一種檢測萬古霉素的試紙條及方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測萬古霉素的試紙條及方法。試紙條包括微孔試劑和試紙，所述微孔試劑中凍干有膠體金標(biāo)記的萬古霉素特異性抗體，所述萬古霉素特異性抗體為萬古霉素單克隆抗體；所述試紙由樣品吸收墊、反應(yīng)膜、吸水墊、保護(hù)膜、底板依次連接組成，所述反應(yīng)膜上包括檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)，檢測區(qū)包被有萬古霉素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物，質(zhì)控區(qū)包被有抗抗體。用本發(fā)明試紙條檢測萬古霉素的方法簡便、快速、直觀、準(zhǔn)確、便于攜帶、適用范圍廣、成本低、易推廣使用。
【專利說明】一種檢測萬古霉素的試紙條及方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種檢測萬古霉素的試紙條及方法，具體涉及一種用于檢測萬古霉素的膠體金試紙條，其特別適于牛奶中萬古霉素殘留的檢測。
技術(shù)背景
[0002]萬古霉素(vancomycin，VCM)，又名凡古霉素、凡可霉素，是一種多肽類抗生素，分子式為C66H75Cl2N9O24,分子量1485.72。通常以鹽酸鹽形式存在，為白色至淡棕色粉末，無臭，味苦。在水中易溶，在甲醇中微溶，在丙酮、丁醇或乙醚中不溶，在溶液中能被多種重金屬鹽類沉淀。萬古霉素，作為一種從微生物Streptomyces orientalis分離得到的多肽類抗生素，它對革蘭氏陽性菌有很好的抑制作用，但因其不能穿透外部的滲透屏障，它對革蘭氏陰性菌沒有療效。
[0003]多肽類抗生素是由不同類型的氨基酸縮合而成的小分子肽類，主要用于促進(jìn)動物生長及治療畜禽疾病。目前，多肽類抗生素被廣泛用于家禽、豬、牛等飼料添加劑和獸藥。常用的多肽類抗生素包括粘桿菌素、桿菌肽、維吉尼霉素及萬古霉素等。然而，隨著多肽類抗生素的廣泛使用，濫用及不遵守休藥期等現(xiàn)象時有發(fā)生。藥物將可能通過食物鏈的傳遞進(jìn)入人體，危害人體健康。如果長期暴露，還會增加細(xì)菌的抗藥性，具有潛在的健康風(fēng)險和生態(tài)風(fēng)險。多肽類抗生素可分別抗革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、綠膿桿菌、真菌、病毒、螺旋體、原蟲的感染，特別是對牛乳腺炎等疾病有較好的療效。目前，歐盟、日本、美國、澳大利亞等均已制定牛奶中多種多肽類抗生素的限量。其中，歐盟對桿菌肽A及粘桿菌素的限量分別為100和50 μ g/kg;日本對桿菌肽A、維吉尼霉素、萬古霉素、粘桿菌素的限量分別為400,100,10和10yg/kg。而我國也于近年制定了牛奶中桿菌肽A及粘桿菌素的限量，分別為500和50yg/kg。關(guān)于多肽類抗生素的檢測方法逐漸引起了關(guān)注。
[0004]目前，多肽類抗生素檢測方法包括微生物法、免疫分析法、高效液相色譜法(HPLC)、毛細(xì)管電泳法等，但這些方法均存在靈敏度低等問題，無法滿足檢出限要求；而單獨(dú)檢測萬古霉素的方法包括高效液相色譜法、分光光度法、熒光偏振免疫分析法、毛細(xì)管電泳法、微生物分析法和薄層色譜法，其中。微生物法檢測耗時長，缺乏特異性，且所用細(xì)菌對不同種類的抗菌藥物敏感性存在差異，易導(dǎo)致假陰性和假陽性產(chǎn)生；儀器分析法樣品前處理過程復(fù)雜，儀器化程度高且價格昂貴，分析速度慢，僅適用于樣品的確證分析，不適合大批量樣品的篩選及現(xiàn)場檢測。并且關(guān)于牛奶中萬古霉素檢測的研究尚未見報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的一個目的是提供一種檢測萬古霉素的試紙條。
