專利名稱：一種高富硒鈍頂螺旋藻的培養(yǎng)及其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種應(yīng)用于保健食品、醫(yī)藥領(lǐng)域的高富硒鈍頂螺旋藻的培養(yǎng)及其方法。
背景技術(shù)：
螺旋藻是至今為止發(fā)現(xiàn)的營養(yǎng)最豐富、最全面的綠色食品，尤其蛋白質(zhì)含量較高，氨基酸平衡，還含有豐富的必需脂肪酸(如r 一亞麻酸等)，其中藻藍(lán)蛋白是螺旋藻含量最高的生物活性物質(zhì)之一，可達(dá)藻體質(zhì)量的20%左右，具有良好的抗氧化、抗腫瘤等作用。硒是人體必需的微量元素之一，其生理功能主要表現(xiàn)為硒蛋白和硒酶的抗氧化作用。我國通過人群補(bǔ)硒成功防治了多種疾病，如克山病、大骨節(jié)病、心血管病、肝病及腫瘤等。利用生物轉(zhuǎn)化途徑生產(chǎn)具有較高生物活性的有機(jī)硒可避免無機(jī)硒的毒性，并可協(xié)
同天然活性分子的功能。因此，利用生物體富集有機(jī)硒的研究受到廣泛關(guān)注。而螺旋藻(Spirulina)易于大規(guī)模培養(yǎng)，作為硒生物有機(jī)化的載體前景將十分廣闊。何曉燕報(bào)道當(dāng)亞硒酸鈉濃度小于100mg/L時(shí)，對藻體生長有一定的促進(jìn)作用，其生物量、藻藍(lán)蛋白和別藻藍(lán)蛋白含量有增加，藻體硒含量及富硒系數(shù)有所增高。黃峙等也研究了加硒方式對藻體富硒的影響，在溫度33 35°C，光照強(qiáng)度40001x，光照時(shí)間24h，分步加硒，而且當(dāng)亞硒酸鈉為300mg/L時(shí),得到總硒含量為O. 46mg/g的螺旋藻體。同時(shí)研究表明不同種類的螺旋藻在不同的培養(yǎng)條件下具有不同的富硒能力。而市場上有機(jī)硒的來源有限，目前已經(jīng)開發(fā)比較成熟的是富硒量較高的富硒酵母，陳福生等研究表明富硒酵母中中總硒含量為1.895mg/g，但酵母本身營養(yǎng)價(jià)值較低，而螺旋藻本身極具營養(yǎng)價(jià)值且對無機(jī)硒的耐受能力較強(qiáng)，而富硒大米，富硒茶有報(bào)道含硒量為20-30(^g/kg.同時(shí)市場上保健品如靈芝孢子分價(jià)格比較昂貴，因此迫切需要開發(fā)出低成本，高營養(yǎng)價(jià)值、高免疫力的高富硒的螺旋藻保健品。鑒于以上研究，本發(fā)明探索了易于操作、成本低廉并且富硒量及有機(jī)硒含量較高的富硒螺旋藻培養(yǎng)及其檢測方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是獲得高富硒的螺旋藻培養(yǎng)及其檢測方法，以便開發(fā)出營養(yǎng)價(jià)值高、免疫力強(qiáng)的聞有機(jī)砸的螺旋操保健品，進(jìn)一步提聞使用者的免疫力。為了實(shí)現(xiàn)上述目的本發(fā)明采用如下技術(shù)方案
一種高富硒鈍頂螺旋藻的培養(yǎng)方法，其特征在于在溫度20 25°C、pH 8 10、光照強(qiáng)度2000 2500 lx、每天24h光照中培養(yǎng)，采用Zarrouk培養(yǎng)液，放在三角培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，接種密度為OD56tl = O. 25 O. 35，分次添加Na2SeO3至總硒量達(dá)270_300mg/L，待OD56tl為I. 2
I.5時(shí)收集藻體，冷凍干燥，制得高富硒鈍頂螺旋藻。高富硒鈍頂螺旋藻的培養(yǎng)方法，包括以下步驟將鈍頂螺旋藻放在250ml的三角培養(yǎng)瓶中，采用Zarrouk培養(yǎng)液，在溫度20 25°C、pH 8 10、最佳光照強(qiáng)度2000_25001χ、每天24h光照中培養(yǎng)，接種密度為OD56tl = O. 25 O. 35，接種體積150ml，然后放在光照培養(yǎng)箱中，當(dāng)OD560為O. 7 O. 8時(shí)第一次加Na2SeO3 13. 5mg-15mg,當(dāng)藻液OD560為O. 8-0. 9時(shí)第二次添加 Na2SeO3 13. 5mg-15mg,當(dāng)藻液 OD56tl 為 O. 9-1. O 時(shí)第三次添加 Na2Se0313. 5mg-15mg繼續(xù)培養(yǎng)，待OD56tl為I. 2-1. 5時(shí)收集鈍頂螺旋藻，培養(yǎng)周期為ll-13d，用蒸餾水洗2_3次鈍頂螺旋藻，冷凍干燥后制得高富硒鈍頂螺旋藻。高富硒鈍頂螺旋藻的檢測方法，包括以下步驟用原子熒光光譜法檢測總硒及有機(jī)硒的含量；
