專利名稱：利用小干擾rna抑制病毒基因表達(dá)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用小干擾RNA( shRNA和siRNA)抑制病毒基因表達(dá)，例如丙型肝炎IRES介導(dǎo)的基因表達(dá)。
背景技術(shù)：
丙型肝炎病毒(HCV)感染的治療和預(yù)防仍然是控制這個(gè)世界范圍內(nèi)健康問題的主要挑戰(zhàn)；現(xiàn)有的治療僅部分有效并且目前還沒有疫苗。丙型肝炎(HCV)病毒在世界范圍內(nèi)感染了超過I億7千萬人，并且是造成肝移植的主要原因。包括三氮唑核苷和聚乙二醇化干擾素α的現(xiàn)有治療僅在大約50%的患者中有效，并且伴有大量副作用。缺乏優(yōu)良的小動(dòng)物模型、不能在組織培養(yǎng)細(xì)胞中穩(wěn)定培養(yǎng)病毒和高病毒突變率制約著更有效的HCV治療的開發(fā)[1_3]。HCV復(fù)制子系統(tǒng)的可獲得性使得對(duì)HCV復(fù)制、宿主-細(xì)胞相互作用和抗病毒劑評(píng)估的研究成為可能，并且更近來開發(fā)了轉(zhuǎn)基因的嵌合人源化小鼠肝模型，其使得能進(jìn)行完全HCV感染[4 — 7]。另外，通過利用HCV IRES依賴性報(bào)道基因系統(tǒng)的體內(nèi)成像，已經(jīng)在小鼠中促進(jìn)了在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)上對(duì)小鼠肝中抗HCV試劑的運(yùn)送和抑制作用的有效評(píng)估[8]。RNA干擾是導(dǎo)致基因表達(dá)下調(diào)的進(jìn)化上保守的途徑。合成的大約19 一 29個(gè)堿基對(duì)的短干擾RNA (siRNA)能有效地抑制哺乳動(dòng)物細(xì)胞和動(dòng)物中的基因表達(dá)而不激發(fā)免疫反應(yīng)，這個(gè)發(fā)現(xiàn)引起將這些抑制劑開發(fā)成治療劑的熱潮[9]。siRNA的化學(xué)穩(wěn)定化導(dǎo)致血清半衰期增加[1°]，說明如果能克服運(yùn)送問題的話，靜脈內(nèi)施用可能會(huì)獲得積極的治療效果。此夕卜，小發(fā)夾RNA (shRNA)也顯示對(duì)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的靶基因的強(qiáng)抑制作用，并且能易于由噬菌體(例如Τ7、Τ3或SP6)或哺乳動(dòng)物(ροI III例如U6或Hl或polll)啟動(dòng)子表達(dá)，這使得它們成為用于病毒運(yùn)送的極好的候選者[11]。因?yàn)楝F(xiàn)有治療不完全有效(在[4，12]中綜述)，所以已經(jīng)嘗試發(fā)現(xiàn)抗HCV的有效的基于核酸的抑制劑。這些努力包括傳統(tǒng)的反義寡核苷酸、磷酰二胺嗎啉寡聚物(phosphorodiamidate morpholino oligomer)[8]、核酶及較近的 siRNA。已經(jīng)表明 siRNA 能有效地靶向人組織培養(yǎng)細(xì)胞[13_19]和動(dòng)物系統(tǒng)[2°]中的HCV。發(fā)明概述
本發(fā)明提供用于抑制病毒(例如丙型肝炎病毒(HCV))中IRES介導(dǎo)的基因表達(dá)的方法、組合物和試劑盒。就在圖4A和10以及表I中所列的抑制性RNA序列(例如SEQ IDNO 19 — 26)而言，如本領(lǐng)域技術(shù)人員將明了的，暗含著互補(bǔ)的序列以及可能附加在每條鏈的一個(gè)或兩個(gè)末端(如3’末端)的與靶無關(guān)的序列?？梢詫⑷鐖D4A、

圖10和表I中所示的抑制性(反義識(shí)別)序列整合入shRNA或siRNA中。就shRNA而言，所示的序列另外通過環(huán)與其互補(bǔ)序列相連，所述環(huán)包括通常與靶無關(guān)的核苷酸殘基。這樣的環(huán)的實(shí)例見于圖IB和圖IC以及圖16A-B中所示的shRNA序列。就siRNA和shRNA兩者而言，與靶序列互補(bǔ)的鏈通常是完全互補(bǔ)的，但在某些具體實(shí)施方案中，與靶互補(bǔ)的鏈可以包含錯(cuò)配(參見，例如，SEQ ID NO:
13、14和15)。可以通過如下方式改變序列來靶向目的病毒的一種或多種遺傳變體或表型，所述方式是改變靶向序列使之與所述遺傳變體或表型的序列相互補(bǔ)。與靶序列同源的鏈可通過具有從大約I到大約5個(gè)核苷酸的錯(cuò)配、插入或缺失在大約O到大約5個(gè)位點(diǎn)上不同，這與例如天然存在的小RNA是一樣的。在某些具體實(shí)施方案中，序列可靶向多種病毒株，例如HCV的病毒株,但序列在祀向序列的至少一個(gè)核苷酸(例如一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)核苷酸)上 不同于病毒株的靶序列。一方面，本發(fā)明提供了包含至少一種小干擾RNA的組合物，所述的小干擾RNA與病毒的多核苷酸序列至少部分互補(bǔ)并能與之相互作用，以致于由小干擾RNA與病毒靶序列的相互作用引起病毒基因表達(dá)的抑制。