專利名稱：Pcr-焦磷酸法檢測副溶血弧菌的檢測引物、試劑盒和檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及PCR-焦磷酸法檢測副溶血弧菌的檢測引物、試劑盒和檢測方法。
背景技術(shù)：
副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus, VP)是一種引起食源性疾病的重要病原，在近年來沿海地區(qū)的食物中毒病例中，該菌已成為首要病原。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，已有用普通PCR或熒光PCR檢測VP的報道，雖然這些方法可達(dá)到快速、高通量的目的，但卻無法獲得分子診斷的黃金標(biāo)準(zhǔn)-基因序列，因此有出現(xiàn)假陽性的可能。副溶血性弧菌的分子檢測方面，以tdh基因為目的基因判斷其有無致病性非常實用，但tdh基因家族廣泛存在于人類致病性弧菌中，如大多數(shù)霍利斯弧菌，某些擬態(tài)弧菌，非01群霍亂弧菌等，因此，用tdh檢 測VP存在一定的局限性。以tlh為目的基因也可能出現(xiàn)同樣的情況，Robert Pillot等的研究發(fā)現(xiàn)，溶藻弧菌和副溶血性弧菌的同源性非常高，靶定tlh基因的引物不能用于兩者的鑒別。Ooci等評估了不同靶基因的副溶血性弧菌的PCR鑒定方法，指出toxR作為靶基因的PCR具有最高的準(zhǔn)確性，該基因可作為VP分子鑒別的參考方法。焦磷酸測序(pyrosequencing)技術(shù)是近年來發(fā)明的一項實時地進(jìn)行短片段DNA測序技術(shù)，其是一種基于合成的新型DNA測序技術(shù)，在特異引物的引導(dǎo)下，根據(jù)待測序列分別加入四種核苷酸，在延伸的過程中釋放焦磷酸，后者在ATP硫酸化酶和熒光酶的偶聯(lián)反應(yīng)中釋放熒光，通過檢測器檢測相應(yīng)的熒光強(qiáng)度，從而獲得檢測樣本中的核苷酸序列，是一種非常實用的短序列實時檢測技術(shù)，已應(yīng)用于臨床微生物的分型鑒定及耐藥監(jiān)測，其定量準(zhǔn)確、易于自動化、能實現(xiàn)高通量的大樣本的快速檢測，具有DNA測序法無法比擬的優(yōu)勢，由于該技術(shù)在DNA序列分析時不需要電泳和熒光標(biāo)記，直接測定測序引物后面的堿基序列，通過提供可靠的序列信息來確認(rèn)PCR產(chǎn)物，同時由于主要分析PCR產(chǎn)物雙鏈中的一條鏈的序列，避免了由于DNA鏈的二級結(jié)構(gòu)造成的人工假象，使測序結(jié)果更加準(zhǔn)確。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供簡便、快捷、準(zhǔn)確性高、特異性強(qiáng)的PCR-焦磷酸法檢測副溶血弧菌的檢測引物、試劑盒和檢測方法。本發(fā)明根據(jù)VP的toxR基因(GenBank: AB063113)，設(shè)計擴(kuò)增弓丨物和測序弓I物，建立了結(jié)合PCR-焦磷酸測序從DNA堿基序列水平上檢測VP的方法，從而實現(xiàn)了本發(fā)明的目的。本發(fā)明的PCR-焦磷酸法檢測副溶血弧菌的檢測引物，其特征在于，包括PCR引物和測序引物PCR 引物上游引物 F GAGATTCCGCTGGGTTTGTAA ；(如 SEQ ID NO. I 所示)下游引物R TGAACCAGAAGCGCCAGTAGTAC ；(如 SEQ ID NO. 2 所示)測序引物S AAATAACGCGTGGAAT (如 SEQ ID NO. 3 所示)。
本發(fā)明的第二個目的是提供PCR-焦磷酸法檢測副溶血弧菌的檢測試劑盒，包括DNA提取試劑，PCR反應(yīng)試劑，單鏈模板制備試劑，焦磷酸測序試劑，PCR引物和測序引物，其特征在于，所述的PCR引物和測序引物為PCR 引物上游引物 F GAGATTCCGCTGGGTTTGTAA ；(如 SEQ ID NO. I 所示)下游引物R TGAACCAGAAGCGCCAGTAGTAC ；(如 SEQ ID NO. 2 所示)測序引物S AAATAACGCGTGGAAT (如 SEQ ID NO. 3 所示)。本發(fā)明的第三個目的是提供非診斷目的的PCR-焦磷酸法檢測副溶血弧菌的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟(I)對樣品進(jìn)行增菌培養(yǎng)，提取增菌液中菌體的基因組DNA作為模板；
