專(zhuān)利名稱(chēng)：殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)、其編碼基因及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)、其編碼基因及用途，特別是涉及一種改造的PIC9-02殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)、其編碼基因及用途。
背景技術(shù)：
植物蟲(chóng)害是導(dǎo)致農(nóng)作物損失的主要因素，給農(nóng)民造成重大的經(jīng)濟(jì)損失，甚至影響到當(dāng)?shù)厝丝诘纳鏍顩r。為了防治植物蟲(chóng)害，人們通常使用廣譜化學(xué)殺蟲(chóng)劑和生物殺蟲(chóng)制齊U，但二者在實(shí)際應(yīng)用中都具有局限性化學(xué)殺蟲(chóng)劑會(huì)帶來(lái)環(huán)境污染的問(wèn)題，并導(dǎo)致抗藥性昆蟲(chóng)的出現(xiàn)；而生物殺蟲(chóng)制劑在環(huán)境中容易降解，在生產(chǎn)上需要重復(fù)施用，大大增加了生產(chǎn)成本。為了解決化學(xué)殺蟲(chóng)劑和生物殺蟲(chóng)制劑在實(shí)際應(yīng)用中的局限性，科學(xué)家們經(jīng)過(guò)研究·發(fā)現(xiàn)將編碼殺蟲(chóng)蛋白的抗蟲(chóng)基因轉(zhuǎn)入植物中，可獲得一些抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因植物以防治植物蟲(chóng)害。PIC9殺蟲(chóng)蛋白是一種伴孢不溶性晶體蛋白。PIC9蛋白被昆蟲(chóng)攝入進(jìn)入中腸，毒蛋白原毒素被溶解在昆蟲(chóng)中腸的堿性PH環(huán)境下。蛋白N-和C-末端被堿性蛋白酶消化，將原毒素轉(zhuǎn)變成活性片段；活性片段和昆蟲(chóng)中腸上皮細(xì)胞膜上表面上受體結(jié)合，插入腸膜，導(dǎo)致細(xì)胞膜出現(xiàn)穿孔病灶，破壞細(xì)胞膜內(nèi)外的滲透壓變化及PH平衡等，擾亂昆蟲(chóng)的消化過(guò)程，最終導(dǎo)致其死亡。每年因植物蟲(chóng)害造成的糧食損失巨大，例如玉米螟、小地老虎、玉米夜蛾或棉鈴蟲(chóng)等。目前未發(fā)現(xiàn)PIC9殺蟲(chóng)蛋白在植物中的表達(dá)水平和毒力的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)、其編碼基因及用途，所述PIC9-02殺蟲(chóng)蛋白在植物中(尤其為玉米)具有較高的表達(dá)量和毒力。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)，包括(a)具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；或(b)在(a)中的氨基酸序列經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有殺蟲(chóng)活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)；或(C)通過(guò)包含SEQ ID NO: I的核苷酸序列的核酸分子的表達(dá)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)；或(d)通過(guò)包含核苷酸序列的核酸分子的表達(dá)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，所述核苷酸序列具有在嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO: I的核苷酸序列雜交的互補(bǔ)序列；或(e)通過(guò)包含核苷酸序列的核酸分子的表達(dá)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，所述核苷酸序列與(d)的核苷酸序列同類(lèi)編碼。所述嚴(yán)格條件可為在6 X SSC (檸檬酸鈉)、0· 5%SDS (十二烷基硫酸鈉)溶液中，在65°C下雜交，然后用2XSSC、0. 1%SDS和I X SSC,O. 1%SDS各洗膜I次。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種殺蟲(chóng)基因，包括Ca)編碼具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的核苷酸序列；或
(b)編碼氨基酸序列的核苷酸序列，所述氨基酸序列為在(a)中的氨基酸序列經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有殺蟲(chóng)活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)；或(c)具有SEQ ID NO: I所示的核苷酸序列；或(d)在嚴(yán)格條件下與(C)限定的核苷酸序列雜交 且編碼具有殺蟲(chóng)活性的蛋白質(zhì)的核苷酸序列；或(e)與(d)的核苷酸序列同類(lèi)編碼。所述嚴(yán)格條件可為在6 X SSC (檸檬酸鈉)、0· 5%SDS (十二烷基硫酸鈉)溶液中，在65°C下雜交，然后用2XSSC、0. 1%SDS和I X SSC,O. 1%SDS各洗膜I次。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種表達(dá)盒，包含在有效連接的調(diào)控序列調(diào)控下的所述殺蟲(chóng)基因。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種包含所述表達(dá)盒的重組載體。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種包含所述殺蟲(chóng)基因的轉(zhuǎn)基因宿主生物，包括植物細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞、細(xì)菌、酵母、桿狀病毒、線蟲(chóng)或藻類(lèi)。進(jìn)一步地，所述植物為玉米、大豆、棉花、水稻或小麥。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種產(chǎn)生殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)的方法，包括獲得所述轉(zhuǎn)基因宿主生物的細(xì)胞；在允許產(chǎn)生殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)基因宿主生物的細(xì)胞；回收所述殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種用于增加昆蟲(chóng)靶范圍的方法，包括將所述表達(dá)盒在植物中與至少一種不同于所述表達(dá)盒編碼的殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)的第二種殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)一起表達(dá)。進(jìn)一步地，所述第二種殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)為Vip類(lèi)殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)、蛋白酶抑制劑、凝集素、α-淀粉酶或過(guò)氧化物酶。在本發(fā)明中，PIC9-02殺蟲(chóng)蛋白在一種轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)可以伴隨著一個(gè)或多個(gè)Vip類(lèi)殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)的表達(dá)。這種超過(guò)一種的殺蟲(chóng)毒素在同一株轉(zhuǎn)基因植物中共同表達(dá)可以通過(guò)遺傳工程使植物包含并表達(dá)所需的基因來(lái)實(shí)現(xiàn)。另外，一種植物(第I親本)可以通過(guò)遺傳工程操作表達(dá)PIC9-02殺蟲(chóng)蛋白，第二種植物(第2親本)可以通過(guò)遺傳工程操作表達(dá)Vip類(lèi)殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)。通過(guò)第I親本和第2親本雜交獲得表達(dá)引入第I親本和第2親本的所有基因的后代植物。