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，組合物包含至少一種shRNA，其中所述shRNA例如包含以下序列、由以下序列組成或基本上由以下序列組成，所述序列選自由 SEQ ID NO :12、SEQ ID NO :16、SEQ ID NO 17 和 SEQ ID NO 18 組成的組；或所述shRNA包含以下序列或基本上由以下序列組成，所述序列選自由SEQ ID NO : 27、SEQ ID NO:32和SEQ ID N0:33組成的組。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，shRNA包含如SEQ ID N0:12所述的序列，由如SEQ ID NO: 12所述的序列組成或基本上由如SEQ ID NO :12所述的序列組成。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，組合物包含至少一種siRNA。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，組合物包含至少一種siRNA或shRNA，其中所述siRNA或shRNA例如包含以下序列或基本上由以下序列組成，所述序列選自由 SEQ ID NO 19, SEQ ID NO :20、SEQ ID NO 2U SEQ ID NO :22、SEQ ID NO 23,SEQ ID NO 23,SEQ ID NO 24,SEQ ID NO 25,SEQ ID NO27,SEQ ID NO:32和SEQ ID N0:33組成的組。在某些具體實(shí)施方案中，小干擾RNA，例如shRNA或siRNA與大約19到大約30個(gè)核苷酸或大約19到大約25個(gè)核苷酸，例如大約19、20、21、22、23、
24、25、26、27、28、29或30個(gè)核苷酸的病毒序列相互作用。在某些具體實(shí)施方案中，小干擾RNA與丙型肝炎病毒序列結(jié)合。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，小干擾RNA與丙型肝炎病毒的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRJES)序列內(nèi)的序列結(jié)合，例如與如SEQ ID NO 26 (SEQ ID NO 11的殘基344-374)所述的序列結(jié)合。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，丙型肝炎病毒是HCV基因型la。在某些具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物包括藥學(xué)上可接受的賦形劑，例如水或鹽水，并任選地以治療上的有效量提供，例如用于治療人或非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物如黑猩猩或新大陸猴中的HCV感染。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，組合物是包含至少一種本文所述的shRNA或siRNA和藥學(xué)上可接受的賦形劑的藥物組合物、或是由以上兩者組成或基本上由以上兩者組成的藥物組合物。另一方面，本發(fā)明涉及試劑盒，其包含如上所述的任何組合物，并且任擇地還包含有關(guān)在如本文所述的抑制病毒的基因表達(dá)或治療個(gè)體的病毒感染的方法中使用的說明書。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，試劑盒在用于治療個(gè)體如人的HCV感染的方法中使用，并且包含shRNA，所述shRNA包含以下序列、由以下序列組成或基本上由以下序列組成，所述序列選自由 SEQ ID NO :12、SEQ ID NO :16、SEQ ID NO 17 和 SEQ ID NO 18 組成的組；或所述shRNA包含以下序列或基本上由以下序列組成，所述序列選自由SEQ ID NO : 27、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO 33組成的組；或所述試劑盒包含siRNA，所述siRNA包含以下序列或基本上由以下序列組成，所述序列選自由SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO 20, SEQ ID NO :21、SEQ IDNO 22, SEQ ID NO :23、SEQ ID NO :23、SEQ ID NO :24、SEQ ID NO :25、SEQ ID NO :27、SEQID NO:32和SEQ ID NO :33組成的組，并且所述試劑盒任選地還包含有關(guān)在 抑制丙型肝炎病毒(如HCV基因型Ia)的基因表達(dá)的方法中使用的說明書，或有關(guān)在個(gè)體如人或非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物如黑猩猩中治療丙型肝炎(如HCV基因型Ia)病毒感染的方法中使用的說明書。另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于治療個(gè)體如哺乳動(dòng)物，例如人或非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物中病毒感染的方法。