序列的T載體質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶EcoRI和BglII酶切，回收酶切產(chǎn)物；②用限制性內(nèi)切酶EcoRI和BglII酶切空載體pCAMBIA3301，回收載體骨架；③用T4連接酶將步驟I的酶切產(chǎn)物和步驟2的載體骨架連接；④將步驟3的連接產(chǎn)物熱激轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5 a菌株，37°C過(guò)夜培養(yǎng)，挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序；測(cè)序結(jié)果表明，得到了重組質(zhì)粒pCAMBIA3301-P: AUS ；(3)農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化采用液氮凍溶法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，具體操作如下a.取出凍存的200 U I感受態(tài)細(xì)胞，融化后加入5-10 U I質(zhì)粒DNA，輕彈管壁混勻，冰上放20-30min ；b.放入液氮中5min后取出，將管轉(zhuǎn)入37°C (5min)融化后,加入800 ii ILB (無(wú)抗性)液體培養(yǎng)基，28°C低速振蕩(150rpm)4-5h ；d. IOOOOrpm, 30sec,去上清,加IOOii I LB液體培養(yǎng)基,懸浮菌體后涂板(含50mg/ml卡那霉素);e.置28°C培養(yǎng)至白色轉(zhuǎn)化子長(zhǎng)出，用于毛狀根的轉(zhuǎn)化；(4)農(nóng)桿菌K599介導(dǎo)的毛狀根轉(zhuǎn)化以大豆品種吉林小粒I號(hào)為材料，取種子材料用氯氣消毒10小時(shí)后,在B5培養(yǎng)基(培養(yǎng)基配方2%蔗糖，0. 8 瓊脂粉(sigma)，I XGAMB0RG B-5BASAL (Phyto TechnologyLaboratories,貨號(hào)G398),pH調(diào)至5. 7左右；)上萌發(fā)5天,待子葉剛要張開(kāi)時(shí)切下子葉，在子葉節(jié)處縱橫切割數(shù)刀，浸在活化的農(nóng)桿菌K599中侵染30min (0D :0. 6左右)后，將外植體轉(zhuǎn)至1/2MS培養(yǎng)基(培養(yǎng)基配方2%蔗糖，0. 8瓊脂粉(sigma)，0. 5XMURA SHIGE & SK00GBASAL MEDIOMw ハQTAMINS (Phyto Technology Laboratories，貨號(hào)G519)，pH 調(diào)至 5. 7 左右；)上共培生長(zhǎng)3天后，再轉(zhuǎn)至1/2MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)毛狀根，7天后，毛狀根長(zhǎng)出，取根進(jìn)行GUS染色分析；(5)⑶S染液的配制首先配制⑶S反應(yīng)緩沖液Tris Buffer，其中包括IOOmM Tris和50mM NaCl以濃鹽酸調(diào)pH至7. 4 ;然后以Tris buffer配制0. 5mM K3 [Fe (CN)6]溶液。按lmg/ml的濃度稱(chēng)取x-glu (5-溴-4-氯-3-卩引哚葡萄糖醒酸苷),按照姆mg加入10 ii I DMSO(ニ甲基亞砜)的比例溶解x-glu,加入Tris buffer配制的0. 5mM K3[Fe (CN)6]溶液定容,可加入幾滴TritonX-IOO以增強(qiáng)染色效果。迅速分裝后于_20°C避光保存；( 6 )脅迫處理及⑶S染色將轉(zhuǎn)基因毛狀根浸沒(méi)在1/2MS培養(yǎng)基，150mM NaCl中進(jìn)行脅迫處理3，6，24h后進(jìn)行GUS染色，以1/2MS培養(yǎng)基中的毛狀根作為對(duì)照；(7)結(jié)果
結(jié)果如圖I所示，表明在NaCl處理?xiàng)l件下⑶S基因表達(dá)上調(diào)；150mM NaCl處理3h后⑶S基因表達(dá)上調(diào)。
上述描述僅作為本發(fā)明可實(shí)施的技術(shù)方案提出，不作為對(duì)其技術(shù)方案本身的単一限制條件。
權(quán)利要求
1.一種啟動(dòng)子，其特征在干其具有序列表中SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列。
2.擴(kuò)增權(quán)利要求I所述啟動(dòng)子的引物對(duì)，其特征在于兩條引物的序列分別如序列表中 SEQ ID NO 7 和 SEQ ID NO 8 所示。