[0006]本發(fā)明所提供的試紙條包括微孔試劑和試紙，微孔試劑具有微孔塞，試紙包括底板、樣品吸收墊、反應(yīng)膜、吸水墊、保護(hù)膜，其依次連接；所述微孔試劑中凍干有萬古霉素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物；反應(yīng)膜上包括檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)，檢測區(qū)包被萬古霉素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物，質(zhì)控區(qū)包被羊抗鼠抗抗體。[0007]所述萬古霉素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物是由萬古霉素半抗原與載體蛋白偶聯(lián)得至IJ，所述萬古霉素半抗原是由萬古霉素與琥珀酸酐反應(yīng)得到，所述載體蛋白可為牛血清白蛋白、卵清蛋白、血藍(lán)蛋白、甲狀腺蛋白、人血清白蛋白。
[0008]所述萬古霉素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物中的萬古霉素單克隆抗體是以萬古霉素半抗原-載體蛋白作為免疫原制備獲得，由萬古霉素單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株E-1-3CGMCC N0.6234 分泌獲得。
[0009]所述樣品吸收墊上粘貼有保護(hù)膜，為檢測端，上面有MAX標(biāo)記線。
[0010]所述檢測區(qū)位于近于有MAX標(biāo)記的保護(hù)膜的一端，所述質(zhì)控區(qū)位于遠(yuǎn)離有MAX標(biāo)記的保護(hù)膜的一端。
[0011]所述底板可為PVC底板或其他硬質(zhì)不吸水的材料；所述樣品吸收墊可為吸濾紙或濾油紙；所述吸水墊為吸水紙；所述反應(yīng)膜可為硝酸纖維素膜或醋酸纖維素膜；所述保護(hù)膜為PE材質(zhì)保護(hù)膜。
[0012]本發(fā)明的另一個目的是提供一種制備上述試紙條的方法，其包括步驟:
[0013]I)制備凍干有萬古霉素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物的微孔試劑；
[0014]2)制備具有包被萬古霉素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物的檢測區(qū)和包被羊抗鼠抗抗體的質(zhì)控區(qū)的反應(yīng)膜；
[0015]3)將2)制備好的反應(yīng)膜與樣品吸收墊、吸水墊、保護(hù)膜、底板組裝成試紙；
[0016]4)將I)和3)制備好的凍干有萬古霉素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物的微孔試劑和試紙組裝成試紙條。
[0017]具體地說，步驟包括:
[0018]I)將萬古霉素與琥珀酸酐反應(yīng)，制備萬古霉素半抗原；
[0019]2 )將萬古霉素半抗原與載體蛋白偶聯(lián)，制備萬古霉素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物；
[0020]3)用萬古霉素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物免疫小鼠，將小鼠脾細(xì)胞和小鼠骨髓瘤細(xì)胞通過融合、篩選，得到分泌萬古霉素單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株；
[0021]4)提取小鼠IgG免疫健康山羊，得到羊抗鼠抗抗體；
[0022]5)分別將萬古霉素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物和羊抗鼠抗抗體包被于反應(yīng)膜的檢測區(qū)(T)和質(zhì)控區(qū)(C)；
[0023]6)用檸檬酸三鈉與氯金酸反應(yīng)制備膠體金；
[0024]7)將制備的萬古霉素單克隆抗體加入到制備的膠體金中，得到萬古霉素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物；
[0025]8)將萬古霉素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物凍干在微孔試劑中后，將微孔試劑加上微孔塞；
[0026]9)將樣品吸收墊用含0.5%牛血清白蛋白(體積百分含量)、pH為7.2,0.lmol/L磷酸鹽緩沖液浸泡2h，37°C下烘干2h ；
[0027]10)在底板上按順序粘貼上樣品吸收墊、反應(yīng)膜、吸水墊和保護(hù)膜；