該方法包括給予個(gè)體治療上有效量的小干擾RNA，如shRNA或siRNA(所述小干擾RNA與病毒的多核苷酸序列至少部分地互補(bǔ)并能夠與之結(jié)合)，以及藥學(xué)上可接受的賦形劑，以便小干擾RNA與病毒多核苷酸序列的結(jié)合抑制病毒中基因的表達(dá)，如減少個(gè)體中病毒表達(dá)的量或減少在未接受小干擾RNA的個(gè)體中預(yù)期的病毒表達(dá)量。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，病毒感染包含丙型肝炎病毒，如HCV基因型la。在某些具體實(shí)施方案中，病毒選自由丙型肝炎病毒基因型la、lb、2a和2b組成的組。在某些具體實(shí)施方案中，小干擾RNA包含以下序列、由以下序列組成或基本上由以下序列組成，所述序列是本文所述的任何shRNA或siRNA序列以及位于本文所述的shRNA或siRNA序列之一的五個(gè)核苷酸內(nèi)的序列。在某些具體實(shí)施方案中，小干擾RNA互補(bǔ)于大約19到大約30個(gè)核苷酸、或大約19到大約25個(gè)核苷酸，例如大約19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個(gè)核苷酸的病毒序列。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，病毒是丙型肝炎病毒，如HCV基因型la。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，小干擾RNA結(jié)合于如SEQ ID NO: 26所述的HCV Ia的IRES區(qū)內(nèi)的大約19到大約25個(gè)核苷酸的序列。治療可包含治療(如改善或減少感染的至少一種癥狀)或治愈。在某些具體實(shí)施方案中，將shRNA腸胃外施用，如通過靜脈注射或輸液。另一方面，本發(fā)明提供了抑制病毒中基因表達(dá)的方法，包括將病毒RNA或病毒mRNA與小干擾RNA接觸，或?qū)⑿「蓴_RNA引入包含病毒的細(xì)胞中，其中所述小干擾RNA，如shRNA或siRNA包含與病毒的多核苷酸序列至少部分互補(bǔ)并能夠如通過誘導(dǎo)病毒多核苷酸序列的斷裂來抑制病毒基因表達(dá)的序列。在某些具體實(shí)施方案中，小干擾RNA包含任一本文所述的shRNA或siRNA序列、由該序列組成或基本上由該序列組成。在某些具體實(shí)施方案中，小干擾RNA結(jié)合于大約19到大約30個(gè)核苷酸、或大約19到大約25個(gè)核苷酸，例如大約19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個(gè)核苷酸的病毒序列。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，病毒是丙型肝炎病毒，如HCV基因型la。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，小干擾RNA與如SEQID NO 26所述的HCV基因型Ia的IRES區(qū)內(nèi)的大約19到大約30個(gè)核苷酸的序列以及位于本文所述的siRNA或shRNA序列之一的五個(gè)核苷酸內(nèi)的序列相互作用。在其它的具體實(shí)施方案中，將至少兩種小干擾RNA導(dǎo)入細(xì)胞。本發(fā)明還涉及由以下組分組成的RNA序列(a)第一 RNA序列，其中所述第一 RNA序列是如圖10或圖16A-B所示的序列，例如SEQ IDNO:34, SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37,SEQ ID NO:38,SEQ ID NO:39,SEQ ID NO:40,SEQ ID N0:4USEQ ID NO:42、SEQ IDNO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49,SEQ ID NO:50,SEQ ID NO:51,SEQ IDNO:52、SEQ ID NO:53,SEQ ID NO:54,SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56或與前述序列有一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)核苷酸不同的序列；(b)第二 RNA序列，其與第一序列互補(bǔ)；(c)位于第一和第二核酸序列之間的環(huán)序列，環(huán)序列由4-10個(gè)核苷酸組成；以及(d)任選地，兩個(gè)核苷酸的突出端。在某些具體實(shí)施方案中，第一RNA序列是SEQ ID NO:34,SEQ ID NO:35,SEQ ID NO:36,SEQ ID NO:37,SEQ ID NO:38,SEQID NO:39,SEQ IDNO:40,SEQ ID NO:41,SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:43,SEQ ID NO:44,SEQID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ IDNO:49, SEQ ID NO:50、SEQID NO:51, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54, SEQ ID N0:55 或 SEQ ID N0:56。在某些情況下，所述RNA序列可包括至少一個(gè)修飾的核苷酸。