專利名稱：水稻轉(zhuǎn)錄因子Os05g41070基因的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于遺傳工程領(lǐng)域，具體地說，涉及水稻轉(zhuǎn)錄因子0s05g41070基因的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
在長日照植物(LDP)擬南芥(Baurle和 Dean, 2006; Imaizumi 和 Kay, 2006)和短日照植物(SDP)水稻(Izawa，2007;Tuji等，2008)中，開花信號(hào)途徑已得到了廣泛的研究。GI-CO-FT是控制水稻開花保守的途徑(Yano等，2000; Kojima等，2002; Hayama等，2002)。Hd3a是水稻中FT的同源基因，它受到一個(gè)B-型響應(yīng)調(diào)控子Ehdl的誘導(dǎo)，該途徑在短日照條件下獨(dú)立于Hdl基因(Doi等，2004)。0sMADS51受OsGI的調(diào)控，該作用位于Ehdl的上 游(Kim等，2007)。相反，在長日照條件下，Hdl抑制Hd3a的表達(dá)而推遲水稻開花(Hayama等，2003)。最新研究表明，Hd3a與14-3-3蛋白形成復(fù)合體后轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)，與轉(zhuǎn)錄因子FDl結(jié)合形成三聚體FAC (f lorigen activation complex),誘導(dǎo)0sMADS15的轉(zhuǎn)錄,從而導(dǎo)致水稻開花。VP16最早在動(dòng)物病毒基因中發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用到植物中，主要用于植物基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研究中。轉(zhuǎn)錄因子在體內(nèi)的作用大體上可以分成兩種一種為轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，另一種為轉(zhuǎn)錄抑制子。當(dāng)轉(zhuǎn)錄因子和VP16功能域基序融合之后，它就會(huì)增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄因子的功能，從而在轉(zhuǎn)基因植株中出現(xiàn)更明顯的表型變化。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供水稻轉(zhuǎn)錄因子0s05g41070基因的應(yīng)用。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明首先提供一種融合蛋白，該融合蛋白為0s05g41070-Linker- (VP16) n 或(VP16) n-Linker_0s05g41070 ;其中，η 為彡 I 的整數(shù);Linker由1 20個(gè)柔性氨基酸串聯(lián)而成(例如，GGGGG, GPPPG,或Gatway載體重組位點(diǎn)編碼的氛基酸序列DPAFLYKVVPR) ；VP16為來自單純抱疫病毒(Herpes simplex virus)的VP16蛋白；0s05g41070為水稻轉(zhuǎn)錄因子0s05g41070，其氨基酸序列如SEQ ID No. I所示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。優(yōu)選地，前述融合蛋白中η為4。其中，(VP16)4即VP64，是由4個(gè)VP16功能域基序融合在一起組成的增強(qiáng)子，其氨基酸序列如SEQID No. 2所示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。更優(yōu)選地，前述融合蛋白為0s05g41070-Linker_ (VP16)4。本發(fā)明還提供編碼所述融合蛋白的基因，以及在嚴(yán)格條件下，可與該基因的核苷酸序列雜交的核苷酸序列；其中，所述嚴(yán)格條件為65°C，在O. I X SSPE或O. 1XSSC、0. 1%SDS的溶液中雜交并洗膜。本發(fā)明還提供含有編碼所述融合蛋白的基因的載體。所述載體為任一種可引導(dǎo)外源基因在宿主中表達(dá)的載體。優(yōu)選地，所述載體為植物雙元表達(dá)載體(例如，PCAMBIA1301)。