(1)總硒測定
取O. 5g富硒螺旋藻，加9-llml消化液搖勻后，所述的消化液為濃硝酸高次氯酸=4:1配置得到，放置過夜，置于電熱板上加熱至有機(jī)物分解或色澤加深，補(bǔ)加I 3ml消化液繼續(xù)消化，控制溫度低于200°C，如此反復(fù)至消化液澄清，有HClO4白煙冒出，繼續(xù)加熱至溶液I 3ml，用60%濃HCL定容在25ml容量瓶中，然后加O. 5%NaBH4至反應(yīng)終點(diǎn)，用AFS-3100型雙道原子熒光光度計(jì)測量總硒含量；
(2)無機(jī)硒的測定
取O. 5g富硒螺旋藻,加IOml 20ml的蒸懼水,置于加熱板上加熱沸騰20min 30min,冷卻離心，保存上清液，殘?jiān)僦貜?fù)一次操作，合并上清液，上清液進(jìn)行和總硒測定同樣的方法消化測定，按4:1加消化液搖勻后，放置過夜，置于電熱板上加熱至有機(jī)物分解或色澤加深，補(bǔ)加l_2ml消化液繼續(xù)消化，控制溫度低于200°C，如此反復(fù)至消化液澄清，有HClO4白煙冒出，繼續(xù)加熱至溶液l_2ml，用60%濃HCL定容在25ml容量瓶中，然后加O. 5%NaBH4至反應(yīng)終點(diǎn)，用AFS-3100型雙道原子熒光光度計(jì)測量無機(jī)硒含量，然后總硒減去無機(jī)硒即是有機(jī)硒。(3)硒及氨基酸相對含量檢測方法
將O. 2g藻粉放在共振盤上，通過手握傳感器測定樣品的微磁場的頻率和能量，經(jīng)儀器放大，計(jì)算機(jī)處理后和設(shè)與儀器內(nèi)部的營養(yǎng)指標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)“量子共振譜”比較，輸出相應(yīng)的由負(fù)到正的相對量價(jià)值。本發(fā)明的有益效果
(O富硒螺旋藻中總硒及有機(jī)硒測定結(jié)果在本發(fā)明條件下培養(yǎng)鈍頂螺旋藻，添加亞硒酸鈉累計(jì)270mg 300mg/L，每次按技術(shù)路線測富硒螺旋藻的總硒和有機(jī)硒含量，重復(fù)3次，結(jié)果表明總硒含量2mg/g 2. 5mg/g,有機(jī)硒占總硒的比例為68% 80%。(2)硒、必需氨基酸、免疫功能相對含量比較結(jié)果量子共振法檢測結(jié)果顯示培養(yǎng)得到的富硒螺旋藻比普通螺旋藻及靈芝孢子粉硒含量顯著提高，且富硒培養(yǎng)后八種必需氨基酸的含量比著普通螺旋藻中的含量也明顯提高，同時(shí)相對靈芝孢子粉中必需氨基酸含量而言，富硒螺旋藻中這些氨基酸的含量顯著增高，而且富硒螺旋藻的免疫能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于普通螺旋藻和靈芝孢子粉的免疫能力。這表明富硒培養(yǎng)不僅能夠提高總硒及有機(jī)硒的含量，也可以使必需氨基酸、免疫能力得到提高。表I富硒螺旋藻中總硒及有機(jī)硒測定結(jié)果；表2 硒、必需氨基酸、免疫功能相對含量比較圖。表I:
權(quán)利要求
1.一種高富硒鈍頂螺旋藻的培養(yǎng)方法，其特征在于在溫度20 25°C、pH 8 10、光照強(qiáng)度2000 2500 lx、每天24h光照中培養(yǎng)，采用Zarrouk培養(yǎng)液，放在三角培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，接種密度為OD56tl = O. 25 O. 35，分次添加Na2SeO3至總硒量達(dá)270_300mg/L，待OD56tl為I.2 I. 5時(shí)收集藻體，冷凍干燥，制得高富硒鈍頂螺旋藻。