本發(fā)明的RNA序列的環(huán)序列可為如四個(gè)核苷酸、五個(gè)核苷酸、六個(gè)核苷酸、七個(gè)核苷酸、八個(gè)核苷酸、九個(gè)核苷酸、十個(gè)核苷酸或至少十個(gè)核苷酸。在一些具體實(shí)施方案中，RNA序列為shRNA,并包括通過包含至少一個(gè)非核苷酸分子的環(huán)連接在一起的本文所述的HCV靶序列和互補(bǔ)序列。在某些具體實(shí)施方案中，RNA序列的環(huán)為3’端是shRNA的有義鏈而5’端是其互補(bǔ)反義鏈。在其它具體實(shí)施方案中，RNA序列的環(huán)為3’端是shRNA的反義鏈而5’端是其互補(bǔ)有義鏈。在有些情 況下，RNA序列包括兩個(gè)核苷酸的突出端，并且這兩個(gè)核苷酸的突出端為3’UU。在有些情況下，突出端為一個(gè)核苷酸、兩個(gè)核苷酸、三個(gè)核苷酸或更多。在有些情況下，第一 RNA序列為SEQ ID NO :57-79, SEQID NO :12、SEQ ID NO :16、SEQ ID NO :17、或 SEQ ID NO 18 中的任何一個(gè)。在有些情況下，RNA序列為圖16A-B中所列舉的序列。本發(fā)明還涉及包括編碼如本文公開的RNA序列(例如，圖10或圖16A-B列舉的RNA序列)的序列的DNA序列。本發(fā)明還包括含有這種DNA序列的表達(dá)載體。還包括含有這種DNA序列的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，如通過用載體感染細(xì)胞后可生產(chǎn)能表達(dá)本發(fā)明的RNA序列的原病毒的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，所述RNA序列為例如，但不限于，圖16A-B中所列舉的shRNA序列。在某些方面，本發(fā)明涉及包括如本文公開的RNA序列(例如，非限制性的，圖16A-B列舉的shRNA)和藥學(xué)上可接受的賦形劑的組合物。在一些具體實(shí)施方案中，組合物包含如本文公開的載體和藥學(xué)上可接受的賦形劑。在某些具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物包括至少兩種如本文公開的RNA序列。另一方面，本發(fā)明包括抑制丙型肝炎病毒表達(dá)或活性的方法。該方法包括提供能表達(dá)丙型肝炎病毒的細(xì)胞，并將該細(xì)胞與如本文公開的RNA序列(其非限制性實(shí)施例為如圖16A-B所示的序列)相接觸。該細(xì)胞可是哺乳動(dòng)物，例如人類或非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物，如黑猩猩的。在某些具體實(shí)施方案中，該細(xì)胞與至少兩種不同的RNA序列相接觸。在某些方面，本發(fā)明涉及如下方法，該方法包括鑒定感染或疑似感染丙型肝炎病毒的對(duì)象，向?qū)ο筇峁┲委熒嫌行Я康陌环N或多種不同的本文公開的RNA序列的組合物。在一些具體實(shí)施方案中，該方法也包括在向?qū)ο筇峁┙M合物之后測(cè)定對(duì)象的病毒載量是否降低。在一些具體實(shí)施方案中，該方法也包括在向?qū)ο筇峁┙M合物之后測(cè)定對(duì)象中至少一種病毒蛋白或病毒核酸序列是否降低。除非特別規(guī)定，本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語均與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的含義相同。雖然與本文所述相似或等效的方法和材料可被用于本發(fā)明的實(shí)踐或測(cè)試，但是適宜的方法和材料如下所述。本文提到的所有出版物、專利申請(qǐng)、專利及其他參考文獻(xiàn)以其整體引入作為參考。另外，材料、方法和實(shí)施例僅起解釋說明作用，并沒有限定作用。本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)由詳細(xì)的說明書、附圖和權(quán)利要求書中是顯而易見的。附圖描述
圖IA為丙型肝炎基因型Ia的IRES核苷酸序列的表示(參見GenBank登錄號(hào)AJ242654)。用下劃線標(biāo)出靶區(qū)344-374位的核苷酸。用抑制劑已成功靶向多個(gè)區(qū)域(粗體字所示)，所述抑制劑包括H印tazyme 核酶(siRNA. com ;189_207位)、Chiron 5U5 siRNA[25](286-304位)、ISIS14803硫代磷酸酯反義寡核苷酸 M(330-349 位)、Mizusawa 331siRNA[15](322-340位)和磷酰二胺嗎啉寡聚物[8’35] (344-363位)。可在[2，3]找到已經(jīng)測(cè)定到可以下調(diào)HCV IRES及其它HCV元件的siRNA的更完整列表。圖IB顯示從相應(yīng)DNA模板的U6啟動(dòng)子經(jīng)poI III轉(zhuǎn)錄得到的shRNAHCVa-wt(shRNAl)及其突變體的RNA序列。改變HCVa-wt的兩個(gè)堿基對(duì)(下劃線)，以創(chuàng)建包含如所示的 I 個(gè)(HCVSNP1 或 HCVSNP2)或 2 個(gè)錯(cuò)配(HCVa_mut)的 shRNA HCVa-wt 形式。