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種產(chǎn)生抗蟲(chóng)植物的方法，包括將所述殺蟲(chóng)基因或所述表達(dá)盒或所述重組載體導(dǎo)入植物。優(yōu)選地，所述植物為玉米、大豆、棉花、水稻或小麥。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種用于保護(hù)植物免受由昆蟲(chóng)害蟲(chóng)引起的損傷的方法，包括將所述的殺蟲(chóng)基因或所述的表達(dá)盒或所述的重組載體導(dǎo)入植物，使導(dǎo)入后的植物產(chǎn)生足夠保護(hù)其免受昆蟲(chóng)害蟲(chóng)侵害量的殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)。優(yōu)選地，所述植物為玉米、大豆、棉花、水稻或小麥。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種控制昆蟲(chóng)害蟲(chóng)的方法，包括使昆蟲(chóng)害蟲(chóng)與抑制量的所述殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)或由所述殺蟲(chóng)基因編碼的昆蟲(chóng)抑制性蛋白接觸。優(yōu)選地，所述昆蟲(chóng)害蟲(chóng)是鱗翅目昆蟲(chóng)害蟲(chóng)。
將所述的殺蟲(chóng)基因或所述的表達(dá)盒或所述的重組載體導(dǎo)入植物，在本發(fā)明中為將外源DNA導(dǎo)入植物細(xì)胞，常規(guī)轉(zhuǎn)化方法包括但不限于，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、微量發(fā)射轟擊、直接將DNA攝入原生質(zhì)體、電穿孔或晶須硅介導(dǎo)的DNA導(dǎo)入。本發(fā)明中所述的植物、植物組織或植物細(xì)胞的基因組，是指植物、植物組織或植物細(xì)胞內(nèi)的任何遺傳物質(zhì)，且包括細(xì)胞核和質(zhì)體和線粒體基因組。本發(fā)明中所述的DNA分子或蛋白序列的“片段”或“截短”是指涉及的原始DNA或蛋白序列(核苷酸或氨基酸)的一部分或其人工改造形式(例如適合植物表達(dá)的序列)，前述序列的長(zhǎng)度可存在變化，但長(zhǎng)度足以確保(編碼)蛋白質(zhì)為昆蟲(chóng)毒素。本發(fā)明中氨基酸序列的取代、缺失或添加是本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)，優(yōu)選這種氨基酸變化為小的特性改變，即不顯著影響蛋白的折疊和/或活性的保守氨基酸取代；小的缺失，通常約1-30個(gè)氨基酸的缺失；小的氨基或羧基端延伸，例如氨基端延伸一個(gè)甲硫氨酸殘基；小的連接肽，例如約20-25個(gè)殘基長(zhǎng)。
·
保守取代的實(shí)例是在下列氨基酸組內(nèi)發(fā)生的取代堿性氨基酸(如精氨酸、賴(lài)氨酸和組氨酸)、酸性氨基酸(如谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸(如谷氨酰胺、天冬酰胺)、疏水性氨基酸(如亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)、芳香氨基酸(如苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)，以及小分子氨基酸(如甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸)。通常不改變特定活性的那些氨基酸取代在本領(lǐng)域內(nèi)是眾所周知的，并且已由，例如，N. Neurath和R. L. Hill在1979年紐約學(xué)術(shù)出版社(Academic Press)出版的《Protein》中進(jìn)行了描述。最常見(jiàn)的互換有 Ala/Ser，Val/Ile, Asp/Glu, Thu/Ser, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe,Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu 和 Asp/Gly,以及它們相反的互換。對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言顯而易見(jiàn)地，這種取代可以在對(duì)分子功能起重要作用的區(qū)域之外發(fā)生，而且仍產(chǎn)生活性多肽。對(duì)于由本發(fā)明的多肽，其活性必需的并因此選擇不被取代的氨基酸殘基，可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法，如定點(diǎn)誘變或丙氨酸掃描誘變進(jìn)行鑒定(如參見(jiàn)，Cunningham 和 Wells, 1989, Science 244 1081-1085)。后一技術(shù)是在分子中每一個(gè)帶正電荷的殘基處引入突變，檢測(cè)所得突變分子的抗蟲(chóng)活性，從而確定對(duì)該分子活性而言重要的氨基酸殘基。底物-酶相互作用位點(diǎn)也可以通過(guò)其三維結(jié)構(gòu)的分析來(lái)測(cè)定，這種三維結(jié)構(gòu)可由核磁共振分析、結(jié)晶學(xué)或光親和標(biāo)記等技術(shù)測(cè)定(參見(jiàn)，如de Vos等，1992，Science 255 :306-312 ;Smith 等，1992，J. Mol. Biol 224:899-904 ;Wlodaver 等，1992，F(xiàn)EBS Letters 309 :59_64)。因此，與序列2所示的氨基酸序列具有一定同源性的氨基酸序列也包括在本發(fā)明中。這些序列與本發(fā)明序列至少大約40%-50%同源，大約60%、65%或70%同源，甚至至少大約 75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多同源。即序列同一性的范圍分布在至少大約40%-50%、大約60%、65%或70%同源，甚至至少大約75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更大的序列同源性。本發(fā)明中核酸分子或其片段在嚴(yán)格條件下與本發(fā)明殺蟲(chóng)基因雜交。任何常規(guī)的核酸雜交或擴(kuò)增方法都可以用于鑒定本發(fā)明殺蟲(chóng)基因的存在。核酸分子或其片段在一定情況下能夠與其他核酸分子進(jìn)行特異性雜交。本發(fā)明中，如果兩個(gè)核酸分子能形成反平行的雙鏈核酸結(jié)構(gòu)，就可以說(shuō)這兩個(gè)核酸分子彼此間能夠進(jìn)行特異性雜交。如果兩個(gè)核酸分子顯示出完全的互補(bǔ)性，則稱(chēng)其中一個(gè)核酸分子是另一個(gè)核酸分子的“互補(bǔ)物”。本發(fā)明中，當(dāng)一個(gè)核酸分子的每一個(gè)核苷酸都與另一個(gè)核酸分子的對(duì)應(yīng)核苷酸互補(bǔ)時(shí)，則稱(chēng)這兩個(gè)核酸分子顯示出“完全互補(bǔ)性”。如果兩個(gè)核酸分子能夠以足夠的穩(wěn)定性相互雜交從而使它們?cè)谥辽俪Ｒ?guī)的“低度嚴(yán)格”條件下退火且彼此結(jié)合，則稱(chēng)這兩個(gè)核酸分子為“最低程度互補(bǔ)”。類(lèi)似地，如果兩個(gè)核酸分子能夠以足夠的穩(wěn)定性相互雜交從而使它們?cè)诔Ｒ?guī)的“高度嚴(yán)格”條件下退火且彼此結(jié)合，則稱(chēng)這兩個(gè)核酸分子具有“互補(bǔ)性”。從完全互補(bǔ)性中偏離是可以允許的，只要這種偏離不完全阻止兩個(gè)分子形成雙鏈結(jié)構(gòu)。為了使一個(gè)核酸分子能夠作為引物或探針，僅需保證其在序列上具有充分的互補(bǔ)性，以使得在所采用的特定溶劑和鹽濃度下能形成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)。本發(fā)明中，基本同源的序列是一段核酸分子，該核酸分子 在高度嚴(yán)格條件下能夠和相匹配的另一段核酸分子的互補(bǔ)鏈發(fā)生特異性雜交。促進(jìn)DNA雜交的適合的嚴(yán)格條件，例如，大約在45°C條件下用6. OX氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)處理，然后在50°C條件下用2. OXSSC洗滌，這些條件對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的。