專(zhuān)利名稱(chēng)：快速檢測(cè)牙齦卟啉單胞菌致病島基因型的多重pcr方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種常見(jiàn)的口腔病原菌牙齦卟啉單胞菌致病島Rag基因4種基因型檢測(cè)的多重PCR方法。
背景技術(shù)：
牙銀卟啉單胞菌(P. gingivalis, Pg)是革蘭氏陰性專(zhuān)性厭氧菌,能分泌大量毒力因子導(dǎo)致牙周組織破壞，與慢性牙周炎、侵襲性牙周炎、牙周膿腫和牙髓感染以及伴發(fā)性全身性系統(tǒng)疾病密切相關(guān)。自1999年Curtis等發(fā)現(xiàn)Pg致病島(pathogenicity islands)以來(lái)，人們對(duì)Pg的致病性有了進(jìn)一步的認(rèn)識(shí)，致病島存在于強(qiáng)毒株中，一般弱毒株或無(wú)毒株中缺失。目前，rag基因座被確定是P. gingivalis的致病島。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，rag位點(diǎn)的失活會(huì)降低牙齦卟啉菌的致病性，減少其對(duì)牙周組織的破壞，rag位點(diǎn)在臨床菌株中有4種不同的基因型，分別命名為rag-1、rag-2、rag-3和rag-4,不同基因型的致病能力亦不同,rag-1 型Pg對(duì)牙周軟組織的破壞性最強(qiáng)，為高毒力基因型；為盡快確定臨床菌株中Pg的致病島基因型，有必要建立快速、敏感的檢測(cè)方法同時(shí)檢測(cè)臨床標(biāo)本中的rag基因型，以確定其對(duì)牙周組織的破壞能力，研究牙周病的發(fā)病機(jī)制、監(jiān)測(cè)牙周病的病情變化、確定治療方案。目前已有文獻(xiàn)報(bào)道用PCR技術(shù)分別檢測(cè)牙齦卟啉單胞菌及致病島基因的研究報(bào)道，但每個(gè)反應(yīng)只檢測(cè)一種rag基因型，不能滿(mǎn)足臨床需要，而建立同時(shí)擴(kuò)增四種rag基因型的多重PCR通過(guò)一次反應(yīng)就可以鑒別出Pg的四種基因型的致病島基因。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)上述技術(shù)問(wèn)題，提供一種多重PCR技術(shù)同時(shí)檢測(cè)牙齦卟啉單胞菌四種rag基因型，僅通過(guò)一次PCR擴(kuò)增就可鑒別出四種不同rag基因型，提高檢測(cè)效率降低檢測(cè)成本。多重PCR技術(shù)包括設(shè)計(jì)擴(kuò)增Pg的4種rag基因型的特異引物，如下
mm賴(lài)(51 -3·)產(chǎn)窗長(zhǎng).度(bp；
rag-1 _I628-
5; 餘TCACAT組GAACGCT
I5’ hXTTTOTGCTTGTGACTTGC^
r-ag-2 I_____—__I9T9
I f/ 偵GXTCA似ITTCACCTT-f
..........................................................................弋,.....................................................................................................................................................
rag-3 I-................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................423
I 5' -*GCCMTT0GCCAAADT~3J
rag *-"4 I........................................................................................:.............................................:—:—:..................................................................................................................................................................................! 39
I 5!儒GGTAMCCTCAOCAMTTIi
牙齦卟啉單胞菌的4種rag基因型特異基因的多重PCR快速檢測(cè)方法，包括如下步驟I)擴(kuò)增所用的DNA模板是用加熱裂解法提取將標(biāo)本離心，棄上清，于沉淀中加入裂解緩沖液，100°C水浴10 min，再離心，取上清作為模板，于-20°C保存；