圖IC 顯不 shRNA HCVb-wt (sh9)> HCVc-wt (shlO)和 HCVd-wt (shll)的序列。圖ID 顯示 HCV IRES 二級(jí)結(jié)構(gòu)，其中指出 shRNA HCVa_wt、HCVb_wt、HCVc-wt 和HCVd-wt的靶位點(diǎn)。圖IE是用于制備HCV IRES靶序列及EMCV IRES對(duì)照的pCDNA3/HCV IRES雙螢光素酶報(bào)道基因構(gòu)建體的示意圖，在EMCVIRES中來自腦心肌炎病毒的IRES取代HCV IRES并因此缺乏定向于HCV的shRNA的任何靶序列。在每種情況下，螢火蟲螢光素酶的表達(dá)取決于自IRES序列的轉(zhuǎn)錄起始，而海腎螢光素酶以帽-依賴性方式表達(dá)。圖IF是描述篩選在293FT細(xì)胞中能抑制HCV IRES介導(dǎo)的基因表達(dá)的shRNA的結(jié)果的條形圖。將293FT細(xì)胞以P⑶NA3/HCV IRES雙螢光素酶報(bào)道基因構(gòu)建體、pSEAP2(作為轉(zhuǎn)染和特異性的對(duì)照)和shRNA (InM)在24孔組織培養(yǎng)板的孔中進(jìn)行共轉(zhuǎn)染。加入pUC18質(zhì)粒使每孔中達(dá)到總共800ng核酸。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，裂解細(xì)胞并用光度計(jì)測(cè)定螢火蟲螢光素酶的活性。所有數(shù)據(jù)均為相對(duì)于SEAP進(jìn)行標(biāo)化的，以一式三份實(shí)施的單個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的結(jié)果O圖2A的條形圖描述測(cè)定在293FT細(xì)胞中HCV - IRES驅(qū)動(dòng)的基因表達(dá)所受到的抑制的實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，所述的293FT細(xì)胞以雙螢光素酶報(bào)道基因、SEAP表達(dá)質(zhì)粒和Ipmol的體外轉(zhuǎn)錄的shRNA共轉(zhuǎn)染。靶質(zhì)粒為P⑶NA3/HCV IRES雙螢光素酶報(bào)道基因(HCV IRES，如圖IE所示)。如實(shí)施例I所述測(cè)定螢火蟲螢光素酶活性。將螢火蟲螢光素酶和SEAP活性基于100進(jìn)行標(biāo)化。圖2B是描述測(cè)定在293FT細(xì)胞中HCV抑制相對(duì)于EMCB抑制的實(shí)驗(yàn)的結(jié)果的條形圖。數(shù)據(jù)表示為用螢光素酶活性除以SEAP活性并基于100標(biāo)化后的值。圖2C是描述闡明單堿基錯(cuò)配對(duì)shRNA效力的影響的實(shí)驗(yàn)的結(jié)果的條形圖。實(shí)驗(yàn)條件如圖2A所述。包含突變堿基對(duì)的SNPl與SNP2如圖IB所示。圖2D的線圖描述測(cè)定HCVa-wt和突變(HCVa-mut)或?qū)φ?229)shRNA對(duì)HCV IRES驅(qū)動(dòng)的基因表達(dá)的抑制的劑量反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)條件如圖2A所述。數(shù)據(jù)表示為用螢光素酶活性除以SEAP活性并基于100標(biāo)化后的值。所有數(shù)據(jù)均為一式三份實(shí)施的單個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。圖2E的線圖描述了如下實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，所述實(shí)驗(yàn)測(cè)定HCVa-wt、HCVa-mut與229shRNA在缺少shRNA靶點(diǎn)的雙螢光素酶報(bào)道基因的基因表達(dá)上的劑量反應(yīng)。除了靶序列為由EMCV IRES而非HCV IRES驅(qū)動(dòng)的螢火蟲螢光素酶之外，其余操作如圖2D所述。圖2F為按如下處理的共轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞的Northern印跡分析的再現(xiàn)；將從未用抑制劑轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中(道I)、或用229 (道2)、HCVa-wt (道3)或HCVa-mut (道4)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中分離出的10 μ g總RNA以變性凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)移到膜上并相繼地用32P-標(biāo)記的fLuc、 SEAP或延伸因子IA (EFlA) cDNA探針雜交。將RNA印跡暴露于進(jìn)行顯象和定量的儲(chǔ)存磷光質(zhì)屏(storage phosphor screen) (BioRad FX Molecular Imager)。圖3A的線圖描述了用人類肝細(xì)胞系Huh7來測(cè)試HCVa-wt與HCVa-mut shRNA的劑量反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。