在將本發(fā)明編碼所述融合蛋白的基因構(gòu)建到植物表達(dá)載體中時(shí)，可在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前添加任一種強(qiáng)啟動(dòng)子(例如，玉米強(qiáng)啟動(dòng)子Ubiquitin)或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。此外，在將本發(fā)明編碼所述融合蛋白的基因構(gòu)建到植物表達(dá)載體中時(shí)，還可以使用增強(qiáng)子，且這些增強(qiáng)子區(qū)域必須與編碼序列的閱讀框相同，以確保整條序列的翻譯。本發(fā)明還提供含有編碼所述融合蛋白的基因的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。 本發(fā)明還提供含有編碼所述融合蛋白的基因的工程菌。本發(fā)明還提供編碼所述融合蛋白的基因在推遲水稻抽穗、延長生育期中的應(yīng)用。
本發(fā)明進(jìn)一步提供水稻轉(zhuǎn)錄因子0s05g41070基因的應(yīng)用，其是將水稻轉(zhuǎn)錄因子0s05g41070基因的⑶S序列(完整翻譯區(qū))構(gòu)建到4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子激活基序VP16的上游，轉(zhuǎn)化植物，篩選并最終獲得轉(zhuǎn)基因植物。前述的應(yīng)用，其是將水稻轉(zhuǎn)錄因子0s05g41070基因的CDS序列通過Gateway系統(tǒng)構(gòu)建到4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子激活基序VP16的上游，轉(zhuǎn)化水稻(例如，水稻品種‘kitaake’)，從而推遲轉(zhuǎn)基因水稻的抽穗期、延長生育期。其中，水稻轉(zhuǎn)錄因子0s05g41070基因的⑶S序列如SEQ IDNo. 3所示,4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子激活基序VP16的核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示。攜帶有編碼所述融合蛋白的基因的表達(dá)載體可通過使用Ti質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、微注射、電穿孔等常規(guī)生物技術(shù)方法導(dǎo)入植物細(xì)胞中(Weissbach，1998，Method for Plant Molecular Biology VIII, Academy Press, New York,第 411-463 頁；Geiserson 和 Corey,1998, Plant Molecular Biology, 2nd Edition)。本發(fā)明首次利用轉(zhuǎn)錄因子激活基序VP64 (即4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子激活基序VP16)與水稻轉(zhuǎn)錄因子0s05g41070基因融合構(gòu)建得到組成型轉(zhuǎn)錄因子，并轉(zhuǎn)化到農(nóng)作物，如水稻中，從而推遲轉(zhuǎn)基因水稻的抽穗期、延長生育期。對(duì)于詳細(xì)闡明水稻抽穗調(diào)控的分子機(jī)理，具有重要的理論價(jià)值，并且可以通過轉(zhuǎn)基因手段，延長水稻生育期，改善水稻對(duì)不同生態(tài)區(qū)的適應(yīng)能力，因此在生產(chǎn)中同樣具有重要意義。


圖I為本發(fā)明實(shí)施例I中cVP64-bar_asRED載體圖譜。圖2為本發(fā)明實(shí)施例I中ubi:0s05g41070-VP64載體圖譜。圖3為本發(fā)明實(shí)施例3中Western Blot檢測(cè)轉(zhuǎn)基因陽性水稻株系的結(jié)果；其中，WT為野生型水稻‘kitaake’，bzip74_VP64為0s05g41070_VP64轉(zhuǎn)基因水稻株系。圖4為本發(fā)明實(shí)施例4中0s05g41070-VP64轉(zhuǎn)基因水稻株系的表型分析結(jié)果；其中，WT為野生型水稻‘kitaake’，bzip74_VP64為0s05g41070_VP64轉(zhuǎn)基因水稻株系。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。實(shí)施例I水稻轉(zhuǎn)錄因子0s05g41070基因的獲得及植物表達(dá)載體的構(gòu)建登錄 http://rice. plantbiology. msu. edu/analyses_search_locus. shtml 網(wǎng)站，找到水稻轉(zhuǎn)錄因子0s05g41070基因，根據(jù)其序列設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物0s05g41070-F :5’-CAAAAAAGCAGGCTTCATGATTCAGGCAATGGCTTCGCA-3’