所述裂解緩沖液為1.0mmol/L EDTA, 1.0% Triton X-100, 10mmol/LTris-HCl,pH8. 0。2)將未經(jīng)稀釋的4對(duì)引物的原始液混合后按I對(duì)引物稀釋的量進(jìn)行稀釋?zhuān)♂尯蟮墓璉物作為應(yīng)用液，計(jì)作Pm，將4種rag基因型的引物混合稀釋后的弓I物計(jì)作pn ；
3)電泳檢測(cè)鑒定。前面所述的多重PCR快速檢測(cè)方法，優(yōu)選的方案在于，步驟I)將標(biāo)本離心時(shí)控制參數(shù)為12 000 r/min, 2 min,最大離心半徑為6 cm。

前面所述的多重PCR快速檢測(cè)方法，優(yōu)選的方案在于，步驟2)反應(yīng)體系
10XTransStart Taq Buffer2.5ul,
引物混合物(pn)2. Oul,
TransStart Taq DNA Polymerase O.5ul,dNTPsO.5ul,
模板 DNA5. Oul,
無(wú)菌雙蒸水14. 5ul,
總體積為25μ1
前面所述的多重PCR快速檢測(cè)方法，優(yōu)選的方案在于，步驟2) PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)為94 0C 5min ；94°C 30sec,55°C 30sec,72°C 30sec，33 個(gè)循環(huán)；最后 72 °C 延伸 lOmin，取10μ1多重PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)特異基因。所述多重PCR擴(kuò)增口腔中的牙齦卟啉單胞菌不同rag基因型的特異基因，包括如下步驟
擴(kuò)增所用的DNA模板是用加熱裂解法提取，具體步驟如下
將收集的標(biāo)本離心(12 000 r/min, 2 min,最大離心半徑為6 cm),棄上清,于沉淀中加入裂解緩沖液，100°C水浴10 min，再離心(12 000 r/min，2min)，取上清作為模板，于_20°C保存?zhèn)溆?。以上操作方法和?shí)驗(yàn)試劑如無(wú)特別說(shuō)明，均為本領(lǐng)域常規(guī)操作和市售試劑。


圖I為通過(guò)本發(fā)明的檢測(cè)技術(shù)得到的檢測(cè)結(jié)果 其中，I) Marker 標(biāo)記；2) rag-1 型；3) rag-1 型；4) rag-2 型；5) rag-1 型 +rag-4型；6) rag-3 型；7) rag-4 型。
具體實(shí)施例方式以下通過(guò)實(shí)例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的描述。實(shí)施例
本發(fā)明涉及快速檢測(cè)牙齦卟啉單胞菌4種rag基因型的多重PCR，該方法利用多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)同步檢測(cè)牙銀P卜啉單胞菌的4種rag基因型,步驟如下
(I)牙周袋及齦溝標(biāo)本的采集采用無(wú)菌紙尖法從患者牙周袋或齦溝內(nèi)分別采集標(biāo)本，具體采集方法如下常規(guī)清水漱口后，生理鹽水沖洗去除食物殘?jiān)?，棉球隔濕，吹干，將無(wú)菌紙尖插入牙周袋內(nèi)或齦溝內(nèi)，當(dāng)有阻力時(shí)停止插入，停留30s后取出，放入Iml PBS的EP管內(nèi)，_20°C保存待測(cè)。(2)模板DNA的制備將標(biāo)本離心(12 000 r/min, 2 min,最大離心半徑為6 cm),棄上清，于沉淀中加入裂解緩沖液，100°c水浴10 min，再離心(12 000 r/min，2min)，取上清作為模板，于_20°C保存。(3)多重 PCR 反應(yīng)
吸取14. 5μ1無(wú)菌去離子水加至微離心管中，再加入IOXTransStart Taq Buffer2. 5M-1, dNTPs O. 5M-1, TransStart Taq DNA Polymerase O. 5 μ1,引物混合液2· Ομ ,模板DNA
5.Ομ ，低速離心機(jī)離心混勻，放入PCR儀中，按照如下參數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)94°C 5min ；94°C 30sec,55°C 30sec,72°C 30sec，33 個(gè)循環(huán)；72°C延伸 IOmin ；
所用引物如下
序列(5S -3-,)I 嚴(yán)物長(zhǎng)麼(bp)
rag—.1 __628
:5'僅OXTCACATAMCMCGCT-3,
rag-2 _—__979
5' -<tAOXTCACrCTTCAOTT
'...................................................................................................I..................................................................................................................................