(2 )使用上述PCR弓丨物進(jìn)行PCR反應(yīng)，回收PCR產(chǎn)物，制備單鏈模版，然后應(yīng)用上述測序引物對PCR產(chǎn)物進(jìn)行焦磷酸測序，自測序引物3\端后的第一個堿基開始測序，測序引物后的34個堿基序列為CCAAGGATTCACAGCAGAAGCCACAGGTGCTT TT時，判斷樣品中含有副溶血弧菌。優(yōu)選，所述的PCR 反應(yīng)，其擴(kuò)增體系 50 μ L，PCR Mix Buffer 25 μ 1，Taq 酶 5 μ 1，MgCl2I μ I, 10 μ M上、下游引物各2 μ I, DNA模板I μ I,去離子水14 μ I,所述的PCR反應(yīng)條件為預(yù)變性 95°C 4min ；95°C 15s，65。。30s, ,72°C 30s，43 個循環(huán)；72°C 12min。本發(fā)明根據(jù)副溶血弧菌toxR基因(GenBank:NC_004603. I)序列中的保守區(qū)域，用PyroMark Assay Design軟件設(shè)計PCR引物和測序引物,建立了 PCR-焦磷酸測序,從DNA堿基序列水平上檢測副溶血弧菌的方法。本發(fā)明先對目標(biāo)片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，保證擴(kuò)增片段的特異性，再用擴(kuò)增產(chǎn)物制備單鏈模板，在測序引物的引導(dǎo)下進(jìn)行焦磷酸測序。檢測的所得喊基序列，用NCBI網(wǎng)站的BLAST功能反復(fù)比對時發(fā)現(xiàn)，toxR基因測序引物后的喊基序列具有良好的特異性，測序引物后34bp連續(xù)DNA序列為CCAAGGATTCACAGCAGAAGCCACAGGTGCTTTT的就可鑒定VP。試驗結(jié)果，PCR擴(kuò)增引物和測序引物表現(xiàn)出良好的特異性和準(zhǔn)確性，PCR擴(kuò)增試驗結(jié)果，20株VP均擴(kuò)增出大小137bp大小的DNA片段，而創(chuàng)傷弧菌等其他對照菌株未擴(kuò)增出DNA條帶。雖然一株大腸桿菌在137bp位置出現(xiàn)擴(kuò)增帶，但測序試驗結(jié)果判斷為非特異性擴(kuò)增。20株檢測的VP DNA堿基序列與測序引物后的堿基序列比對，100%匹配的堿基數(shù)分別為35bp-48bp，均超過需檢測的34個DNA堿基序列，而其他創(chuàng)傷弧菌等對照菌株未測出DNA堿基序列或檢測結(jié)果與測序引物后的序列不匹配。模擬樣品檢測結(jié)果，焦磷酸測序結(jié)果與傳統(tǒng)檢測方法一致，但在檢測周期上傳統(tǒng)方法需要培養(yǎng)、劃線分離、生化鑒定等，需要3d-4d，而焦磷酸測序方法增菌8h-10h、核酸提取、PCR擴(kuò)增和焦磷酸測序3h-4h，整個試驗llh-14h完成，簡便快捷，而且可通DNA堿基序列的水平上檢測VP，避免了單純PCR擴(kuò)增檢測易污染造成的假陽性結(jié)果，準(zhǔn)確性高，具有較好的應(yīng)用前景，能應(yīng)用于食品檢測中。


圖I是tox基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖，其中M:50bpmaker、l:VPATCC17802、2-20:VPl-VP19、21:去離子水；圖2是tox基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖，M:50bp makerU :VP ATCC17802、2:創(chuàng)傷弧菌、3:溶藻弧菌、4:海蛹弧菌、5:弗氏弧菌、6:最小弧菌、7:大腸桿菌、8:阪崎腸桿菌、9:痢疾志賀氏菌、10:小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、11 :塔氏弧菌、12:單增李斯特菌、13:去離子水；圖3是大腸桿菌焦磷酸測序結(jié)果圖；圖4是VP ATCC17802焦磷酸測序結(jié)果圖；圖5是VPl焦磷酸測序結(jié)果圖；圖6是VP2焦磷酸測序結(jié)果圖；圖7是VP3焦磷酸測序結(jié)果圖；圖8是VP4焦磷酸測序結(jié)果9是VP5焦磷酸測序結(jié)果圖；圖10是VP6焦磷酸測序結(jié)果圖；