例如，在洗滌步驟中的鹽濃度可以選自低度嚴(yán)格條件的約2.0父55(、501到高度嚴(yán)格條件的約0.2\55(、501。此外，洗滌步驟中的溫度條件可以從低度嚴(yán)格條件的室溫約22°C，升高到高度嚴(yán)格條件的約65 °C。溫度條件和鹽濃度可以都發(fā)生改變，也可以其中一個(gè)保持不變而另一個(gè)變量發(fā)生改變。優(yōu)選地，本發(fā)明所述嚴(yán)格條件可為在6XSSC、0. 5%SDS溶液中，在65°C下與SEQ ID NO: I發(fā)生特異性雜交，然后用2XSSC、0. 1%SDS和I X SSC,O. 1%SDS各洗膜I次。因此，具有抗蟲(chóng)活性并在嚴(yán)格條件下與本發(fā)明序列I雜交的序列包括在本發(fā)明中。這些序列與本發(fā)明序列至少大約40%-50%同源，大約60%、65%或70%同源，甚至至少大約 75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更多同源。即序列同一性的范圍分布在至少大約40%-50%、大約60%、65%或70%同源，甚至至少大約75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更大的序列同源性。當(dāng)核酸序列編碼的多肽與參照核酸序列編碼的多肽有相同的氨基酸序列時(shí)，該核酸序列與參照核酸序列是本發(fā)明所述的“同類(lèi)編碼”。本發(fā)明中所述調(diào)控序列包括但不限于啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)運(yùn)肽、終止子，增強(qiáng)子，前導(dǎo)序列，內(nèi)含子以及其它可操作地連接到所述殺蟲(chóng)基因的調(diào)節(jié)序列。所述啟動(dòng)子為植物中可表達(dá)的啟動(dòng)子，所述的“植物中可表達(dá)的啟動(dòng)子”是指確保與其連接的編碼序列在植物細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行表達(dá)的啟動(dòng)子。植物中可表達(dá)的啟動(dòng)子可為組成型啟動(dòng)子。指導(dǎo)植物內(nèi)組成型表達(dá)的啟動(dòng)子的示例包括但不限于，來(lái)源于花椰菜花葉病毒的35S啟動(dòng)子、ubi啟動(dòng)子、水稻G0S2基因的啟動(dòng)子等。備選地，植物中可表達(dá)的啟動(dòng)子可為組織特異的啟動(dòng)子，即該啟動(dòng)子在植物的一些組織內(nèi)如在綠色組織中指導(dǎo)編碼序列的表達(dá)水平高于植物的其他組織(可通過(guò)常規(guī)RNA試驗(yàn)進(jìn)行測(cè)定)，如PEP羧化酶啟動(dòng)子。備選地，植物中可表達(dá)的啟動(dòng)子可為創(chuàng)傷誘導(dǎo)啟動(dòng)子。創(chuàng)傷誘導(dǎo)啟動(dòng)子或指導(dǎo)創(chuàng)傷誘導(dǎo)的表達(dá)模式的啟動(dòng)子是指當(dāng)植物經(jīng)受機(jī)械或由昆蟲(chóng)啃食引起的創(chuàng)傷時(shí)，啟動(dòng)子調(diào)控下的編碼序列的表達(dá)較正常生長(zhǎng)條件下有顯著提高。創(chuàng)傷誘導(dǎo)啟動(dòng)子的示例包括但不限于，馬鈴薯和西紅柿的蛋白酶抑制基因(pin I和pin II)和玉米蛋白酶抑制基因(MPI)的啟動(dòng)子。所述轉(zhuǎn)運(yùn)肽(又稱(chēng)分泌信號(hào)序列或?qū)蛐蛄?是指導(dǎo)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物到特定的細(xì)胞器或細(xì)胞區(qū)室，對(duì)受體蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)，所述轉(zhuǎn)運(yùn)肽可以是異源的，例如，利用編碼葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列靶向葉綠體，或者利用‘KDEL’保留序列靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，或者利用大麥植物凝集素基因的CTPP靶向液泡。所述前導(dǎo)序列包含但不限于，小RNA病毒前導(dǎo)序列，如EMCV前導(dǎo)序列(腦心肌炎病毒5’非編碼區(qū))；馬鈴薯Y病毒組前導(dǎo)序列，如MDMV (玉米矮縮花葉病毒)前導(dǎo)序列；人類(lèi)免疫球蛋白質(zhì)重鏈結(jié)合蛋白質(zhì)(BiP);苜?；ㄈ~病毒的外殼蛋白質(zhì)mRNA的不翻譯前導(dǎo)序列(AMV RNA4);煙草花葉病毒(TMV)前導(dǎo)序列。所述增強(qiáng)子包含但不限于，花椰菜花葉病毒(CaMV)增強(qiáng)子、玄參花葉病毒(FMV)增強(qiáng)子、康乃馨風(fēng)化環(huán)病毒(CERV)增強(qiáng)子、木薯脈花葉病毒(CsVMV)增強(qiáng)子、紫茉莉花葉病毒(MMV)增強(qiáng)子、夜香樹(shù)黃化曲葉病毒(CmYLCV)增強(qiáng)子、木爾坦棉花曲葉病毒(CLCuMV)、鴨跖草黃斑駁病毒(CoYMV)和花生褪綠線條花葉病毒(PCLSV)增強(qiáng)子。對(duì)于單子葉植物應(yīng)用而言，所述內(nèi)含子包含但不限于，玉米hsp70內(nèi)含子、玉米泛素內(nèi)含子、Adh內(nèi)含子I、蔗糖合酶內(nèi)含子或水稻Actl內(nèi)含子。對(duì)于雙子葉植物應(yīng)用而言，所述內(nèi)含子包含但不限于，CAT-I內(nèi)含子、pKANNIBAL內(nèi)含子、PIV2內(nèi)含子和“超級(jí)泛素”內(nèi)含子?！に鼋K止子可以為在植物中起作用的適合多聚腺苷酸化信號(hào)序列，包括但不限于，來(lái)源于農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)胭脂堿合成酶(NOS)基因的多聚腺苷酸化信號(hào)序列、來(lái)源于蛋白酶抑制劑II (pin II)基因的多聚腺苷酸化信號(hào)序列、來(lái)源于豌豆ssRUBISCO E9基因的多聚腺苷酸化信號(hào)序列和來(lái)源于α -微管蛋白(a -tubulin)基因的多聚腺苷酸化信號(hào)序列。本發(fā)明中所述“有效連接”表示核酸序列的聯(lián)結(jié)，所述聯(lián)結(jié)使得一條序列可提供對(duì)相連序列來(lái)說(shuō)需要的功能。在本發(fā)明中所述“有效連接”可以為將啟動(dòng)子與感興趣的序列相連，使得該感興趣的序列的轉(zhuǎn)錄受到該啟動(dòng)子控制和調(diào)控。當(dāng)感興趣的序列編碼蛋白并且想要獲得該蛋白的表達(dá)時(shí)“有效連接”表示啟動(dòng)子與所述序列相連，相連的方式使得得到的轉(zhuǎn)錄物高效翻譯。如果啟動(dòng)子與編碼序列的連接是轉(zhuǎn)錄物融合并且想要實(shí)現(xiàn)編碼的蛋白的表達(dá)時(shí)，制造這樣的連接，使得得到的轉(zhuǎn)錄物中第一翻譯起始密碼子是編碼序列的起始密碼子。備選地，如果啟動(dòng)子與編碼序列的連接是翻譯融合并且想要實(shí)現(xiàn)編碼的蛋白的表達(dá)時(shí)，制造這樣的連接，使得5’非翻譯序列中含有的第一翻譯起始密碼子與啟動(dòng)子相連結(jié)，并且連接方式使得得到的翻譯產(chǎn)物與編碼想要的蛋白的翻譯開(kāi)放讀碼框的關(guān)系是符合讀碼框的?？梢浴坝行нB接”的核酸序列包括但不限于提供基因表達(dá)功能的序列(即基因表達(dá)元件，例如啟動(dòng)子、5’非翻譯區(qū)域、內(nèi)含子、蛋白編碼區(qū)域、3’非翻譯區(qū)域、聚腺苷化位點(diǎn)和/或轉(zhuǎn)錄終止子)、提供DNA轉(zhuǎn)移和/或整合功能的序列(即T-DNA邊界序列、位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別位點(diǎn)、整合酶識(shí)別位點(diǎn))、提供選擇性功能的序列(即抗生素抗性標(biāo)記物、生物合成基因)、提供可計(jì)分標(biāo)記物功能的序列、體外或體內(nèi)協(xié)助序列操作的序列(即多接頭序列、位點(diǎn)特異性重組序列)和提供復(fù)制功能的序列(即細(xì)菌的復(fù)制起點(diǎn)、自主復(fù)制序列、著絲粒序列)。本發(fā)明中所述的“殺蟲(chóng)”是指對(duì)農(nóng)作物害蟲(chóng)是有毒的。更具體地，目標(biāo)昆蟲(chóng)是害蟲(chóng)，例如，但不限于，大部分鱗翅目害蟲(chóng)，如玉米螟、小地老虎、玉米夜蛾、棉鈴蟲(chóng)或水稻二化