rag-3 __423
_III—Li_
5，^XCGATC^AGTGATGMCAGA-cf
rag-4 _=__7395s nXCGCTAMCCTCAGCMATT'y
將未經(jīng)稀釋的4對(duì)引物的原始液混合后按I對(duì)引物稀釋的量進(jìn)行稀釋?zhuān)♂尯蟮囊镒鳛閼?yīng)用液，計(jì)作Pm，將4種rag基因型的引物混合稀釋后的引物計(jì)作pn。(4) PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)
以TAE緩沖液配制2%瓊脂糖凝膠溶液，加熱溶解，待冷卻至60°C左右時(shí)，加入溴化乙錠，使其終濃度為lKg/ml，充分混勻，倒入膠膜中，放好梳子，待膠凝固后，移去梳子，將凝膠放入電泳槽中，加入TAE緩沖液，使液面高出凝膠表面l_2mm ;再將PCR后的樣品與上樣緩沖液混合，用微量移液器將樣品依次加入加樣孔內(nèi)，蓋上電泳槽并通電，90V恒壓電泳，使DNA向陽(yáng)極方向移動(dòng)，電泳約30min后，切斷電源，取出凝膠，在紫外光下觀察，圖譜分析根據(jù)有無(wú)牙齦卟啉單胞菌及其4種rag基因型的多重PCR產(chǎn)物預(yù)期擴(kuò)增片段來(lái)判斷是否含有上述基因型。牙齦卟啉單胞菌4種rag基因型的多重PCR產(chǎn)物預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)度分別為628bp、979bp、423bp 和 739bp。圖I為通過(guò)本發(fā)明的檢測(cè)技術(shù)得到的檢測(cè)結(jié)果圖，由此圖可以看出，從Lane2到Lane7分別為6份臨床標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果，其中，Lane2和3，擴(kuò)增條帶大小為628bp，都為rag-1 型；Lane4,為 rag-2, DNA 大小為 979bp ；Lane5,為 rag-1 與 rag-4 混合型，包括 628bp和739bp兩條大小不等的條帶；Lane6,為rag-3型,DNA大小為423bp ;Lane7,為rag-4型，DNA大小為739bp 。
權(quán)利要求
1.快速檢測(cè)牙齦n卜啉單胞菌致病島基因型的多重PCR方法，其特征在于，采用多重PCR同時(shí)檢測(cè)牙銀fl卜啉單胞菌的四種致病島基因型rag-l, rag-2, rag-3和rag-4。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的多重PCR方法，其特征在于，按如下步驟 1)用加熱裂解法提取擴(kuò)增所用的DNA模板將標(biāo)本離心，棄上清，于沉淀中加入裂解緩沖液，100°C水浴10 min，再離心，取上清作為模板，于-20°C保存； 2)所用引物如下:■_丨._ (.y O_'mm aP.)_ I S'-CGCQAeCCCGAAGGAAAMJHy rag-1I- 628i D^cAcacxrfrACmAAGAACGCT-J' ,I S^CTn-GCOSCTrGTGAOTGG- '， 38! 5^CCACCGTCA€CGTTCAD7TP3J _ I Si-CcggaacmiaaggccamSaaaga-J' fag ”3.I423j y-ACGCCA^TCaCCAAA^C^ 1 I 5、⑦m稱(chēng)3MG1WGAACAGAJ rag-4I- 139 j S^CGCGCTAAACCT^G^Air^]4 將未經(jīng)稀釋的4對(duì)引物的原始液混合后按I對(duì)引物稀釋的量進(jìn)行稀釋?zhuān)♂尯蟮囊镒鳛閼?yīng)用液，計(jì)作Pm，將4種rag基因型的引物混合稀釋后的引物計(jì)作pn ； 3)電泳檢測(cè)鑒定。
3.如權(quán)利要求2所述的的多重PCR方法，其特征在于，擴(kuò)增所用的DNA模板是用加熱裂解法提取，具體步驟如下將收集的標(biāo)本離心(12 000 r/min，2 min，最大離心半徑為6cm)，棄上清，于沉淀中加入裂解緩沖液，100°C水浴10 min，再離心(12 000 r/min,2min),取上清作為模板，于-20°C保存?zhèn)溆谩?br> 4.如權(quán)利要求2所述的多重PCR方法，其特征在于，按如下反應(yīng)體系 IOXTransStart Taq Buffer2. 51^1, 引物混合液pn2. Ort,TransStart Taq DNA Polymerase 0. 5M-1,dNTPs0. 5m, 模板 DNA5. 0m, 無(wú)菌雙蒸水14. 5W ；總體積為25耵。
5.如權(quán)利要求2所述的多重PCR方法，其特征在于，按以下反應(yīng)參數(shù)94°C5min ；94°C30sec、55°C 30sec、72°C 30sec，33 個(gè)循環(huán)；最后 72°C延伸 lOmin，取 IOW 多重 PCR 反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種口腔常見(jiàn)病原菌牙齦卟啉單胞菌的4種rag基因型的多重PCR快速檢測(cè)方法，屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。利用多重PCR擴(kuò)增口腔中牙齦卟啉單胞菌的4種rag基因型的特異基因，并利用電泳檢測(cè)特異基因。本發(fā)明通過(guò)牙齦卟啉單胞菌的4種rag基因型的引物設(shè)計(jì)，使得多重PCR快速檢測(cè)中反應(yīng)條件一致，方法敏感、特異性強(qiáng)，能同時(shí)對(duì)臨床標(biāo)本中的四種rag基因型進(jìn)行檢測(cè)鑒定，準(zhǔn)確的判斷出不同Rag基因型的分布，大大提高了檢測(cè)的速度和效率。
文檔編號(hào)C12Q1/02GK102758020SQ20121027590
公開(kāi)日2012年10月31日 申請(qǐng)日期2012年8月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月6日
發(fā)明者劉毅, 張玉杰, 王兆強(qiáng), 肖水清 申請(qǐng)人:肖水清