[0028]11)將制備好的微孔試劑和試紙組裝成試紙條，2?8°C條件下保存12個月。
[0029]本發(fā)明的另一個目的是提供一種應(yīng)用上述試紙條檢測牛奶中萬古霉素殘留的方法，它包括步驟:
[0030](I)用試紙條進(jìn)行檢測；[0031](2)分析檢測結(jié)果。
[0032]本發(fā)明試紙條的檢測原理:將待檢牛奶樣本滴加于微孔試劑中，混勻后，孵育5min,將試紙標(biāo)有MAX標(biāo)記線端向下，插入鮮育后的微孔試劑中，待檢樣品液與微孔中的金標(biāo)抗體結(jié)合后一起向反應(yīng)膜擴(kuò)散；若待檢樣品液中萬古霉素的含量高，則擴(kuò)散過程中待檢樣品液中的萬古霉素可與金標(biāo)抗體相結(jié)合，進(jìn)而完全封閉金標(biāo)抗體上萬古霉素的抗原結(jié)合點(diǎn)，阻止金標(biāo)抗體與反應(yīng)膜上萬古霉素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物結(jié)合，檢測區(qū)不顯色，而抗抗體則可與金標(biāo)抗體結(jié)合，質(zhì)控區(qū)顯色；若待檢樣品液中萬古霉素的含量低或無，則金標(biāo)抗體上的抗原結(jié)合位點(diǎn)不能被封閉，進(jìn)而金標(biāo)抗體會與反應(yīng)膜上萬古霉素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)抗原結(jié)合，檢測區(qū)顯色，同時抗抗體也可與金標(biāo)抗體結(jié)合，質(zhì)控區(qū)顯色。如果質(zhì)控區(qū)不顯色，則試紙失效。如圖4所示。
[0033]陽性:當(dāng)質(zhì)控區(qū)(C)顯示出紅色條帶，而檢測區(qū)(T)不顯色時，判為陽性。
[0034]陰性:當(dāng)質(zhì)控區(qū)(C)顯示出紅色條帶，檢測區(qū)(T)同時也顯示出紅色條帶，判為陰性。
[0035]無效:當(dāng)質(zhì)控區(qū)(C)不顯示出紅色條帶，則無論檢測區(qū)(T)顯示出紅色條帶與否，該試紙均判為無效。
[0036]本發(fā)明的試紙條具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、成本低、操作簡單、檢測時間短、適合各種單位使用、儲存簡單、保質(zhì)期長的優(yōu)點(diǎn)。其中，采用高特異性的萬古霉素單克隆抗體，保證了檢測結(jié)果的可靠性；將金標(biāo)抗體凍干在微孔試劑中，在檢測過程中，能夠使金標(biāo)抗體與待檢樣品液充分接觸，充分反應(yīng)，從而減少誤差，增加整個體系的反應(yīng)靈敏度。用本發(fā)明試紙條檢測萬古霉素的方法，簡便、快速、直觀、準(zhǔn)確、適用范圍廣、成本低、易推廣使用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0037]圖1為試紙剖面結(jié)構(gòu)示意圖。
[0038]圖2為試紙俯視圖。
[0039]圖3為微孔試劑圖。
[0040]圖4為試紙檢測結(jié)果判定圖。
【具體實(shí)施方式】
[0041 ] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0042]實(shí)施例1檢測萬古霉素的試紙條的構(gòu)成
[0043]一、試紙(圖1)
[0044]所述試紙是由底板、樣品吸收墊、反應(yīng)膜、吸水墊、保護(hù)膜組成；
[0045]所述樣品吸收墊1、反應(yīng)膜2、吸水墊3和保護(hù)膜7依次按順序粘貼在底板6上，樣品吸收墊的末端與反應(yīng)膜相連，反應(yīng)膜的末端與吸水墊相連，樣品吸收墊的始端與底板的始端對齊，吸水墊的末端與底板的末端對齊；
[0046]所述試紙粘貼有保護(hù)膜，保護(hù)膜7覆蓋在樣品吸收墊上，為檢測端，上面印有MAX字樣(圖2)；
[0047]所述反應(yīng)膜上有檢測區(qū)4和質(zhì)控區(qū)5，均呈與所述試紙的長相垂直的條帶狀，檢測區(qū)位于近于有MAX標(biāo)記的保護(hù)膜的一端，質(zhì)控區(qū)位于遠(yuǎn)離有MAX標(biāo)記的保護(hù)膜的一端，檢測區(qū)包被有萬古霉素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物(萬古霉素半抗原-卵清蛋白的偶聯(lián)物)，質(zhì)控區(qū)包被有羊抗鼠抗抗體；