蟲(chóng)貝等。本發(fā)明中，所述殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)具有PIC9-02氨基酸序列，如序列表中SEQ ID N0:2所示。所述殺蟲(chóng)基因具有PIC9-02核苷酸序列，如序列表中SEQ ID NO: I所示。所述殺蟲(chóng)基因?yàn)橛糜谥参?，特別是玉米轉(zhuǎn)化的DNA序列，除了包含由PIC9-02核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)的編碼區(qū)外，也可包含其他元件，例如編碼轉(zhuǎn)運(yùn)肽的編碼區(qū)、編碼選擇性標(biāo)記的蛋白質(zhì)或賦予除草劑抗性的蛋白質(zhì)的編碼區(qū)。本發(fā)明中PIC9-02殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)對(duì)危害玉米的大多數(shù)鱗翅目害蟲(chóng)具有毒性。本發(fā)明中的植物，特別是玉米，在其基因組中含有外源DNA，所述外源DNA包含PIC9-02核苷酸序列，通過(guò)表達(dá)抑制量的該蛋白而保護(hù)其免受害蟲(chóng)的威脅。抑制量是指致死的或亞致死的劑量。同時(shí)，植物在形態(tài)上應(yīng)是正常的，且可在常規(guī)方法下培養(yǎng)以用于產(chǎn)物的消耗和/或生成。此外，該植物可基本消除對(duì)化學(xué)或生物殺蟲(chóng)劑的需要(所述化學(xué)或生物殺蟲(chóng)劑為針對(duì)由PIC9-02核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)所靶向的昆蟲(chóng)的殺蟲(chóng)劑)。植物材料中殺蟲(chóng)晶體蛋白(ICP)的表達(dá)水平可通過(guò)本領(lǐng)域內(nèi)所描述的多種方法進(jìn)行檢測(cè)，例如通過(guò)應(yīng)用特異引物對(duì)組織內(nèi)產(chǎn)生的編碼殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)的mRNA進(jìn)行定量，或直接特異性檢測(cè)產(chǎn)生的殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)的量?？梢詰?yīng)用不同的試驗(yàn)測(cè)定植物中ICP的殺蟲(chóng)效果。本發(fā)明中目標(biāo)昆蟲(chóng)主要為鱗翅·目害蟲(chóng)，更具體地為亞洲玉米螟、東方黏蟲(chóng)、棉鈴蟲(chóng)、水稻二化螟或大螟等。此外，包含本發(fā)明殺蟲(chóng)基因(PIC9-02基因)序列的表達(dá)盒在植物中還可以與至少一種編碼除草劑抗性基因的蛋白質(zhì)一起表達(dá)，所述除草劑抗性基因包括但不限于，草胺膦抗性基因(如bar基因、pat基因)、苯敵草抗性基因(如pmph基因)、草甘膦抗性基因(如EPSPS基因)、溴苯腈(bromoxynil)抗性基因、磺酰脲抗性基因、對(duì)除草劑茅草枯的抗性基因、對(duì)氨腈的抗性基因或谷氨酰胺合成酶抑制劑(如PPT)的抗性基因，從而獲得既具有高殺蟲(chóng)活性、又具有除草劑抗性的轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明提供了一種殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)、其編碼基因及用途，具有以下優(yōu)點(diǎn)I、毒力強(qiáng)。本發(fā)明殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)PIC9-02的殺蟲(chóng)毒力強(qiáng)，尤其是針對(duì)為害玉米的鱗翅目害蟲(chóng)。2、表達(dá)量高。本發(fā)明殺蟲(chóng)基因PIC9-02采用玉米的偏好密碼子，完全符合玉米基因的特性，使得本發(fā)明殺蟲(chóng)基因特別適合在單子葉植物中表達(dá)，尤其是玉米，其表達(dá)量高且穩(wěn)定性好。下面通過(guò)附圖和實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的詳細(xì)描述。


圖I為本發(fā)明殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)、其編碼基因及用途的含有PIC9-02核苷酸序列的重組克隆載體DBNOl-T構(gòu)建流程圖；圖2為本發(fā)明殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)、其編碼基因及用途的含有PIC9-02核苷酸序列的重組表達(dá)載體DBN100146構(gòu)建流程圖；圖3為本發(fā)明殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)、其編碼基因及用途的含有已知序列的重組表達(dá)載體DBN100146R構(gòu)建流程圖；圖4為本發(fā)明殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)、其編碼基因及用途的轉(zhuǎn)基因玉米植株接種亞洲玉米螟的抗蟲(chóng)效果圖；圖5為本發(fā)明殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)、其編碼基因及用途的轉(zhuǎn)基因玉米植株接種東方黏蟲(chóng)的抗蟲(chóng)效果圖。
具體實(shí)施例方式下面通過(guò)具體實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)、其編碼基因及用途的技術(shù)方案。第一實(shí)施例、PIC9-02基因序列的獲得和合成I、獲得PIC9-02基因序列PIC9-02殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)的氨基酸序列(699個(gè)氨基酸)，如 序列表中SEQ ID N0:2所示；依據(jù)玉米偏好性密碼子獲得編碼相應(yīng)于所述PIC9-02殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)的氨基酸序列(699個(gè)氨基酸)的核苷酸序列(2100個(gè)核苷酸)，如序列表中SEQ ID N0:1所示。玉米的密碼子使用偏好性可參考 http://www. kazusa. or. jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi species=38112402、合成上述PIC9-02核苷酸序列所述PIC9-02核苷酸序列(如序列表中SEQ ID NO: I所示)由南京金斯瑞生物科技公司合成；合成的所述PIC9-02核苷酸序列(SEQ ID NO: I)的5’端還連接有AscI酶切位點(diǎn)，所述PIC9-02核苷酸序列(SEQ ID NO: I)的3’端還連接有SpeI酶切位點(diǎn)。同時(shí)，合成PIC9-02取代核苷酸序列(如序列表中SEQ ID N0:3所示)，其為所述PIC9-02氨基酸序列(如序列表中SEQ ID NO: 2所示)中第674位Cys替換為T(mén)yr ;合成的所述PIC9-02取代核苷酸序列(SEQ ID N0:3)的5’端還連接有AscI酶切位點(diǎn)，所述PIC9-02取代核苷酸序列(SEQ ID N0:3)的3’端還連接有SpeI酶切位點(diǎn)。同時(shí)，合成PIC9-02缺失核苷酸序列(如序列表中SEQ ID N0:4所示)，其為所述PIC9-02氨基酸序列(如序列表中SEQ ID NO: 2所示)中缺失第641至650位氨基酸；合成的所述PIC9-02缺失核苷酸序列(SEQ ID N0:4)的5’端還連接有AscI酶切位點(diǎn)，所述PIC9-02缺失核苷酸序列(SEQ ID N0:4)的3’端還連接有SpeI酶切位點(diǎn)。同時(shí)，合成PIC9-02添加核苷酸序列(如序列表中SEQ ID N0:5所示)，其為所述PIC9-02氨基酸序列(如序列表中SEQ ID NO: 2所示)中在第699位后添加5個(gè)氨基酸Asp、Glu、Arg、Asn、Leu ;合成的所述PIC9-02添加核苷酸序列(SEQ ID N0:5)的5’端還連接有AscI酶切位點(diǎn)，所述PIC9-02添加核苷酸序列(SEQ ID NO: 5)的3’端還連接有SpeI酶切位點(diǎn)。