除了使用Huh7細(xì)胞以外，其余實(shí)驗(yàn)操作如圖2D所示。圖3B的線圖描述了證明HCVa-wt shRNA不抑制缺少HCV IRES的類似靶的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。除了添加pCDNA3/EMCV IRES雙螢光素酶報(bào)道基因(EMCV IRES)以代替pCDNA3/HCVIRES雙螢光素酶報(bào)道基因(HCVIRES)以外，將細(xì)胞如圖3A所示進(jìn)行轉(zhuǎn)染。數(shù)據(jù)表示為用螢光素酶活性除以SEAP得到的值。所有數(shù)據(jù)均產(chǎn)生自一式三份進(jìn)行的單個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。
圖4A描述包含在HCV基因型IA的25個(gè)核苷酸靶位點(diǎn)(SEQ IDNO :26)內(nèi)的7個(gè)人工siRNA和shRNA的19堿基對(duì)病毒識(shí)別序列，及有關(guān)它們?cè)阡逡义V染色的10%非變性聚丙烯酰胺凝膠上的純度分析。SiRNA :有義鏈與反義鏈包含3’ -UU突出端；shRNAs :環(huán)序列和3’、5’ -端突出端與25個(gè)堿基對(duì)的shRNA的環(huán)序列和3’、5’ -端突出端相同。圖4B是描述如下實(shí)驗(yàn)結(jié)果的條形圖，其中測(cè)定RNA抑制劑(siRNA和shRNA)在抑制劑濃度InM時(shí)對(duì)于293FT細(xì)胞中HCV IRES-介導(dǎo)的基因表達(dá)的抑制作用。圖4C是描述如下實(shí)驗(yàn)結(jié)果的條形圖，其中測(cè)定RNA抑制劑在抑制劑濃度0. InM時(shí)對(duì)于293FT細(xì)胞中HCV IRES-介導(dǎo)的基因表達(dá)的抑制作用。圖5A是小鼠的IVIS圖像的再現(xiàn)，其中將雙螢光素酶HCV IRES報(bào)道基因質(zhì)粒(10 μ g)與SEAP (為控制注射效率和非特異性抑制而添加)和100 μ g所示HCV shRNA或?qū)φ?29shRNA(直接地或以100 μ g表達(dá)shRNA的pol III表達(dá)質(zhì)粒的形式)或者作為對(duì)照的pUC18質(zhì)粒，共同注射入小鼠的尾靜脈。在注射后的不同時(shí)間點(diǎn)(24、36、48、60、72、84和100小時(shí))，將螢光素腹膜內(nèi)施用，并用IVIS體內(nèi)成像系統(tǒng)(IVIS in vivo imaging system)進(jìn)行小鼠成像。圖像表不84小時(shí)時(shí)間點(diǎn)的小鼠。圖5B是描述圖5A所述實(shí)驗(yàn)的定量結(jié)果的圖，其中RNA進(jìn)行直接遞送。用ImageQuant 軟件進(jìn)行定量。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)代表4_5只小鼠的平均值。在96小時(shí)的時(shí)間點(diǎn)，小鼠放血并且如實(shí)施例I所述用PNPP試驗(yàn)來測(cè)定SEAP活性值。用螢光素酶除以SEAP活性并基于PUC18對(duì)照小鼠(100%，為了清晰在pUC18對(duì)照上沒有顯示誤差棒；誤差棒與所示的其它類似)進(jìn)行標(biāo)化來表示定量數(shù)據(jù)。圖6是描述如下實(shí)驗(yàn)的結(jié)果的條形圖，在所述實(shí)驗(yàn)中比較shRNA與磷酸二酰胺酯瑪琳代寡聚物對(duì)于小鼠中HCV IRES-介導(dǎo)的報(bào)道基因表達(dá)的抑制作用。如圖5的實(shí)驗(yàn)所述，用雙螢光素酶HCV IRES報(bào)道基因質(zhì)粒和pSEAP與100 μ g所示HCV shRNA抑制劑或Inmole以前已證實(shí)可以抑制HCV IRES表達(dá)構(gòu)建體的瑪琳代寡核苷酸M共同注射小鼠。在處理后的不同時(shí)間(12小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)和144小時(shí))給小鼠拍照。所示數(shù)據(jù)為48小時(shí)時(shí)間點(diǎn)的。該定量數(shù)據(jù)表示為基于PUC18對(duì)照(無添加)小鼠標(biāo)化的螢光素酶和SEAP活性。由每構(gòu)建體3-5只小鼠得到所示結(jié)果。圖7是描述如下實(shí)驗(yàn)結(jié)果的圖，其中由表達(dá)祀向nsp-Ι基因的抑制性shRNA的質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，用10 μ I高度復(fù)制的表達(dá)GFP的塞姆利基森林病毒(Semliki forest virus) (SFV-GFP-VA7 ;足以實(shí)現(xiàn)約100%感染的感染復(fù)數(shù)(MOI))感染細(xì)胞，并在感染后24小時(shí)用流式細(xì)胞計(jì)測(cè)定病毒-介導(dǎo)的GFP表達(dá)。siRNA-介導(dǎo)的抑制的水平約為35%。標(biāo)記靶向Nsp-I基因的Nspl. shRNA (nsp_l#2);空載體，pU6 ;首次用于實(shí)驗(yàn)的(丨未感染的BHK細(xì)胞。