[0048]所述底板為PVC底板；所述樣品吸收墊為吸濾紙；所述吸水墊為吸水紙；所述反應(yīng)膜為硝酸纖維素膜；所述保護(hù)膜為PE材質(zhì)保護(hù)膜。
[0049]二、微孔試劑(圖3)
[0050]所述微孔試劑8上凍干有萬古霉素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物；所述微孔試劑具有微孔塞9。
[0051]將上述試紙與微孔試劑組裝成試紙條，在疒8°C環(huán)境中保存，有效期12個月。
[0052]實(shí)施例2實(shí)施例1中所述試紙條的制備方法
[0053]一、試紙條的制備
[0054]該試紙條的制備方法主要包括以下步驟:
[0055]I)制備凍干有萬古霉素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物的微孔試劑；
[0056]2)制備具有包被萬古霉素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物的檢測區(qū)和包被羊抗鼠抗抗體的質(zhì)控區(qū)的反應(yīng)膜；
[0057]3)將2)制備好的反應(yīng)膜與樣品吸收墊、吸水墊、保護(hù)膜、底板組裝成試紙；
[0058]4)將I)和3)制備好的凍干有萬古霉素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物的微孔試劑和試紙組裝成試紙條。
[0059]下面分步詳細(xì)敘述:
[0060](一)各部件的制備
[0061]1.萬古霉素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物的合成與鑒定
[0062]萬古霉素是小分子物質(zhì)，只有免疫反應(yīng)性，沒有免疫原性，不能誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，必須與大分子載體蛋白偶聯(lián)后才具有免疫原性。
[0063](I)萬古霉素半抗原的制備
[0064]0.50g萬古霉素、0.40琥珀酸酐和2ml吡啶在IOml 二甲基亞砜(DMSO)中的混合液，在80°C下攪拌反應(yīng)10h，蒸除溶劑，柱層析后在乙醇-水體系中重結(jié)晶得到萬古霉素單琥珀酸酰胺，即為萬古霉素半抗原。
[0065](2)免疫原的制備——萬古霉素半抗原與牛血清白蛋白偶聯(lián)物合成
[0066]取15mg半抗原,溶解于Iml N, N- 二甲基甲酰胺中，取碳化二亞胺和N-輕基琥拍酰亞胺各30mg用0.2ml水充分溶解后加入半抗原溶液中，室溫下攪拌24h，即可得到反應(yīng)液A ;稱取牛血清白蛋白50mg，使之充分溶解在3.8ml PBS (pH 7.2)中，將反應(yīng)液A逐滴緩慢滴加到蛋白溶液中，并于室溫下攪拌24h,用0.01mol/L PBS 4°C透析3d,每天換3次透析液，以除去未反應(yīng)的小分子物質(zhì)；分裝，于_20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0067](3)包被原的制備——萬古霉素半抗原與卵清蛋白偶聯(lián)物合成
[0068]取15mg半抗原,溶解于Iml N, N- 二甲基甲酰胺中，取碳化二亞胺和N-輕基琥拍酰亞胺各30mg用0.2ml水充分溶解后加入半抗原溶液中，室溫下攪拌24h，即可得到反應(yīng)液A ;稱取卵清蛋白白50mg，使之充分溶解在3.8ml PBS (pH 7.2)中，將反應(yīng)液A逐滴緩慢滴加到蛋白溶液中，并于室溫下攪拌24h,用0.01mol/L PBS 4°C透析3d,每天換3次透析液，以除去未反應(yīng)的小分子物質(zhì)；分裝，于_20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0069](4)萬古霉素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物的鑒定[0070]將萬古霉素半抗原、載體蛋白、萬古霉素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物用pH7.4的PBS配成0.5mg/ml的溶液，以0.01mol/L ρΗ7.4 PBS調(diào)零，用紫外分光光度計在波長20(T800nm范圍內(nèi)掃描，得到萬古霉素半抗原、載體蛋白、萬古霉素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物的吸收曲線。三者出現(xiàn)不同的吸收曲線，表明萬古霉素半抗原與載體蛋白偶聯(lián)成功。