3.權(quán)利要求I所述啟動(dòng)子的應(yīng)用，其特征在于所述應(yīng)用是在鹽脅迫誘導(dǎo)下驅(qū)動(dòng)目的基因表達(dá)；所述目的基因是⑶S基因。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于 A、啟動(dòng)子的克隆 根據(jù)啟動(dòng)子的序列SEQ ID NO :2設(shè)計(jì)引物對(duì)，根據(jù)載體pCAMBIA3301的多克隆位點(diǎn)，弓丨物末端分別引入EcoRI和BglII酶切識(shí)別位點(diǎn)，以CTAB法提取的大豆測(cè)序品種Williams82的DNA為模板，PCR擴(kuò)增啟動(dòng)子； 引物序列為 . 5’-CGGAATTC GATCTACTTAAGTCAATAAC-3’ ；.5' -GAAGATCT CGTGGCGCTTCTTTTTTTTA-3’ ； PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行I %瓊脂糖凝膠電泳，采用上海生エ膠回收試劑盒回收純化1113bb左右的條帶；連T載體,挑陽(yáng)性克隆,測(cè)序； B、重組表達(dá)載體的構(gòu)建 ①提取含有正確測(cè)序的Promoter序列的T載體質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶EcoRI和BglII酶切，回收酶切產(chǎn)物； ②用限制性內(nèi)切酶EcoRI和BglII酶切空載體PCAMBIA3301，回收載體骨架； ③用T4連接酶將步驟I的酶切產(chǎn)物和步驟2的載體骨架連接； ④將步驟3的連接產(chǎn)物熱激轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5a菌株，37°C過(guò)夜培養(yǎng)，挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序；測(cè)序結(jié)果表明，得到了重組質(zhì)粒PCAMBIA3301-P: AUS ； C、農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化 采用液氮凍溶法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，具體操作如下 a.取出凍存的200u I感受態(tài)細(xì)胞，融化后加入5-10 u I質(zhì)粒DNA，輕彈管壁混勻，冰上放 20_30min ； b.放入液氮中51^11后取出，將管轉(zhuǎn)入37で、5111111融化后，加入800111LB液體培養(yǎng)基，.28 °C低速振蕩4-5h ； d.10000 rpm，30sec，去上清，加IOOyl LB液體培養(yǎng)基，懸浮菌體后涂板； e.置28°C培養(yǎng)至白色轉(zhuǎn)化子長(zhǎng)出，用于毛狀根的轉(zhuǎn)化； D、農(nóng)桿菌K599介導(dǎo)的毛狀根轉(zhuǎn)化 以大豆品種吉林小粒I號(hào)為材料，取種子材料用氯氣消毒10小時(shí)后，在B5培養(yǎng)基上萌發(fā)5天，待子葉剛要張開(kāi)時(shí)切下子葉，在子葉節(jié)處縱橫切割數(shù)刀，浸在活化的農(nóng)桿菌K599中侵染30min后，將外植體轉(zhuǎn)至1/2MS培養(yǎng)基上共培生長(zhǎng)3天后，再轉(zhuǎn)至1/2MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)毛狀根，7天后，毛狀根長(zhǎng)出，取根進(jìn)行⑶S染色分析； E、脅迫處理及⑶S染色 將轉(zhuǎn)基因毛狀根浸沒(méi)在1/2MS培養(yǎng)基、150mM NaCl中進(jìn)行脅迫處理；3，6，24h后進(jìn)行GUS染色，以1/2MS培養(yǎng)基中的毛狀根作為對(duì)照； F、結(jié)果⑶S染色結(jié)果表明，在NaCl處理 條件下⑶S基因表達(dá)上調(diào)。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種啟動(dòng)子，其具有序列表中SEQ ID NO2所示的核苷酸序列。試驗(yàn)顯示，該啟動(dòng)子在NaCl處理?xiàng)l件下能夠驅(qū)動(dòng)GUS基因表達(dá)上調(diào)。
文檔編號(hào)C12N15/82GK102757967SQ201210271820
公開(kāi)日2012年10月31日 申請(qǐng)日期2011年6月10日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月10日
發(fā)明者李霞, 鄒艷敏 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所