專利名稱：一種小肽螯合錳復合物的制備方法與應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種小肽螯合錳復合物的制備方法及其應用。
背景技術：
動物為了保證每一個細胞，組織，器官，腺體及系統(tǒng)的正常功能需要特定的微量元素，微量元素是動物不可缺少的營養(yǎng)物質(zhì)，日糧中添加一定高質(zhì)量、高利用率的微量元素對動物健康和最大限度發(fā)揮其生產(chǎn)潛力具有十分重要的作用(NRC，1998 ；Richards,2008)。錳(Mn)是幾種酶系統(tǒng)包括錳特異性的糖基轉移酶和磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的一個成分并為正常骨結構所必需。此外，錳在胚胎期和生后骨骼發(fā)育中起到重要作用，和銅、鋅一樣，錳也參與細胞的抗氧化作用，錳也是超氧化物歧化酶的輔助因子(ElinorMcCartney 2010)。錳缺乏癥狀可影響生殖能力，有可能使后代先天性畸形，骨和軟骨的形成不正常及葡萄糖耐量受損。另外，錳的缺乏可引起神經(jīng)衰弱綜合癥，影響智力發(fā)育。錳缺乏還將導致胰島素合成和分泌的降低，影響糖代謝。由于無機微量元素之間存在相互拮抗作用，比如銅、鋅之間，鐵、鋅之間，導致吸收利用率降低。人們多超量添加希望解決缺乏問題，但不僅效果有限，還產(chǎn)生了對環(huán)境的污染(Cao, 1997)。微量元素的缺乏能夠?qū)е略S多動物代謝甚至臨床疾病的發(fā)生。在家畜和禽類生產(chǎn)過程中，微量元素的缺乏直接導致生長緩慢和飼料轉化效率下降(NRC，1998)。現(xiàn)在有機微量元素已成為國內(nèi)外飼料及養(yǎng)殖行業(yè)研究的熱點。目前，市場上常見的有機微量元素主要為有機酸類微量元素和氨基酸螯合微量元素。從上世紀80年代開始出現(xiàn)以富馬酸鐵，葡萄糖酸鋅等為代表的有機酸類微量元素。第二代的簡單有機鹽，雖然穩(wěn)定性好，但與部分營養(yǎng)物質(zhì)仍會發(fā)生拮抗作用。在消化吸收過程中受影響的因素也較多，生物學利用率仍較低。金屬離子與氨基酸分子通過配位鍵結合后，使其分子內(nèi)電荷趨于中性，形成了較穩(wěn)定的化學結構(黃雪等，2008 ;)。但在瘤胃或單胃內(nèi)酸環(huán)境下的穩(wěn)定性問題一致沒有很好地解決(梁建光等，2008)。因此，研發(fā)一類生物學利用率高，在瘤胃或單胃內(nèi)酸環(huán)境下的穩(wěn)定性好的有機錳添加劑具有十分重要的市場意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種小肽螯合錳復合物的制備方法。本發(fā)明所采用的技術方案是
一種小肽螯合錳復合物的制備方法，包括如下步驟
1)將蛋白原料、碳源和水配制成培養(yǎng)液，滅菌；
2)將芽孢菌接種到滅菌后的培養(yǎng)液中，30 37°C下振蕩培養(yǎng)18 30h后，加入蛋白酶，35 50°C，pH6. O 7. 5，繼續(xù)酶解6 12h，得到小肽發(fā)酵液；或者是往培養(yǎng)液中加入蛋白酶，35 50°C，pH6. O 7. 5，酶解6 12h后，接種芽孢菌，30 37°C下繼續(xù)振蕩培養(yǎng)18 30h，得到小肽發(fā)酵液；3)測定小肽發(fā)酵液中小肽的含量，滅酶后，繼續(xù)加入水溶性錳鹽，混合均勻，控制反應溫度在55 65 °C，pH為5 6，進行螯合反應；