[0071]2.萬古霉素單克隆抗體的制備
[0072]( I)動物免疫
[0073]將步驟I得到的免疫原注入Balb/c小鼠體內(nèi)，免疫劑量為150 μ g/只，使其產(chǎn)生
抗血清。
[0074](2)細(xì)胞融合和克隆化
[0075]取免疫Balb/c小鼠脾細(xì)胞，按8:1 (數(shù)量配比)比例與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，采用間接競爭ELISA測定細(xì)胞上清液，篩選陽性孔。利用有限稀釋法對陽性孔進(jìn)行克隆化，直到得到分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，并意外發(fā)現(xiàn)，其中一株效價顯著高于其它雜交瘤細(xì)胞株，將該萬古霉素單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株命名為E-1-3，該細(xì)胞株已于2012年6月19日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所)，保藏號為CGMCC N0.6234。
[0076](3)細(xì)胞凍存和復(fù)蘇
[0077]將雜交瘤細(xì)胞用凍存液制成IX IO6個/ml的細(xì)胞懸液，在液氮中長期保存。復(fù)蘇時取出凍存管，立即放入37 °C水浴中速融，離心去除凍存液后，移入培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)。
[0078](4)單克隆抗體的制備與純化
[0079]增量培養(yǎng)法:將雜交瘤細(xì)胞置于細(xì)胞培養(yǎng)基中，在37°C條件下進(jìn)行培養(yǎng)，用辛酸-飽和硫酸銨法將得到的培養(yǎng)液進(jìn)行純化，得到單克隆抗體，_20°C保存。
[0080]所述細(xì)胞培養(yǎng)基為向RPMI1640培養(yǎng)基中添加小牛血清和碳酸氫鈉，使小牛血清在細(xì)胞培養(yǎng)基中的終濃度為20% (質(zhì)量百分含量)，使碳酸氫鈉在細(xì)胞培養(yǎng)基中的終濃度為
0.2% (質(zhì)量百分含量)；所述細(xì)胞培養(yǎng)基的pH為7.4。
[0081]3.羊抗鼠抗抗體的制備
[0082]以羊作為免疫動物，以鼠源抗體為免疫原對無病原體羊進(jìn)行免疫，得到羊抗鼠抗抗體。
[0083]4.萬古霉素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物的制備
[0084](I)膠體金的制備
[0085]用雙蒸去離子水將1%氯金酸稀釋成0.01% (質(zhì)量百分含量)，取100ml置于錐形瓶中，用恒溫電磁攪拌器加熱至沸騰，在持續(xù)高溫、持續(xù)攪拌下加入2.5ml 1%檸檬酸三鈉，繼續(xù)勻速攪拌加熱至溶液呈透亮的紅色時停止，冷卻至室溫后用去離子水恢復(fù)到原體積，4°C保存。制備好的膠體金外觀純凈、透亮、無沉淀和漂浮物。
[0086](2)萬古霉素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物的制備