第二實(shí)施例、重組表達(dá)載體的構(gòu)建及重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌I、構(gòu)建含有PIC9-02核苷酸序列的重組克隆載體DBN01-T將合成的PIC9-02核苷酸序列連入克隆載體pGEM-T (Promega, Madison, USA,CAT :A3600)上，操作步驟按Promega公司產(chǎn)品pGEM_T載體說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，得到重組克隆載體DBN01-T，其構(gòu)建流程如圖I所示(其中，Amp表示氨芐青霉素抗性基因；fl表示噬菌體fl的復(fù)制起點(diǎn)；LacZ為L(zhǎng)acZ起始密碼子；SP6為SP6 RNA聚合酶啟動(dòng)子；T7為Τ7 RNA聚合酶啟動(dòng)子；PIC9-02為PIC9-02核苷酸序列(SEQ ID NO: I) ；MCS為多克隆位點(diǎn))。然后將重組克隆載體DBN01-T用熱激方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌Tl感受態(tài)細(xì)胞(Transgen, Beijing, China ；Cat. No :0)501),其熱激條件為50 μ I 大腸桿菌 Tl 感受態(tài)細(xì)胞、10 μ I質(zhì)粒DNA (重組克隆載體DBN01-T)，42°C水浴30秒；37°C水浴I小時(shí)(IOOrpm轉(zhuǎn)速下?lián)u床搖動(dòng))，在表面涂有X-gal (5-溴-4-氯-3-吲哚-β -D-半乳糖苷)的氨芐青霉素(100毫克/升)的LB平板(胰蛋白胨10g/L,酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L,瓊脂15g/L，用NaOH調(diào)pH至7. 5)上生長(zhǎng)過(guò)夜。挑取白色菌落，在LB液體培養(yǎng)基(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，氨芐青霉素100mg/L，用NaOH調(diào)pH至7. 5)中于溫度37°C條件下培養(yǎng)過(guò)夜。堿法提取其質(zhì)粒將菌液在12000rpm轉(zhuǎn)速下離心Imin,去上清液,沉淀菌體用100 μ I 冰預(yù)冷的溶液 I (25mM Tris-HCl, IOmM EDTA (乙二胺四乙酸)，50mM 葡萄糖，ρΗ8· 0)懸?。患尤?50 μ I新配制的溶液II (0. 2Μ NaOH, 1% SDS (十二烷基硫酸鈉))，將管子顛倒4次，混合，置冰上3-5min ;加入150 μ I冰冷的溶液ΙΙΙ(4Μ醋酸鉀，2Μ醋酸)，立即充分混勻，冰上放置5-10min ;于溫度4°C、轉(zhuǎn)速12000rpm條件下離心5min，在上清液中加入2倍體積無(wú)水乙醇，混勻后室溫放置5min ;于溫度4°C、轉(zhuǎn)速12000rpm條件下離心5min,棄上清液，沉淀用質(zhì)量濃度為70%的乙醇洗滌后晾干；加入30μ I含Rnase(20l·! g/ml)的TE(10mMTris-HCl, ImM EDTA, PH8. 0)溶解沉淀；于溫度37°C下水浴30min，消化RNA ;于溫度_20°C保存?zhèn)溆?。提取的質(zhì)粒經(jīng)AscI和SpeI酶切鑒定后，對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果表明重組克隆載體DBN01-T中插入的所述PIC9-02核苷酸序列為序列表中SEQ ID NO: I所示的核苷酸序列，即PIC9-02核苷酸序列正確插入?！ぁぐ凑丈鲜鰳?gòu)建重組克隆載體DBN01-T的方法，將合成的所述PIC9-02取代核苷酸序列連入克隆載體pGEM-T上，得到重組克隆載體DBN02-T，其中，miPIC9_02為PIC9-02取代核苷酸序列(SEQ ID N0:3)。酶切和測(cè)序驗(yàn)證重組克隆載體DBN02-T中所述PIC9-02取代核苷酸序列正確插入。按照上述構(gòu)建重組克隆載體DBN01-T的方法，將合成的所述PIC9-02缺失核苷酸序列連入克隆載體pGEM-T上，得到重組克隆載體DBN03-T，其中，mdPIC9_02為PIC9-02缺失核苷酸序列(SEQ ID N0:4)。酶切和測(cè)序驗(yàn)證重組克隆載體DBN03-T中所述PIC9-02缺失核苷酸序列正確插入。按照上述構(gòu)建重組克隆載體DBN01-T的方法，將合成的所述PIC9-02添加核苷酸序列連入克隆載體pGEM-T上，得到重組克隆載體DBN04-T，其中，maPIC9_02為PIC9-02添加核苷酸序列(SEQ ID NO: 5)。酶切和測(cè)序驗(yàn)證重組克隆載體DBN04-T中所述PIC9-02添加核苷酸序列正確插入。2、構(gòu)建含有PIC9-02核苷酸序列的重組表達(dá)載體DBN100146用限制性?xún)?nèi)切酶AscI和SpeI分別酶切重組克隆載體DBN01-T和表達(dá)載體DBNBC-01 (載體骨架pCAMBIA2301 (CAMBIA機(jī)構(gòu)可以提供))，將切下的PIC9-02核苷酸序列片段插到表達(dá)載體DBNBC-01的AscI和SpeI位點(diǎn)之間，利用常規(guī)的酶切方法構(gòu)建載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，表達(dá)載體DBNBC-01中的AscI和SpeI酶切位點(diǎn)也是利用常規(guī)的酶切方法引入的，構(gòu)建成重組表達(dá)載體DBN100146，其構(gòu)建流程如圖2所示(Kan :卡那霉素基因；RB :右邊界；Ubi :玉米Ubiquitin (泛素)基因啟動(dòng)子(SEQ ID NO:6) ;PIC9_02 PIC9-02核苷酸序列(SEQ ID NO: I) ;Nos :胭脂堿合成酶的終止子(SEQ ID NO:7) ；PMI :磷酸甘露糖異構(gòu)酶基因(SEQ ID N0:8) ;LB :左邊界)。將重組表達(dá)載體DBN100146用熱激方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌Tl感受態(tài)細(xì)胞，其熱激條件為50μ I大腸桿菌Tl感受態(tài)細(xì)胞、10 μ I質(zhì)粒DNA (重組表達(dá)載體DBN100146)，42°C水浴30秒；37°C水浴I小時(shí)(IOOrpm轉(zhuǎn)速下?lián)u床搖動(dòng));然后在含50mg/L卡那霉素(Kanamycin)的LB固體平板(胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，瓊脂15g/L，用NaOH調(diào)pH至7. 5 )上于溫度37°C條件下培養(yǎng)12小時(shí)，挑取白色菌落，在LB液體培養(yǎng)基(胰蛋白胨IOg/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，卡那霉素50mg/L，用NaOH調(diào)pH至7. 5)中于溫度37°C條件下培養(yǎng)過(guò)夜。堿法提取其質(zhì)粒。將提取的質(zhì)粒用限制性?xún)?nèi)切酶AscI和SpeI酶切后鑒定，并將陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序鑒定，結(jié)果表明重組表達(dá)載體DBN100146在AscI和SpeI位點(diǎn)間的核苷酸序列為序列表中SEQ ID NO: I所示核苷酸序列，即PIC9-02核苷酸序列。按照上述構(gòu)建重組表達(dá)載體DBN100146的方法，將AscI和SpeI酶切重組克隆載體DBN02-T切下的所述PIC9-02取代核苷酸序列插入表達(dá)載體DBNBC-Ol，得到重組表達(dá)載體DBN100146-i。酶切和測(cè)序驗(yàn)證重組表達(dá)載體DBN100146_i在AscI和SpeI位點(diǎn)間即為所述PIC9-02取代核苷酸序列。按照上述構(gòu)建重組表達(dá)載體DBN100146的方法，將AscI和SpeI酶切重組克隆載體DBN03-T切下的所述PIC9-02缺失核苷酸序列插入表達(dá)載體DBNBC-Ol，得到重組表達(dá)載體DBN100146-d。酶切和測(cè)序驗(yàn)證重組表達(dá)載體DBN100146_d在AscI和SpeI位點(diǎn)間即為所述PIC9-02缺失核苷酸序列。·按照上述構(gòu)建重組表達(dá)載體DBN100146的方法，將AscI和SpeI酶切重組克隆載體DBN04-T切下的所述PIC9-02添加核苷酸序列插入表達(dá)載體DBNBC-Ol，得到重組表達(dá)載體DBN100146-a。酶切和測(cè)序驗(yàn)證重組表達(dá)載體DBN100146_a在AscI和SpeI位點(diǎn)間即為所述PIC9-02添加核苷酸序列。