0s05g41070-R:5’-CAAGAAAGCTGGGTCGAAGGCGGCCGAGCTTGTTCGCCT-3’以水稻‘日本晴’葉片為材料，TRIzol法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄得cDNA，反應(yīng)步驟如下(1)在冰上向不含核酸酶的PCR反應(yīng)管中依次加入下列物質(zhì)總RNA
6μ I (O. lng-5 μ g), Oligo (dT) 18 引物 1μ 1，不含核酸酶的 ddH20 5 μ 1，置于 PCR 儀中65°C反應(yīng)5min ； (2)然后再加入下列物質(zhì)5X反應(yīng)緩沖液4 μ 1，RNase抑制劑I μ 1，IOmMdNTP2y I, M-Mμ IV反轉(zhuǎn)錄酶I μ 1，輕輕混勻，在PCR儀中45°C反應(yīng)60min ; (3) PCR儀中，700C 5min，終止反應(yīng)。以總cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為反應(yīng)緩沖液25 μ 1，dNTP 4 μ I, ddH2017. 5μ I, Taq DNA 聚合酶 O. 5 μ 1，反應(yīng)程序?yàn)闊釂?dòng) 98°C 10s，57°C 5s，72°C lmin,30個(gè)循環(huán)后，72°C延伸lOmin，最后25°C反應(yīng)結(jié)束。獲得水稻轉(zhuǎn)錄因子0s05g41070基因的CDS序列，其核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示。按照PrimeSTAR聚合酶擴(kuò)增體系和反應(yīng)程序進(jìn)行PCR。根據(jù)Gateway克隆技術(shù)的要求，此過程中包含兩輪PCR,第一輪PCR的引物用加部分adaptor attB接頭的引物，而第二輪的模板用第一輪的PCR產(chǎn)物，并且引物采用完整的adaptor attB引物。將PCR·產(chǎn)物克隆到連接PDONR克隆載體上，經(jīng)測(cè)序鑒定得到與目的基因完全相同的序列。通過LR反應(yīng)將0s05g41070基因構(gòu)建到植物表達(dá)載體cVP64-bar_asRED (圖I)上，獲得載體ubi:0s05g41070-VP64 (圖 2，載體全序列如 SEQ ID No. 6 所示)。其中，植物表達(dá)載體cVP64-bar_asRED的構(gòu)建過程為以雙元表達(dá)載體pCAMBIA1300左右邊界包含的序列為骨架序列，通過體外重組，將ubipromoter_Gateway-VP64 表達(dá)單兀、35S promoter-asRED 表達(dá)單兀和 35S promoter-bar 表達(dá)單元與之融合構(gòu)建得到，載體cVP64-bar_asRED的全序列如SEQ ID No. 5所示。實(shí)施例2轉(zhuǎn)基因水稻植株的獲得取水稻‘kitaake’成熟種子，人工或機(jī)械脫殼，挑選飽滿光潔無菌斑的種子經(jīng)消毒之后接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。選擇外觀良好，生長力好的水稻愈傷組織為受體材料，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將ubi :0s05g41070-VP64轉(zhuǎn)入水稻愈傷組織中，用含有100 μ M的乙酰丁香酮和0. D.值為0. 7的農(nóng)桿菌的AAM轉(zhuǎn)化液進(jìn)行轉(zhuǎn)化，將轉(zhuǎn)化液浸泡過的愈傷組織置于共培養(yǎng)基上進(jìn)行共培養(yǎng)，25°C暗培養(yǎng)3d后置于篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)約30d,每IOd繼代一次。