圖11是VP7焦磷酸測序結(jié)果圖；圖12是VP8焦磷酸測序結(jié)果圖；圖13是VP9焦磷酸測序結(jié)果圖；圖14是VPlO焦磷酸測序結(jié)果圖；圖15是VPll焦磷酸測序結(jié)果圖；圖16是VP12焦磷酸測序結(jié)果圖；圖17是VP13焦磷酸測序結(jié)果圖；圖18是VP14焦磷酸測序結(jié)果圖；圖19是VP15焦磷酸測序結(jié)果圖；圖20是VP16焦磷酸測序結(jié)果圖；圖21是VP17焦磷酸測序結(jié)果圖；圖22是VP18焦磷酸測序結(jié)果圖；圖23是VP19焦磷酸測序結(jié)果圖；圖24是創(chuàng)傷弧菌焦磷酸測序結(jié)果圖。
具體實施例方式以下實施例是對本發(fā)明的進(jìn)一步說明，而不是對本發(fā)明的限制。實施例I :I材料和方法I. I菌株信息副溶血性弧菌菌株共20株，其中標(biāo)準(zhǔn)菌株I株，食品中分離的菌株19株，菌株信息見表I。陰性對照株11株，分別為創(chuàng)傷弧菌ATCC27562、溶藻弧菌CGMCCI. 1833、海蛹弧菌 CGMCC1. 1623、弗氏弧菌 CGMCC1. 1613、最小弧菌 CGMCC1. 1969、大腸桿菌ATCC25922、單增李斯特菌ATCC19115、阪崎腸桿菌ATCC29544、痢疾志賀氏菌NICPBP51252、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌CMCC52221，塔氏弧菌分離株。上述菌株來自中國普通微生物菌種保藏管理中心、中國藥品生物制品鑒定所、中國科學(xué)院南海水產(chǎn)研究所、遼寧出入境檢驗檢疫局技術(shù)中心和廣東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心。所有菌株均經(jīng)VITEK2和API試劑條進(jìn)行確證。表I :副溶血性弧菌菌株信息菌株編號樣品名菌株編號樣品名菌株編號樣m名菌株編號樣m名
VPl無頭凍蝦 VP2凍蝦仁 VP3熟風(fēng)尾蝦VP4凍蝦f:
VP5凍去頭!li卜 VP6凍蝦i W7無頭凍蝦VP8無頭凍蝦
VP9凍全蝦 VPlO蝦 VPll 珠江水VP12凍魚
VP13SF ΛΤ14無頭凍蝦 VPl 5 凍墨魚VP16冰蠔
VP17凍帶魚 VP18生蠔 VP19 生蠔ATCCl 7802標(biāo)準(zhǔn)菌株I. 2主要儀器和試劑焦磷酸測序PyroMark ID系統(tǒng)-瑞 典Biotage公司；PCR擴(kuò)增儀-PE9700型；核酸提取儀-日本PSS公司；PCR用Buffer、dNTP、瓊脂糖、PCR分子量標(biāo)記(50_500bp) Taq酶-寶生物工程(大連)有限公司；鏈親和素標(biāo)記磁珠(sepharosebeads) -GE. Healthcare公司；焦磷酸測序用酶、dNTP、結(jié)合緩沖液(Binding Buffer)、退火緩沖液(Annealing Buffer)、變性緩沖液(Denaturation Buffer)、洗漆緩沖液(WashingBuffer)等-QIAGEN上海辦事處；堿性蛋白胨水-北京陸橋有限公司。I. 3引物設(shè)計根據(jù)VP的toxR基因(GenBank:NC_004603. I)序列中的保守區(qū)域，用Py roMark Assay Design軟件設(shè)計PCR引物和測序引物，上游引物F :GAGATTCCGCTGGGTTTGTAA，下游引物 R TGAACCAGAAGCGCCAGTAGTAC,測序引物 S AAATAACGCGTGGAAT,擴(kuò)增片段為137bp，下游引物端標(biāo)記生物素，委托寶生物工程(大連)有限公司合成。I. 4模板制備所有菌株分別均用3%堿性蛋白胨水36°C培養(yǎng)8h_10h，取Iml菌懸液移入離心管，12000r/min離心5min去上清,用Iml去離子水漂浮沉淀，12000r/min離心3min去上清，重復(fù)兩次，最后加200 μ I去離子水在核酸提取儀上提取DNA，作為DNA模板用于PCR擴(kuò)增。I. 5PCR擴(kuò)增體系及電泳參數(shù)擴(kuò)增體系50 μ L, PCR Mix Buffer 25 μ 1，Taq酶