[0087]在磁力攪拌下，用0.2mol/L碳酸鉀溶液調(diào)膠體金的pH至7.2，按每毫升膠體金溶液中加入50-?00μ g的標(biāo)準(zhǔn)向膠體金溶液中加入上述萬古霉素單克隆抗體，攪拌混勻，室溫靜置IOminJpA 10%牛血清白蛋白(BSA)，使其在膠體金溶液中的終濃度為1% (體積百分含量)，靜置lOmin。12000r/min，4°C離心40min，棄上清液，沉淀用復(fù)溶緩沖液洗滌兩次，用體積為初始膠體金體積1/10的復(fù)溶緩沖液將沉淀重懸，置4°C備用。[0088]復(fù)溶緩沖液:含牛血清白蛋白0.1%~0.3% (體積百分含量)、吐溫-80 0.059Π).2%(質(zhì)量百分含量)、ΡΗ7.2的0.02mol/L磷酸鹽緩沖液。[0089]5.將萬古霉素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物凍干到微孔試劑上[0090]向微孔試劑微孔板中加入100 μ I萬古霉素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物，放入冷凍干燥機(jī)中，在冷阱溫度為-50°C條件下，預(yù)凍3h后，再真空干燥15h，即可取出，得到凍干有萬古霉素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物的微孔試劑，密封保存。[0091]6.樣品吸收墊的制備[0092]將樣品吸收墊置于含0.5%牛血清白蛋白(體積百分含量)、pH7.2,0.lmol/L磷酸鹽緩沖液中浸泡2h，37°C烘2h備用。[0093]7.反應(yīng)膜的制備[0094]包被過程:用磷酸緩沖液將萬古霉素半抗原-卵清蛋白偶聯(lián)物稀釋到10mg/ml，用Isoflow點(diǎn)膜儀將其包被于硝酸纖維素膜上的檢測區(qū)(T)，包被量為1.0yg/cm2;用0.01mol/L、pH7.4的磷酸鹽緩沖液將羊抗鼠IgG抗體稀釋到200 μ g/ml，用Isoflow點(diǎn)膜儀將其包被于硝酸纖維素膜上的質(zhì)控區(qū)(C)，包被量為l.0yg/cm2。將包被好的反應(yīng)膜置于37°C條件下干燥2h，備用。[0095](二)各部件的組裝[0096]1.試紙的組裝[0097]將所述樣品吸收墊、反應(yīng)膜、吸水墊、保護(hù)膜依次按順序粘貼在所述底板上；樣品吸收墊的末端與反應(yīng)膜的始端相連，反應(yīng)膜的末端與吸水墊的始端相連，樣品吸收墊的始端與底板的始端對齊，吸水墊的末端與底板的末端對齊；在組裝好的試紙上粘貼保護(hù)膜，保護(hù)膜上印有MAX標(biāo)記線的一端粘貼在樣品吸收墊上。[0098]2.試紙條的組裝[0099]將上述步驟I得到的試紙與微孔試劑組裝成試紙條，在疒8°C的環(huán)境中貯存，有效期12個月。[0100]實(shí)施例3牛奶中萬古霉素的檢測[0101]1.用試紙條檢測[0102]從原包裝(若低溫存放需要預(yù)先平衡至室溫)中取出所需數(shù)目的微孔試劑和試紙，并做好標(biāo)記；吸取待檢牛奶溶液，用微量移液器移取200μ I于微孔中，緩慢抽吸且充分與微孔中試劑混勻；室溫(20-25°C)孵育5min后，將標(biāo)記好的試紙插入微孔中——印有“MAX”線端朝下，使之充分浸入溶液中；再次室溫(20-25°C)孵育5min，取出試紙，判定結(jié)果。[0103]3.檢測結(jié)果分析[0104]陽性:當(dāng)質(zhì)控區(qū)(C)顯示出紅色條帶，而檢測區(qū)(T)不顯色時，判為陽性，如圖4a所示；[0105]陰性:當(dāng)質(zhì)控區(qū)(C)顯示出紅色條帶，檢測區(qū)(T)同時也顯示出紅色條帶，判為陰性，如圖4b所示；[0106]無效:當(dāng)質(zhì)控區(qū)(C)不顯示出紅色條帶，則無論檢測區(qū)(T)顯示出紅色條帶與否，該試紙均判為無效，如圖4c、4d所示。[0107]實(shí)施例4試紙條技術(shù)參數(shù)的確定[0108]1.靈敏度試驗[0109]將萬古霉素標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成25、50、100μ g/L，所用稀釋液為pH7.2,0.2mol/L的磷酸鹽緩沖液。
[0110]用試紙條進(jìn)行檢測，結(jié)果為:萬古霉素標(biāo)準(zhǔn)品濃度為25 μ g/L時，試紙上顯示出肉眼可見的兩條紅色條帶，呈陰性；萬古霉素標(biāo)準(zhǔn)品濃度為50、100yg/L時，試紙質(zhì)控區(qū)顯色，但檢測區(qū)不顯色，呈陽性，表明本試紙條檢測萬古霉素的靈敏度為50 μ g/L。
[0111]2.假陽性率、假陰性率試驗
[0112]取已知萬古霉素含量大于50μ g/L的牛奶陽性樣本20份和濃度小于50μ g/L的牛奶陰性樣本20份，用3個批次生產(chǎn)的試紙條分別進(jìn)行檢測，計算其陰陽性率。結(jié)果見表
1、表 2。