3、構(gòu)建含有已知序列的重組表達(dá)載體DBN100146R (正對(duì)照)按照本發(fā)明第二實(shí)施例中I所述的構(gòu)建含有PIC9-02核苷酸序列的重組克隆載體DBNOl-T的方法，利用已知序列(SEQ ID NO:9)構(gòu)建含有已知序列的重組克隆載體DBNOIR-To對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果表明重組克隆載體DBNOlR-T中插入的已知序列為序列表中SEQ ID N0:9所示的核苷酸序列，即已知序列正確插入。按照本發(fā)明第二實(shí)施例中2所述的構(gòu)建含有PIC9-02核苷酸序列的重組表達(dá)載體DBN100146的方法，利用已知序列構(gòu)建含有已知序列的重組表達(dá)載體DBN100146R，其構(gòu)建流程如圖3所示(載體骨架pCAMBIA2301 (CAMBIA機(jī)構(gòu)可以提供)；Kan :卡那霉素基因；RB :右邊界;Ubi :玉米Ubiquitin (泛素)基因啟動(dòng)子(SEQ ID N0:6);mR :已知序列(SEQ IDN0:9) ;Nos :胭脂堿合成酶的終止子(SEQ ID NO: 7) ;PMI :磷酸甘露糖異構(gòu)酶基因(SEQ IDN0:8)；LB :左邊界)。對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果表明重組表達(dá)載體DBN100146R中插入的已知序列為序列表中SEQ ID N0:9所示的核苷酸序列，即已知序列正確插入。4、重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌對(duì)己經(jīng)構(gòu)建正確的重組表達(dá)載體DBN100146、DBN100146_i、DBN100146_d、DBN100146-a和DBN100146R (已知序列)用液氮法轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌LBA4404 (Invitrgen,Chicago, USA ;Cat. No :18313-015)中，其轉(zhuǎn)化條件為100 μ L 農(nóng)桿菌 LBA4404、3 μ L 質(zhì)粒DNA (重組表達(dá)載體);置于液氮中10分鐘，37°C溫水浴10分鐘；將轉(zhuǎn)化后的農(nóng)桿菌LBA4404接種于LB試管中于溫度28°C、轉(zhuǎn)速為200rpm條件下培養(yǎng)2小時(shí)，涂于含50mg/L的利福平(Rifampicin)和100mg/L的卡那霉素(Kanamycin)的LB平板上直至長(zhǎng)出陽(yáng)性單克隆,挑取單克隆培養(yǎng)并提取其質(zhì)粒，用限制性?xún)?nèi)切酶BglII和AatII酶切后進(jìn)行酶切驗(yàn)證，結(jié)果表明重組表達(dá)載體 DBN100146、DBN100146_i、DBN100146_d、DBN100146_a 和 DBN100146R (已知序列)結(jié)構(gòu)完全正確。第三實(shí)施例、轉(zhuǎn)入PIC9-02核苷酸序列的玉米植株的獲得及驗(yàn)證I、獲得轉(zhuǎn)入PIC9-02核苷酸序列的玉米植株按照常規(guī)采用的農(nóng)桿菌侵染法，將無(wú)菌培養(yǎng)的玉米品種綜31 (Z31)的幼胚與第二實(shí)施例中4所述的農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，以將第二實(shí)施例中2和3構(gòu)建的重組表達(dá)載體DBN100146、DBN100146-i、DBN100146-d、DBN100146-a 和 DBN100146R (已知序列)中的 T-DNA(包括玉米Ubiquitin基因的啟動(dòng)子序列、PIC9-02核苷酸序列、PIC9-02取代核苷酸序列、PIC9-02缺失核苷酸序列、PIC9-02添加核苷酸序列、已知序列、PMI基因和Nos終止子序列)轉(zhuǎn)入到玉米染色體組中，獲得了轉(zhuǎn)入PIC9-02核苷酸序列的玉米植 株、轉(zhuǎn)入PIC9-02取代核苷酸序列的玉米植株、轉(zhuǎn)入PIC9-02缺失核苷酸序列的玉米植株、轉(zhuǎn)入PIC9-02添加核苷酸序列的玉米植株和轉(zhuǎn)入已知序列的玉米植株(正對(duì)照)；同時(shí)以野生型玉米植株作為負(fù)對(duì)照。對(duì)于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米轉(zhuǎn)化，簡(jiǎn)要地，從玉米中分離未成熟的幼胚，用農(nóng)桿菌懸浮液接觸幼胚，其中農(nóng)桿菌能夠?qū)IC9-02核苷酸序列傳遞至幼胚之一的至少一個(gè)細(xì)胞(步驟I :侵染步驟)，所述啟動(dòng)子可操作地與PIC9-02核苷酸序列相連。在此步驟中，幼胚優(yōu)選地浸入農(nóng)桿菌懸浮液(OD66tl=O. 4-0. 6，侵染培養(yǎng)基(MS鹽4. 3g/L、MS維他命、干酪素300mg/L、鹿糖 68. 5g/L、葡萄糖 36g/L、乙酰丁香酮(AS) 40mg/L、2, 4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D) Img/L，pH5. 3))中以啟動(dòng)接種。幼胚與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)一段時(shí)期(3天)(步驟2:共培養(yǎng)步驟)。優(yōu)選地，幼胚在侵染步驟后在固體培養(yǎng)基(MS鹽4. 3g/L、MS維他命、干酪素300mg/L、蔗糖20g/L、葡萄糖 10g/L、乙酰丁香酮(AS)100mg/L、2, 4-二氯苯氧乙酸(2，4_D)lmg/L、瓊脂8g/L，pH5.8)上培養(yǎng)。在此共培養(yǎng)階段后，可以有一個(gè)選擇性的“恢復(fù)”步驟。在“恢復(fù)”步驟中，恢復(fù)培養(yǎng)基(MS鹽4. 3g/L、MS維他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D) lmg/L、瓊脂8g/L, pH5. 8)中至少存在一種己知抑制農(nóng)桿菌生長(zhǎng)的抗生素(頭孢霉素)，不添加植物轉(zhuǎn)化體的選擇劑(步驟3 :恢復(fù)步驟)。優(yōu)選地，幼胚在有抗生素但沒(méi)有選擇劑的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，以消除農(nóng)桿菌并為侵染細(xì)胞提供恢復(fù)期。接著，接種的幼胚在含選擇劑(甘露糖)的培養(yǎng)基上培養(yǎng)并選擇生長(zhǎng)著的轉(zhuǎn)化愈傷組織(步驟4 :選擇步驟)。優(yōu)選地，幼胚在有選擇劑的篩選固體培養(yǎng)基(MS鹽4. 3g/L、MS維他命、干酪素300mg/L、蔗糖5g/L、甘露糖12. 5g/L、2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D) lmg/L、瓊脂8g/L，pH5. 8)上培養(yǎng)，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化的細(xì)胞選擇性生長(zhǎng)。然后，愈傷組織再生成植物(步驟5 :再生步驟)，優(yōu)選地，在含選擇劑的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的愈傷組織在固體培養(yǎng)基(MS分化培養(yǎng)基和MS生根培養(yǎng)基)上培養(yǎng)以再生植物。篩選得到的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移到所述MS分化培養(yǎng)基(MS鹽4. 3g/L、MS維他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、6-芐基腺嘌呤2mg/L、甘露糖5g/L、瓊脂8g/L，pH5. 8)上，25°C下培養(yǎng)分化。分化出來(lái)的小苗轉(zhuǎn)移到所述MS生根培養(yǎng)基(MS鹽2. 15g/L、MS維他命、干酪素300mg/L、蔗糖30g/L、吲哚-3-乙酸lmg/L、瓊脂8g/L，pH5. 8)上，25°C下培養(yǎng)至約IOcm高，移至溫室培養(yǎng)至結(jié)實(shí)。在溫室中，每天于28°C下培養(yǎng)16小時(shí)，再于20°C下培養(yǎng)8小時(shí)。