5μ I，MgCl21 μ I，10 μ M 上、下游引物各 2 μ I (上游引物 F GAGATTCCGCTGGGTTTGTAA,下游引物R TGAACCAGAAGCGCCAGTAGTAC), DNA模板I μ 1，去離子水14 μ I。循環(huán)參數(shù)為預(yù)變性950C 4min,95°C 15s，65。。30s, ,72°C 30s，43 個循環(huán)，72°C 12min，4°C保存。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物一
部分在2%瓊脂糖凝膠上電泳，另一部分用于焦磷酸測序。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果toxR基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)果，20株VP均擴(kuò)增出137bp大小的DNA片段(圖I),而創(chuàng)傷弧菌、溶藻弧菌、海蛹弧菌、弗氏弧菌、最小弧菌、阪崎腸桿菌、痢疾志賀氏菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、塔氏弧菌、單增李斯特菌未見擴(kuò)增條帶(圖2)。圖2觀察，第7泳道的大腸桿菌在100bp-150bp處有DNA擴(kuò)增條帶，其擴(kuò)增產(chǎn)物用焦磷酸測序檢測，儀器讀出的DNA堿基序列為CTGTTTCTTCTCCC (圖3)，該序列與測序引物后的堿基序列CCAAGGATTCACAGCAGAAGCCACAGGTGCTTTT比對，結(jié)果完全不匹配，因此,可判斷該菌株為非VP，是PCR非特異性擴(kuò)增。I. 6單鏈模板制備及焦磷酸測序?qū)?5 μ I PCR擴(kuò)增產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至96孔PCR板中，力口入 2 μ I 磁珠(sepharose beads), 20 μ I 結(jié)合緩沖液(Binding Buffer)和 43 μ I 純水，常溫震蕩混20min ;打開真空泵,將真空預(yù)裝工具prep tool在高純水中清洗30秒,將prep tool移到96孔PCR板中，抓取其中的磁珠，待磁珠基本抓取完畢后將攜帶有磁珠的prep tool放入70%乙醇中5秒，再分別在變性緩沖液Denaturation Buffer和洗漆緩沖液WashingBuffer中各清洗20s 30s,再將prep tool放在裝有退火預(yù)混液PSQ96板(預(yù)先加入43 μ I退火緩沖液Annealing Buffer和2μ I測序引物)的上方，關(guān)掉真空泵，輕輕搖動釋放磁珠，將PSQ96板在80°C放置5min，自然冷卻至室溫后進(jìn)行焦磷酸測序反應(yīng)。測序程序采用SQA模式，按ATCG的堿基排列順序，依次循環(huán)加入15次，根據(jù)軟件給出的劑量在試劑倉中加入底物混合物、酶混合物和4種脫氧核糖核苷酸,將PSQ96孔板和試劑倉放入PyroMarkID系統(tǒng)中進(jìn)行焦磷酸測序。測序峰及相應(yīng)的DNA堿基序列由儀器SQA軟件自動分析產(chǎn)生。I. 7焦磷酸測序結(jié)果判斷20株VP焦磷酸測序結(jié)果，根據(jù)模版濃度等條件的不同，測出44bp_48bp大小不等的DNA堿基序列(表2，圖4-圖23)，而11株對照菌株創(chuàng)傷弧菌、溶藻弧菌、海蛹弧菌、弗氏弧菌、最小弧菌、大腸桿菌、阪崎腸桿菌、痢疾志賀氏菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、塔氏弧菌、單增李斯特菌，未測出DNA堿基序列或測得結(jié)果與測序引物后的序列不匹配(本研究只列出創(chuàng)傷弧菌和大腸桿菌的焦磷酸測序結(jié)果圖。圖3，圖24)。表2和圖4觀察到，VP標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC17802的第4個堿基為T，在NCBI網(wǎng)站查找ATCC17802的toxR基因序列(GenBank:JF930556. 1)，發(fā)現(xiàn)該位點的堿基為A，表明試驗菌株在該位點發(fā)生了 A-T的突 變。查找toxR基因編碼蛋白氨基酸序列，共292個氨基酸組成，突變位點是toxR蛋白的第176個氨基酸-脯氨酸位點，該位點發(fā)生A-T的突變后，密碼子CCU變成CCA，而兩個密碼子都是脯氨酸的密碼子，表明該位點雖然發(fā)生了突變但其氨基酸序列沒有改變，以至該基因表達(dá)的跨膜轉(zhuǎn)錄激活蛋白沒有變化。