圖8是描述研究shRNA對(duì)于復(fù)制缺陷SFV (SFV-PD713P-GFP)的抑制的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的條形圖。用表達(dá)抑制劑shRNA的質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后46小時(shí)，在無血清培養(yǎng)基中以8%PEG按MOI為5使用SFV-GFP病毒感染細(xì)胞I小時(shí)。然后加入完全培養(yǎng)基并于37°C溫育細(xì)胞過夜。用流式細(xì)胞計(jì)在感染后9、24、32、99和125小時(shí)分析細(xì)胞。為了清楚，只顯示3個(gè)時(shí)間點(diǎn)(9、24和32小時(shí))。將每個(gè)shRNA的抑制值基于衣殼shRNA標(biāo)準(zhǔn)化。 在該SFV-GFP復(fù)制缺陷病毒中不存在衣殼mRNA，因此衣殼shRNA對(duì)GFP表達(dá)應(yīng)沒有影響。本實(shí)驗(yàn)中shRNA表達(dá)構(gòu)建體的轉(zhuǎn)染效率約為70%，表明實(shí)際的病毒抑制作用顯著高于所示水平。第五組條形(混合的)指靶向nspl-4和衣殼的shRNA的混合物。圖9是描述測(cè)定shRNA對(duì)HCV復(fù)制子的抑制作用的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的線圖。圖10是描述用于篩選在293FT細(xì)胞中能抑制HCV IRES-介導(dǎo)的基因表達(dá)的shRNA的序列及其結(jié)果的表格。在48孔組織培養(yǎng)板的孔中用pCDNA3/HCV IRES雙螢光素酶報(bào)道基因構(gòu)建體(40ng)、pSEAP2 (25ng，作為轉(zhuǎn)染和特異性對(duì)照)和shRNA (I或5nM)(使用Lipofectamine 2000)共轉(zhuǎn)染細(xì)胞。加入質(zhì)粒pUC18以向每個(gè)孔提供總共400ng核酸。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，取出上清液來進(jìn)行SEAP分析，裂解細(xì)胞，并用光度計(jì)測(cè)定螢火蟲螢光素酶的活性。所有數(shù)據(jù)都是至少兩個(gè)一式三份進(jìn)行的獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。SEAP水平在所有樣品中都一致。還在突變的P⑶NA3/HCV IRES螢光素酶報(bào)道基因構(gòu)建體上進(jìn)行了測(cè)定shRNA特異性的對(duì)照實(shí)驗(yàn)，其中C340 (IRES中)被U替代。圖11是具有被shRNA靶向的片段的HCV IRES 3’端序列的圖示。其中指出C340 — U的突變(用于測(cè)定shRNA的特異性)。圖12A是HCV IRES的5’端和六個(gè)19_bp shRNA的靶向位置的圖示。圖12B的條形圖描述了篩選在293FT細(xì)胞中能抑制HCV IRES-介導(dǎo)的基因表達(dá)的shRNA的結(jié)果。如圖10進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；shRNA濃度，InM。圖13A是所示25個(gè)堿基對(duì)shRNA的測(cè)試變體的序列的圖示，其中檢查了不同的環(huán)大小和序列以及3’端。圖13B是描述篩選能在293FT細(xì)胞中抑制HCV IRES介導(dǎo)的基因表達(dá)的圖13A所示shRNA的結(jié)果的條形圖。如圖10進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。shRNA濃度，InM。(shRNA序列列于圖16A-B)圖14A是所示19-bp shRNA的測(cè)試變體的序列的圖示，其中檢查了不同的環(huán)大小和序列以及3’端。圖14B是描述篩選能在293FT細(xì)胞中抑制HCV IRES介導(dǎo)的基因表達(dá)的圖14A所示shRNA的結(jié)果的條形圖。如圖10所述進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。shRNA濃度，InM。(shRNA序列列于圖16A-B)圖15是描述篩選shRNA (和siRNA)在HCV復(fù)制子系統(tǒng)中的抑制活性的結(jié)果的條形圖。用RNA抑制劑轉(zhuǎn)染穩(wěn)定表達(dá)HCV亞基因組復(fù)制子的人類肝細(xì)胞(AVA5，Huh7細(xì)胞系的衍生物)，并測(cè)定HCV表達(dá)的量。測(cè)試了一系列濃度并確定了產(chǎn)生50%抑制作用的sh/siRNA濃度(EC50)。暗條和淺條表示兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。圖16A-B是描述靶向所示HCV IRES的shRNA序列的表格。用下劃線表示ShRNA環(huán)。小寫所示的核苷酸與靶序列不互補(bǔ)。發(fā)明詳述本發(fā)明提供用于抑制病毒(例如丙型肝炎)基因表達(dá)和/或治療哺乳動(dòng)物的病毒感染的組合物、方法和試劑盒。 