2、用TaqMan驗(yàn)證轉(zhuǎn)入PIC9-02核苷酸序列的玉米植株分別取轉(zhuǎn)入PIC9-02核苷酸序列的玉米植株、轉(zhuǎn)入PIC9-02取代核苷酸序列的玉米植株、轉(zhuǎn)入PIC9-02缺失核苷酸序列的玉米植株、轉(zhuǎn)入PIC9-02添加核苷酸序列的玉米植株和轉(zhuǎn)入已知序列的玉米植株的葉片約IOOmg作為樣品,用Qiagen的DNeasy Plant MaxiKit提取其基因組DNA，通過(guò)Taqman探針熒光定量PCR方法檢測(cè)PIC9基因的拷貝數(shù)。同時(shí)以野生型玉米植株作為負(fù)對(duì)照，按照上述方法進(jìn)行檢測(cè)分析。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，取平均值。檢測(cè)PIC9基因拷貝數(shù)的具體方法如下步驟11、分別取轉(zhuǎn)入PIC9-02核苷酸序列的玉米植株、轉(zhuǎn)入PIC9-02取代核苷酸序列的玉米植株、轉(zhuǎn)入PIC9-02缺失核苷酸序列的玉米植株、轉(zhuǎn)入PIC9-02添加核苷酸序列的玉米植株、轉(zhuǎn)入已知序列的玉米植株和野生型玉米植株的葉片各lOOmg，分別在研缽中用液氮研成勻漿，每個(gè)樣品取3個(gè)重復(fù)；步驟12、使用Qiagen的DNeasy Plant Mini Kit提取上述樣品的基因組DNA,具體方法參考其產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)；步驟13、用NanoDrop 2000 (Thermo Scientific)測(cè)定上述樣品的基因組DNA濃度；·步驟14、調(diào)整上述樣品的基因組DNA濃度至同一濃度值，所述濃度值的范圍為80_100ng/μ I ；步驟15、采用Taqman探針熒光定量PCR方法鑒定樣品的拷貝數(shù)，以經(jīng)過(guò)鑒定已知拷貝數(shù)的樣品作為標(biāo)準(zhǔn)品，以野生型玉米植株的樣品作為負(fù)對(duì)照，每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)，取其平均值；熒光定量PCR引物和探針序列分別是以下引物和探針用來(lái)檢測(cè)PIC9-02核苷酸序列、PIC9-02取代核苷酸序列、PIC9-02缺失核苷酸序列和PIC9-02添加核苷酸序列引物I (CFl) :TCATTTGGGGCTTCGTCG 如序列表中 SEQ ID NO: 10 所示；引物2 (CRl) TGATTGATCAGCTGCTCAACCT 如序列表中 SEQ ID NO: 11 所示；探針I(yè) (CPl) :CCAGTGGGATGCGTTCCTCGCTC 如序列表中 SEQ ID NO: 12 所示；以下引物和探針用來(lái)檢測(cè)已知序列引物3 (CF2) CGACTATGCTGTTCGCTGGTAC 如序列表中 SEQ ID NO: 13 所示；引物4 (CR2) GTTGTACCTGACCCAATCACGAG 如序列表中 SEQ ID NO: 14 所示；探針2 (CP2) CGGTCCCCAAACACGTTCGAGTCC 如序列表中 SEQ ID NO: 15 所示；PCR反應(yīng)體系為
JumpStart Taq ReadyMix (Sigma)10μ1
50x引物/探針混合物Ιμ
基因組DNA3μ1
水(ddH20)6μ1所述50Χ引物/探針混合物包含ImM濃度的每種引物各45 μ 1，100 μ M濃度的探針50 μ I和860 μ I I X TE緩沖液，并且在4°C，貯藏在琥珀試管中。PCR反應(yīng)條件為步驟溫度時(shí)間
21950C5 分鐘
2295 0C30 秒
23600CI 分鐘
24回到步驟22，重復(fù)40次利用SDS2. 3 軟件(Applied Biosystems)分析數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PIC9-02核苷酸序列、PIC9-02取代核苷酸序列、PIC9-02缺失核苷酸序列、PIC9-02添加核苷酸序列和已知序列均己整合到所檢測(cè)的玉米植株的染色體組中，而且轉(zhuǎn)入PIC9-02核苷酸序列的玉米植株、轉(zhuǎn)入PIC9-02取代核苷酸序列的玉米植株、轉(zhuǎn)入PIC9-02缺失核苷酸序列的玉米植株、轉(zhuǎn)入PIC9-02添加核苷酸序列的玉米植株和轉(zhuǎn)·入已知序列的玉米植株均獲得了含有單拷貝PIC9基因和已知序列的轉(zhuǎn)基因玉米植株。第四實(shí)施例、轉(zhuǎn)基因玉米植株的殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)檢測(cè)I、轉(zhuǎn)基因玉米植株的殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)(PIC9蛋白)的含量檢測(cè)本實(shí)驗(yàn)中涉及的溶液如下萃取緩沖液8g/LNaCl, O. 2g/L KH2PO4, 2. 9g/L Na2HPO4.12H20，O. 2g/L KCl,5. 5ml/L 吐溫 20 (Tween-20), pH 7. 4 ；洗滌緩沖液PBST 8g/L NaCl，0· 2g/L KH2PO4, 2. 9g/L Na2HPO4* 12H20,0. 2g/L KCl，0. 5ml/L 吐溫 20 (Tween-20), pH 7. 4 ；終止液IMHCl。分別取3mg轉(zhuǎn)入PIC9-02核苷酸序列的玉米植株、轉(zhuǎn)入PIC9-02取代核苷酸序列的玉米植株、轉(zhuǎn)入PIC9-02缺失核苷酸序列的玉米植株、轉(zhuǎn)入PIC9-02添加核苷酸序列的玉米植株和轉(zhuǎn)入已知序列的玉米植株(正對(duì)照)的新鮮葉片作為樣品，液氮研磨后加入800 μ I所述萃取緩沖液，4000rpm的轉(zhuǎn)速下離心IOmin,取上清液用所述萃取緩沖液稀釋40倍,取80 μ I稀釋后的上清液用于ELISA檢測(cè)。鑒于所述PIC9-02的氨基酸序列第650至699位來(lái)自于CrylAb,且在所述PIC9-02氨基酸序列的Domain II處(即第300至500位)也與CrylAb具有較高一致性，使得CrylAb的抗體可用于檢測(cè)所述PIC9-02殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)。用ELISA (酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法)試劑盒(ENVIRL0GIX公司，CrylAb/CrylAc試劑盒)對(duì)樣品中殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)(PIC9蛋白)量占葉片鮮重的比例進(jìn)行檢測(cè)分析，具體方法參考其產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)。同時(shí)以野生型玉米植株和經(jīng)熒光定量PCR鑒定為非轉(zhuǎn)基因的玉米植株作為負(fù)對(duì)照，按照上述方法進(jìn)行檢測(cè)分析。轉(zhuǎn)入PIC9-02核苷酸序列的共20株轉(zhuǎn)化事件(即event)，轉(zhuǎn)入PIC9-02取代核苷酸序列的共10株轉(zhuǎn)化事件(即event)，轉(zhuǎn)入PIC9-02缺失核苷酸序列的共10株轉(zhuǎn)化事件(即event)，轉(zhuǎn)入PIC9-02添加核苷酸序列的共10株轉(zhuǎn)化事件(SPevent),轉(zhuǎn)入已知序列的共5株轉(zhuǎn)化事件(即event),經(jīng)突光定量PCR鑒定為非轉(zhuǎn)基因的(NGM)共3株，野生型的(CK)共3株；每株重復(fù)3次。轉(zhuǎn)基因玉米植株的殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)(PIC9-02蛋白)含量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表I所示。分別測(cè)得轉(zhuǎn)入PIC9-02核苷酸序列的玉米植株、轉(zhuǎn)入PIC9-02取代核苷酸序列的玉米植株、轉(zhuǎn)入PIC9-02缺失核苷酸序列的玉米植株、轉(zhuǎn)入PIC9-02添加核苷酸序列的玉米植株、轉(zhuǎn)入已知序列的玉米植株、野生型玉米植株和經(jīng)熒光定量PCR鑒定為非轉(zhuǎn)基因的玉米植株的新鮮葉片中殺蟲(chóng)蛋白(PIC9-02蛋白)平均表達(dá)量占葉片鮮重的比例(ng/g)分別為5444. 67、5304.12,4976. 46,5397. 71,2560. 48、0 和 O。表I、轉(zhuǎn)基因玉米植株的PIC9-02蛋白表達(dá)量測(cè)定平均結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)，其特征在于，包括 (a)具有SEQID NO:2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；或 (b)在(a)中的氨基酸序列經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有殺蟲(chóng)活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)；或 (c)通過(guò)包含SEQID NO: I的核苷酸序列的核酸分子的表達(dá)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)；或 (d)通過(guò)包含核苷酸序列的核酸分子的表達(dá)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，所述核苷酸序列具有在嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO: I的核苷酸序列雜交的互補(bǔ)序列；或 (e)通過(guò)包含核苷酸序列的核酸分子的表達(dá)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，所述核苷酸序列與(d)的核苷酸序列同類(lèi)編碼。