20株VP測序所得DNA堿基序列，分別與測序引物后的DNA序列比對，發(fā)現(xiàn)100%匹配的DNA堿基數(shù)為35bp_48bp，所有有效測序結(jié)果均超過35個堿基(表2)，表明測序引物的特異性較好，并且可用CCAAGGATTCACAGCAGAAGCCACAGGTGCTTTT的DNA堿基序列特異性地檢測VP。表2 :副溶血性弧菌測序檢測結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種PCR-焦磷酸法檢測副溶血弧菌的檢測引物，其特征在于，包括PCR引物和測序引物 PCR 引物上游引物 F GAGATTCCGCTGGGTTTGTAA ； 下游引物 R TGAACCAGAAGCGCCAGTAGTAC ； 測序引物 S AAATAACGCGTGGAATo
2.—種PCR-焦磷酸法檢測副溶血弧菌的檢測試劑盒，包括DNA提取試劑，PCR反應(yīng)試齊U，單鏈模板制備試劑，焦磷酸測序試劑，PCR引物和測序引物，其特征在于，所述的PCR引物和測序引物為 PCR 引物上游引物 F GAGATTCCGCTGGGTTTGTAA ；下游引物 R TGAACCAGAAGCGCCAGTAGTAC ； 測序引物 S AAATAACGCGTGGAATo
3.一種非診斷目的的PCR-焦磷酸法檢測副溶血弧菌的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)對樣品進(jìn)行增菌培養(yǎng)，提取增菌液中菌體的基因組DNA作為模板； (2)使用權(quán)利要求I所述的PCR引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，回收PCR產(chǎn)物，制備單鏈模版，然后應(yīng)用權(quán)利要求I所述的測序引物對PCR產(chǎn)物進(jìn)行焦磷酸測序，自測序引物3\端后的第一個堿基開始測序，測序引物后的34個堿基序列為CCAAGGATTCACAGCAGAAGC CACAGGTGCTTTT時，判斷樣品中含有副溶血弧囷。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測方法，其特征在于，所述的PCR反應(yīng)，其擴(kuò)增體系50u L，PCR Mix Buffer 25 y 1，Taq 酶 5 y 1，MgCl2 I ii 1，10 y M 上、下游引物各 2 y 1，DNA 模板lul，去離子水 14iil，反應(yīng)條件為預(yù)變性 95°C 4min ；95°C 15s，65。。30s, ,72 °C 30s，43 個循環(huán)；72°C 12min。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種PCR-焦磷酸法檢測副溶血弧菌的檢測引物、試劑盒和檢測方法。本發(fā)明根據(jù)副溶血弧菌toxR基因(GenBank:NC_004603.1)序列中的保守區(qū)域，用PyroMark Assay Design軟件設(shè)計PCR引物和測序引物，建立了PCR-焦磷酸測序，從DNA堿基序列水平上檢測副溶血弧菌的方法。本發(fā)明先對目標(biāo)片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，保證擴(kuò)增片段的特異性，再用擴(kuò)增產(chǎn)物制備單鏈模板，在測序引物的引導(dǎo)下進(jìn)行焦磷酸測序。檢測的所得堿基序列，用NCBI網(wǎng)站的BLAST功能反復(fù)比對時發(fā)現(xiàn)，toxR基因測序引物后的堿基序列具有良好的特異性，測序引物后34bp連續(xù)DNA序列為CCAAGGATTCACAGCAGAAGCCACAGGTGCTTTT的就可鑒定含有VP。
文檔編號C12R1/63GK102808024SQ20121027273
公開日2012年12月5日 申請日期2012年8月1日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月1日
發(fā)明者許龍巖, 袁慕云, 曹際娟, 唐勤, 鄒志飛 申請人:許龍巖, 袁慕云, 曹際娟, 唐勤, 鄒志飛