[0113]表1檢測陽性樣本結(jié)果
【權(quán)利要求】
1.一種檢測萬古霉素的試紙條，其特征在于包括試紙和微孔試劑，所述試紙包括反應(yīng)膜、樣品吸收墊、吸水墊、保護(hù)膜、底板，所述反應(yīng)膜上有檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)，檢測區(qū)包被有萬古霉素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物，質(zhì)控區(qū)包被有羊抗鼠抗抗體，所述微孔試劑上凍干有萬古霉素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試紙條，其特征在于所述試紙由樣品吸收墊、反應(yīng)膜、吸水墊、保護(hù)膜依次黏貼在底板上組成，所述微孔試劑上具有微孔塞。
3.根據(jù)權(quán)利要求1-2任一項所述的試紙條，其特征在于所述樣品吸收墊上粘貼有保護(hù)膜，為檢測端，上面有MAX標(biāo)記線。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試紙條，其特征在于所述檢測區(qū)位于近于有MAX標(biāo)記的保護(hù)膜的一端，所述質(zhì)控區(qū)位于遠(yuǎn)離有MAX標(biāo)記的保護(hù)膜的一端。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試紙條，其特征在于所述萬古霉素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物由萬古霉素半抗原與載體蛋白偶聯(lián)得到，所述載體蛋白可為牛血清白蛋白、卵清蛋白、血藍(lán)蛋白、甲狀腺蛋白、人血清白蛋白。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或5任一項所述的試紙條，其特征在于所述萬古霉素半抗原是由萬古霉素與琥珀酸酐反應(yīng)得到，分子結(jié)構(gòu)式為:
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試紙條，其特征在于所述萬古霉素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物中的萬古霉素單克隆抗體是以萬古霉素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物作為免疫原制備獲得。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的萬古霉素單克隆抗體，其特征在于是由萬古霉素單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株E-l-3 CGMCC N0.6234分泌獲得。
9.一種制備權(quán)利要求1-7任一項所述試紙條的方法，其包括步驟: O制備凍干有萬古霉素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物的微孔試劑； 2)制備具有包被萬古霉素半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物的檢測區(qū)和包被羊抗鼠抗抗體的質(zhì)控區(qū)的反應(yīng)膜； 3)將2)制備好的反應(yīng)膜與樣品吸收墊、吸水墊、保護(hù)膜、底板組裝成試紙；4)將1)和3)制備好的凍干有萬古霉素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物的微孔試劑和試紙組裝成試紙條。
10.一種檢測牛奶樣本中萬古霉素殘留的方法，其包括步驟: 1)用權(quán)利要求1-7任一項所述的試紙條進(jìn)行檢測； 2)分析檢測結(jié)果。
【文檔編號】C12N5/20GK103575889SQ201210275185
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2012年8月3日 優(yōu)先權(quán)日:2012年8月3日
【發(fā)明者】何方洋, 萬宇平, 付軍權(quán), 楊秀賢, 邵小雪, 蒲小容, 李勇, 石麗麗 申請人:北京勤邦生物技術(shù)有限公司