4)將反應產(chǎn)物干燥，得到小肽螯合錳復合物。所述蛋白原料為豆柏、大米蛋白粉、小麥蛋白粉、玉米蛋白粉、棉柏、花生柏、馬鈴薯蛋白、菜柏、大豆?jié)饪s蛋白中的至少一種。所述碳源為葡萄糖、蔗糖、淀粉中的至少一種。以上原料均可在原料市場購得。每IOOml培養(yǎng)液中，含有蛋白原料20 30g、碳源O. I lg。所述芽孢菌為地衣芽孢桿菌iBaciIlus Iicheniformis)或/和枯草芽孢桿菌{BeilIus subtilis、或 I 和納豆芽抱桿菌Cfeci77w5· natto、。 所述芽孢菌的接種濃度為5 X IO7 IOX 107cfu/ml培養(yǎng)液。所述蛋白酶為中性蛋白酶，加入量為400 700U/g蛋白原料。步驟3)中，小肽與水溶性錳鹽的摩爾比為I 3 :1。所述水溶性錳鹽為硫酸錳、氯化錳、碳酸錳、磷酸氫錳中的至少一種。上述方法制備得到的小肽螯合錳復合物作為飼料添加劑的應用。本發(fā)明的有益效果在于
本發(fā)明小肽螯合錳制備方法的螯合率高，達到95%以上，所得到的小肽螯合錳復合物在動物胃內(nèi)的穩(wěn)定性好，營養(yǎng)更加全面，可用作飼用添加劑，補充日糧的微量元素，提高動物體的免疫機能。


圖I是標準蛋白的分子量和出峰時間曲線圖 圖2是小肽發(fā)酵液凝膠G-15洗脫圖譜。
具體實施例方式以下實施例中所用到的菌液按以下方法制備
從斜面試管培養(yǎng)基中刮取一環(huán)地衣芽孢桿菌Iicheniformis)或枯草芽孢桿菌iBcillus或納豆芽孢桿菌{Bacillus菌種加入到液體培養(yǎng)基中,搖
瓶培養(yǎng)。搖瓶種子培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件為葡萄糖1%、酵母膏O. 5%、蛋白胨O. 5%、牛肉膏O. 5%、食鹽O. 05%、磷酸二氫鉀O. 1%。pH=7. 0-7. 2、121°C滅菌18分鐘。于32°C恒溫搖床中，200r/min振蕩培養(yǎng)24h，得到菌種液。以上三個菌種購自廣東省微生物菌種保藏中心，地衣芽孢桿菌(McilliisIi cheni formi s )和枯草芽抱桿菌 C5ci77w5· subtil is、的編號分別為 GIM1. 8=AS1. 518,GIM1. 19=AS1. 210。以下實施例中所用到的中性蛋白酶購自肇東市日成酶制劑有限公司，商品型號為AS. 1398，酶活力為 50000U/g。以下實施例中所用到的檢測方法和計算公式如下所示
一、檢測小肽發(fā)酵液中小肽的含量及小肽轉化率
I、原理小肽發(fā)酵液中的大分子蛋白質(zhì)和肽鏈較長的多肽用三氯醋酸溶液進行沉淀，并將其中的短鏈小肽用酸溶解出來，其中包括小肽和部分α-氨基酸。然后經(jīng)離心、過濾、消化、蒸懼，測定其蛋白質(zhì)含量即酸溶蛋白。本方法參照大豆肽粉(Soy peptides powder)中華人民共和國輕工行業(yè)標準(QB/ T 2653 -2004)修訂而成。2、試劑及儀器
IOOml燒杯；10ml，25ml移液管；半微量粗蛋白質(zhì)測定試劑和裝置；15%三氯醋酸溶液(TCA溶液)；4500轉/分鐘的離心機。3、方法
取樣將小肽發(fā)酵液攪拌均勻后，取IOml樣品，80°C烘干，準確稱重，用于測定小肽含量，重復三次。具體步驟如下
樣品用水溶解，用玻璃棒攪拌均勻，無損的移入IOOml容量瓶中，定容至刻度(100 ml總樣本液)靜止10分鐘。搖動容量瓶取15ml渾濁液用離心機4500轉離心10分鐘，取IOml上清液注入試管管中，再加入15%三氯醋酸10ml，靜止沉降15分鐘后，用定性濾紙過濾。取濾液IOml (相當于用于消化的樣本液為5ml)注入干燥的消化管中，加入硫酸銅O. 2g，硫酸鈉3g，再加濃硫酸10ml，消化方法及蒸餾方法與凱氏定氮法相同。樣品中肽含量的計算公式