然后將篩出的抗性愈傷轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上分化約20d，每IOd繼代一次。將分化出綠色小苗的抗性愈傷轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上生根，待約7d長出發(fā)達(dá)根系后煉苗，并計(jì)算轉(zhuǎn)化所獲轉(zhuǎn)基因苗數(shù)。煉苗7d后轉(zhuǎn)移至大田生長。用Basta篩選轉(zhuǎn)基因水稻，長出4片幼葉后開始噴灑Basta(l: 1000，v:v)，隔I天噴I次，共噴灑3次。共獲得轉(zhuǎn)基因水稻20株。其中，誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為N6大量+B5微量+NB有機(jī)+鐵鹽+銅鈷母液+2. 5mg/L2，4D+0. 6g/L酸水解酪蛋白+2. 878g/L脯氨酸+0. 5g/L谷氨酰胺+30g/L蔗糖，以水配制，調(diào)pH至5. 8^5. 9后加入植物凝膠4g/L。共培養(yǎng)基配方為N6大量+B5微量+NB有機(jī)+鐵鹽+2. 5mg/L2, 4D+0. 5g/L谷氨酰胺+0. 6g/L酸水解酪蛋白+10g/L葡萄糖+30g/L鹿糖，以水配制,調(diào)pH至5. 2后加入植物凝膠4g/L。滅菌后，50°C左右加入AS (乙酰丁香酮)10(T200yg/mL。篩選培養(yǎng)基配方為N6大量+B5微量+NB有機(jī)+鐵鹽+銅鈷母液+2. 5mg/L2, 4D+0. 6g/L酸水解酪蛋白+2. 878g/L脯氨酸+0. 5g/L谷氨酰胺+30g/L蔗糖，以水配制，調(diào)pH至5. 8^5. 9后加入植物凝膠4g/L。滅菌后加入35mg/L潮霉素(購自上海紐津生物技術(shù)有限公司)或5mg/L Bialaphos (購自北京拜爾迪生物技術(shù)公司)。分化培養(yǎng)基配方為MS無機(jī)+MS-B5微量+MS有機(jī)+鐵鹽+MS-銅鈷母液+0. 05mg/L NAA+2. Omg/L Kinetin (激動(dòng)素)+30g/L山梨醇+2g/L水解酪蛋白+30g/L蔗糖，以水配制，調(diào)pH至5. 8^5. 9后加入植物凝膠4g/L。實(shí)施例3Western Blot檢測(cè)轉(zhuǎn)基因水稻中融合蛋白0s05g41070_VP64的表達(dá)為檢測(cè)0s05g41070_VP64基因在T2代轉(zhuǎn)基因水稻中的過表達(dá)情況，利用VP64抗體對(duì)其在蛋白質(zhì)水平上進(jìn)行鑒定，經(jīng)過SDS-PAGE蛋白電泳一免疫印記一免疫熒光反應(yīng)，Western Blot鑒定結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因植株存在目的蛋白，而野生型未雜出條帶(圖3)。具體的Western Blot實(shí)驗(yàn)流程如下將適量樣品放入液氮冰凍后研磨成粉末，加入適量上樣緩沖液混勻，12000rpm離 心10分鐘;取5 μ I上清加樣，以90V電壓SDS-PAGE電泳30分鐘后，120V電泳60-90分鐘，當(dāng)溴酚藍(lán)到達(dá)凝膠的底端即可停止電泳；電泳后采用半干轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)膜，并用麗春紅染色液對(duì)膜進(jìn)行染色，觀察轉(zhuǎn)膜效果；轉(zhuǎn)膜完畢后，將膜放入含5%的脫脂奶粉的PBST溶液中封閉室溫封閉60分鐘或4°C過夜；室溫下一抗(VP64抗體)孵育I小時(shí)或4°C孵育過夜,然后用PBST洗滌3次，每次5分鐘；室溫下二抗(羊抗兔，購自Abmart，貨號(hào)M21002S)孵育I小時(shí)，然后用PBST洗滌3次，每次5分鐘；在膜上加入底物，進(jìn)行曝光。其中，VP64抗體是由艾比瑪特生物醫(yī)藥(上海)有限公司根據(jù)VP64的氨基酸序列合成多肽作為特異抗原而制備的兔源多抗。實(shí)施例4轉(zhuǎn)基因水稻表型分析與野生型水稻‘kitaake’相比，0s05g41070-VP64轉(zhuǎn)基因水稻株系bzip74-VP64的抽穗期明顯推遲，野生型雖已抽穗，但轉(zhuǎn)基因株系的劍葉仍未完全抽出(圖4)。