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的高富硒鈍頂螺旋藻的培養(yǎng)方法，其特征在于包括以下步驟將鈍頂螺旋藻放在250ml的三角培養(yǎng)瓶中，采用Zarrouk培養(yǎng)液，在溫度20 25°C、pH 8 10、最佳光照強(qiáng)度2000-25001x、每天24h光照中培養(yǎng)，接種密度為OD56tl = O. 25 O.35，接種體積150ml，然后放在光照培養(yǎng)箱中，當(dāng)OD56tl為O. 7 O. 8時(shí)第一次加Na2SeO313.5mg-15mg,當(dāng)藻液 OD560 為 O. 8-0. 9 時(shí)第二次添加 Na2SeO3 13. 5mg_15mg,當(dāng)藻液 OD560 為O.9-1. O時(shí)第三次添加Na2Se0313. 5mg-15mg繼續(xù)培養(yǎng)，待OD56tl為I. 2-1. 5時(shí)收集鈍頂螺旋藻，培養(yǎng)周期為ll-13d，用蒸餾水洗2-3次鈍頂螺旋藻，冷凍干燥后制得高富硒鈍頂螺旋藻。
3.—種檢測權(quán)利要求書I或2所述的高富硒鈍頂螺旋藻的檢測方法，其特征在于包括以下步驟用原子熒光光譜法檢測總硒及有機(jī)硒的含量； (1)總硒測定 取O. 5g富硒螺旋藻，加9-llml消化液搖勻后，所述的消化液為濃硝酸高次氯酸=4:1配置得到，放置過夜，置于電熱板上加熱至有機(jī)物分解或色澤加深，補(bǔ)加I 3ml消化液繼續(xù)消化，控制溫度低于200°C，如此反復(fù)至消化液澄清，有HClO4白煙冒出，繼續(xù)加熱至溶液I 3ml，用60%濃HCL定容在25ml容量瓶中，然后加O. 5%NaBH4至反應(yīng)終點(diǎn)，用AFS-3100型雙道原子熒光光度計(jì)測量總硒含量； (2)無機(jī)硒的測定 取O. 5g富硒螺旋藻,加IOml 20ml的蒸懼水,置于加熱板上加熱沸騰20min 30min,冷卻離心，保存上清液，殘?jiān)僦貜?fù)一次操作，合并上清液，上清液進(jìn)行和總硒測定同樣的方法消化測定，按4:1加消化液搖勻后，放置過夜，置于電熱板上加熱至有機(jī)物分解或色澤加深，補(bǔ)加l_2ml消化液繼續(xù)消化，控制溫度低于200°C，如此反復(fù)至消化液澄清，有HClO4白煙冒出，繼續(xù)加熱至溶液l_2ml，用60%濃HCL定容在25ml容量瓶中，然后加O. 5%NaBH4至反應(yīng)終點(diǎn)，用AFS-3100型雙道原子熒光光度計(jì)測量無機(jī)硒含量，然后總硒減去無機(jī)硒即是有機(jī)硒； (3)硒及氨基酸相對含量檢測方法 將O. 2g藻粉放在共振盤上，通過手握傳感器測定樣品的微磁場的頻率和能量，經(jīng)儀器放大，計(jì)算機(jī)處理后和設(shè)與儀器內(nèi)部的營養(yǎng)指標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)“量子共振譜”比較，輸出相應(yīng)的由負(fù)到正的相對量價(jià)值。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種高富硒鈍頂螺旋藻的培養(yǎng)及其檢測方法，本發(fā)明在溫度20～25℃、pH8～10、光照強(qiáng)度2000～2500lx、每天24h光照中培養(yǎng)，采用Zarrouk培養(yǎng)液，放在三角培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，接種密度為OD560=0.25～0.35，分次添加Na2SeO3至總硒量達(dá)270-300mg/L，待OD560為1.2～1.5時(shí)收集藻體，冷凍干燥，制得高富硒鈍頂螺旋藻。本發(fā)明方法培養(yǎng)條件易于控制，而且螺旋藻繁殖快，生長周期短，成本低，總硒含量可達(dá)2.0mg-2.5mg/g，有機(jī)硒含量達(dá)68-80%，且必須氨基酸含量及免疫力均有較大提高。
文檔編號C12R1/89GK102876579SQ201210275399
公開日2013年1月16日 申請日期2012年8月3日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月3日
發(fā)明者黃蓓, 王鑫焱, 沈敬連, 武子涵, 劉亞華 申請人:安徽大學(xué), 亳州市貢藥飲片廠