權利要求
1.一種小肽螯合錳復合物的制備方法，包括如下步驟 1)將蛋白原料、碳源和水配制成培養(yǎng)液，滅菌； 2)將芽孢菌接種到滅菌后的培養(yǎng)液中，30 37°C下振蕩培養(yǎng)18 30h后，加入蛋白酶，35 50°C，pH6. O 7. 5，繼續(xù)酶解6 12h，得到小肽發(fā)酵液；或者是往培養(yǎng)液中加入蛋白酶，35 50°C，pH6. O 7. 5，酶解6 12h后，接種芽孢菌，30 37°C下繼續(xù)振蕩培養(yǎng)18 30h，得到小肽發(fā)酵液； 3)測定小肽發(fā)酵液中小肽的含量，滅酶后，繼續(xù)加入水溶性錳鹽，混合均勻，控制反應溫度在55 65 °C，pH為5 6，進行螯合反應； 4)將反應產(chǎn)物干燥，得到小肽螯合錳復合物。
2.根據(jù)權利要求I所述的小肽螯合錳復合物的制備方法，其特征在于所述蛋白原料為豆柏、大米蛋白粉、小麥蛋白粉、玉米蛋白粉、棉柏、花生柏、馬鈴薯蛋白、菜柏、大豆?jié)饪s蛋白中的至少一種。
3.根據(jù)權利要求I所述的小肽螯合錳復合物的制備方法，其特征在于所述碳源為葡萄糖、蔗糖、淀粉中的至少一種。
4.根據(jù)權利要求I所述的小肽螯合錳復合物的制備方法，其特征在于每IOOml培養(yǎng)液中，含有蛋白原料20 30g、碳源O. I lg。
5.根據(jù)權利要求I所述的小肽螯合錳復合物的制備方法，其特征在于所述芽孢菌為地衣芽抱桿菌{Bacillus licheniformi s')或/和枯草芽抱桿菌iBcillus subtil is、或/和納豆芽抱桿菌natto)。
6.根據(jù)權利要求I所述的小肽螯合錳復合物的制備方法，其特征在于所述芽孢菌的接種濃度為5 X IO7 IOX 107cfu/ml培養(yǎng)液。
7.根據(jù)權利要求I所述的小肽螯合錳復合物的制備方法，其特征在于所述蛋白酶為中性蛋白酶，加入量為400 700U/g蛋白原料。
8.根據(jù)權利要求I所述的小肽螯合錳復合物的制備方法，其特征在于步驟3)中，小肽與水溶性錳鹽的摩爾比為I 3 :1。
9.根據(jù)權利要求I所述的小肽螯合錳復合物的制備方法，其特征在于所述水溶性錳鹽為硫酸錳、氯化錳、碳酸錳、磷酸氫錳中的至少一種。
10.權利要求I 9任一項的方法制備得到的小肽螯合錳復合物作為飼料添加劑的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種小肽螯合錳復合物的制備方法與應用。制備方法包括如下步驟將芽孢菌接種到培養(yǎng)液中，30～37℃下振蕩培養(yǎng)18～30h后，加入蛋白酶，繼續(xù)培養(yǎng)6～12h，得到小肽發(fā)酵液；或者是往培養(yǎng)液中加入蛋白酶，酶解6～12h后，接種芽孢菌，30～37℃下繼續(xù)振蕩培養(yǎng)18～30h，得到小肽發(fā)酵液；繼續(xù)加入水溶性錳鹽，55～65℃，pH5～6，螯合反應；將反應物干燥，得到小肽螯合錳復合物。本發(fā)明小肽螯合錳制備方法的螯合率高，達到95%以上，所得到的小肽螯合錳復合物在動物胃內(nèi)的穩(wěn)定性好，并含有多種生物活性成分，營養(yǎng)更加全面，可用作飼用添加劑，補充日糧的微量元素，提高動物體的免疫機能。
文檔編號C12P21/06GK102827907SQ201210272908
公開日2012年12月19日 申請日期2012年8月2日 優(yōu)先權日2012年8月2日
發(fā)明者潘軍, 張偉強, 王瑞平, 蘇全, 馬春平 申請人:廣州市博善生物飼料有限公司