以上提供的實(shí)施例是將水稻轉(zhuǎn)錄因子0s05g41070基因的CDS序列通過Gateway系統(tǒng)構(gòu)建到4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子激活基序VP16的上游，轉(zhuǎn)化水稻品種‘kitaake’，從而推遲轉(zhuǎn)基因水稻的抽穗期、延長生育期。同樣地，將水稻轉(zhuǎn)錄因子0s05g41070基因的⑶S序列通過Gateway系統(tǒng)構(gòu)建到彡I個(gè)轉(zhuǎn)錄因子激活基序VP16的下游,或通過Gateway系統(tǒng)構(gòu)建到1 3個(gè)或4個(gè)以上轉(zhuǎn)錄因子激活基序VP16的上游，轉(zhuǎn)化水稻品種，也能夠達(dá)到推遲轉(zhuǎn)基因水稻的抽穗期、延長生育期的效果。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
權(quán)利要求
1.一種融合蛋白，其特征在于，該融合蛋白為Os05g41070-Linkei'- (VP16)n或(乂 16)n-Linker-0s05g41070 ； 其中，η為彡I的整數(shù)；Linker由廣20個(gè)柔性氨基酸串聯(lián)而成；VP16為來自單純皰疹病毒(Herpes simplex virus)的 VP16 蛋白;0s05g41070 為水稻轉(zhuǎn)錄因子 0s05g41070。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的融合蛋白，其特征在于，η為4。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，該融合蛋白為0s05g41070-Linker- (VP16)4。
4.編碼權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述融合蛋白的基因。
5.含有權(quán)利要求4所述基因的載體。
6.含有權(quán)利要求4所述基因的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。
7.含有權(quán)利要求4所述基因的工程菌。
8.權(quán)利要求4所述的基因在推遲水稻抽穗、延長生育期中的應(yīng)用。
9.水稻轉(zhuǎn)錄因子0s05g41070基因的應(yīng)用，其特征在于，其是將水稻轉(zhuǎn)錄因子0s05g41070基因的⑶S序列構(gòu)建到4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子激活基序VP16的上游，轉(zhuǎn)化植物，篩選并最終獲得轉(zhuǎn)基因植物。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，其是將水稻轉(zhuǎn)錄因子0s05g41070基因的⑶S序列通過Gateway系統(tǒng)構(gòu)建到4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子激活基序VP16的上游，轉(zhuǎn)化水稻，從而推遲轉(zhuǎn)基因水稻的抽穗期、延長生育期。
全文摘要
本發(fā)明涉及水稻轉(zhuǎn)錄因子Os05g41070基因的應(yīng)用，其是利用轉(zhuǎn)錄因子激活基序VP64(即4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子激活基序VP16)與水稻轉(zhuǎn)錄因子Os05g41070基因融合構(gòu)建得到組成型轉(zhuǎn)錄因子，并轉(zhuǎn)化到農(nóng)作物如水稻中，從而推遲轉(zhuǎn)基因水稻的抽穗期、延長生育期。對(duì)于詳細(xì)闡明水稻抽穗調(diào)控的分子機(jī)理，具有重要的理論價(jià)值，并且可以通過轉(zhuǎn)基因手段，延長水稻生育期，改善水稻對(duì)不同生態(tài)區(qū)的適應(yīng)能力，因此在生產(chǎn)實(shí)踐中同樣具有重要意義。
文檔編號(hào)C12N1/21GK102775498SQ20121027254
公開日2012年11月14日 申請(qǐng)日期2012年8月1日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月1日
發(fā)明者劉軍, 劉斌, 張春雨, 李宏宇, 林辰濤, 趙濤 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所