2.—種殺蟲(chóng)基因，其特征在于，包括 (a)編碼具有SEQID N0:2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的核苷酸序列；或 (b)編碼氨基酸序列的核苷酸序列，所述氨基酸序列為在(a)中的氨基酸序列經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有殺蟲(chóng)活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)；或 (c)具有SEQID NO: I所示的核苷酸序列；或 Cd)在嚴(yán)格條件下與(C)限定的核苷酸序列雜交且編碼具有殺蟲(chóng)活性的蛋白質(zhì)的核苷酸序列；或 (e)與(d)的核苷酸序列同類(lèi)編碼。
3.—種表達(dá)盒，其特征在于，包含在有效連接的調(diào)控序列調(diào)控下的權(quán)利要求2所述殺蟲(chóng)基因。
4.一種包含權(quán)利要求2所述殺蟲(chóng)基因或權(quán)利要求3所述表達(dá)盒的重組載體。
5.一種包含權(quán)利要求2所述殺蟲(chóng)基因或權(quán)利要求3所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因宿主生物，其特征在于，包括植物細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞、細(xì)菌、酵母、桿狀病毒、線蟲(chóng)或藻類(lèi)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述轉(zhuǎn)基因宿主生物，其特征在于，所述植物為玉米、大豆、棉花、水稻或小麥。
7.—種產(chǎn)生殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)的方法，其特征在于，包括 獲得權(quán)利要求5或6所述轉(zhuǎn)基因宿主生物的細(xì)胞； 在允許產(chǎn)生殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)基因宿主生物的細(xì)胞； 回收所述殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)。
8.一種用于增加昆蟲(chóng)靶范圍的方法，其特征在于，包括將權(quán)利要求3所述表達(dá)盒在植物中與至少一種不同于權(quán)利要求3所述表達(dá)盒編碼的殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)的第二種殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)一起表達(dá)。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述用于增加昆蟲(chóng)靶范圍的方法，其特征在于，所述第二種殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)為Vip類(lèi)殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)、蛋白酶抑制劑、凝集素、a -淀粉酶或過(guò)氧化物酶。
10.一種產(chǎn)生抗蟲(chóng)植物的方法，其特征在于，包括將權(quán)利要求2所述殺蟲(chóng)基因或權(quán)利要求3所述表達(dá)盒或權(quán)利要求4所述重組載體導(dǎo)入植物。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述產(chǎn)生抗蟲(chóng)植物的方法，其特征在于，所述植物為玉米、大豆、棉花、水稻或小麥。
12.一種用于保護(hù)植物免受由昆蟲(chóng)害蟲(chóng)引起的損傷的方法，其特征在于，包括將權(quán)利要求2所述殺蟲(chóng)基因或權(quán)利要求3所述表達(dá)盒或權(quán)利要求4所述重組載體導(dǎo)入植物，使導(dǎo)入后的植物產(chǎn)生足夠保護(hù)其免受昆蟲(chóng)害蟲(chóng)侵害量的殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述用于保護(hù)植物免受由昆蟲(chóng)害蟲(chóng)引起的損傷的方法，其特征在于，所述植物為玉米、大豆、棉花、水稻或小麥。
14.一種控制昆蟲(chóng)害蟲(chóng)的方法,其特征在于,包括使昆蟲(chóng)害蟲(chóng)與抑制量的權(quán)利要求I所述殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)或由權(quán)利要求2所述殺蟲(chóng)基因編碼的昆蟲(chóng)抑制性蛋白質(zhì)接觸。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述控制昆蟲(chóng)害蟲(chóng)的方法，其特征在于，所述昆蟲(chóng)害蟲(chóng)是鱗翅目昆蟲(chóng)害蟲(chóng)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)、其編碼基因及用途，殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)包括(a)具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；或(b)在(a)中的氨基酸序列經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有殺蟲(chóng)活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)；或(c)通過(guò)包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列的核酸分子的表達(dá)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)；或(d)通過(guò)包含核苷酸序列的核酸分子的表達(dá)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，所述核苷酸序列具有在嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO:1的核苷酸序列雜交的互補(bǔ)序列；或(e)通過(guò)包含核苷酸序列的核酸分子的表達(dá)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，所述核苷酸序列與(d)的核苷酸序列同類(lèi)編碼。本發(fā)明殺蟲(chóng)蛋白質(zhì)表達(dá)量高且對(duì)昆蟲(chóng)害蟲(chóng)的毒力強(qiáng)。
文檔編號(hào)C12N7/01GK102786585SQ20121027351
公開(kāi)日2012年11月21日 申請(qǐng)日期2012年8月2日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月2日
發(fā)明者龐潔, 張愛(ài)紅, 牛麗紅, 牛瑞琪, 王娜, 祁玉潔, 黃金存 申請(qǐng)人:北京大北農(nóng)科技集團(tuán)股份有限公司, 北京大北農(nóng)科技集團(tuán)股份有限公司生物技術(shù)中心