RNA干擾提供了一種治療病毒感染的新的治療方法。本發(fā)明提供靶向病毒序列并抑制(即減少或消除)病毒基因表達(dá)的小干擾RNA (例如，shRNA和siRNA)，以及使用這種小干擾RNA治療哺乳動(dòng)物(如人類)的病毒感染的方法。在一些具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的小干擾RNA構(gòu)建體通過在小干擾RNA的反義序列所識(shí)別的靶序列內(nèi)部或附近誘導(dǎo)病毒多核苷酸序列的斷裂來抑制病毒的基因表達(dá)。如本文所用，“小干擾RNA”指包含一個(gè)或多個(gè)至少部分互補(bǔ)于病毒的多核苷酸序列并能與其相互作用的短序列的RNA構(gòu)建體。相互作用可采取小干擾RNA的互補(bǔ)(反義)序列與病毒靶多核苷酸序列之間直接結(jié)合的形式，或可采取通過酶機(jī)器(例如，蛋白質(zhì)復(fù)合體)允許小干擾RNA的反義序列識(shí)別靶序列的間接相互作用的形式。有些情況下，小干擾RNA識(shí)別靶序列導(dǎo)致在小干擾RNA的識(shí)別(反義)序列所識(shí)別的靶位點(diǎn)內(nèi)部或附近的病毒序列斷裂。小干擾RNA可僅包含核糖核苷酸殘基，或小干擾RNA可包含一個(gè)或多個(gè)修飾殘基，尤其是在小干擾RNA的末端或在小干擾RNA的有義鏈上。本文所用的術(shù)語“小干擾RNA”包括shRNA和siRNA，兩者均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解和知道，是指具有特定的構(gòu)型特征和類型的RNA構(gòu)建體。如本文所用，“shRNA”指包含雙鏈區(qū)和在一端形成發(fā)夾環(huán)的環(huán)區(qū)的RNA序列。該雙鏈區(qū)在莖的每一側(cè)各典型地有大約19個(gè)核苷酸到大約29個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度，該環(huán)區(qū)典型地有大約3到大約10個(gè)核苷酸長(zhǎng)度(并且任選存在3’或5’端單鏈的突出核苷酸)。這種shRNA的一個(gè)實(shí)例HCVa-wtshRNA具有一個(gè)25堿基對(duì)雙鏈區(qū)(SEQ ID NO :12)、一個(gè)10核苷酸環(huán)、一個(gè)在5’末端的GG延伸以及一個(gè)在3’末端的UU延伸。在說明書(例如圖16A-B)中提供了適用于如抑制HCV表達(dá)的shRNA的其它實(shí)例。如本文所用，“siRNA”指包含雙鏈區(qū)并在每末端具有非同源殘基的3’突出端的RNA分子。該雙鏈區(qū)一般有大約18到大約30個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度，且突出端可為任何長(zhǎng)度的非同源性殘基，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或更多個(gè)核苷酸。SiRNA還可包含由非配對(duì)區(qū)分開的兩個(gè)或多個(gè)19-30堿基對(duì)的區(qū)段。不參照任何特定理論，非配對(duì)區(qū)可起到阻斷先天免疫途徑的激活的作用。這種siRNA的一個(gè)實(shí)例是HCVa-wt siRNA,其具有一個(gè)25個(gè)堿基對(duì)的雙鏈區(qū)(SEQ ID NO :12)，并在每個(gè)3’末端具有一個(gè)UU延伸。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，如本文所述的小干擾RNA包含互補(bǔ)于丙型肝炎(“HCV”)內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)元件的序列的序列。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，病毒為HCV基因型la。
已經(jīng)表明siRNA基因抑制作用可顯著抑制許多哺乳動(dòng)物系統(tǒng)的基因表達(dá)。由于具有高水平的二級(jí)結(jié)構(gòu)，HCV IRES已經(jīng)被提示是siRNA或shRNA的差靶點(diǎn)。但是Mizusawa報(bào)道了，在293和Huh7組織培養(yǎng)細(xì)胞中對(duì)HCV IRES的成功打靶，報(bào)道基因表達(dá)分別降低了50%和74%。類似地，Seo和同事[25]報(bào)道了 IOOnM siRNA能在5_2Huh7細(xì)胞中抑制HCV的復(fù)制(大約降低85%)。如本文所述，現(xiàn)在已經(jīng)證明了靶向HCV IRES3’末端(包括AUG翻譯起始位點(diǎn)及其下游)的小干擾RNA (shRNA和siRNA)，可在293FT細(xì)胞中以O(shè). 3nM誘導(dǎo)HCVIRES-依賴性螢光素酶表達(dá)降低96%，并在Huh7細(xì)胞中以O(shè). InM誘導(dǎo)75%降低(參見圖2D和3A)。此外，已證明將shRNA直接運(yùn)送到小鼠肝臟中可有效抑制HCVIRES-依賴性報(bào)道基因的表達(dá)。這是直接運(yùn)送RNA發(fā)夾(而非由質(zhì)?；虿《据d體在體內(nèi)表達(dá))在動(dòng)物模型中達(dá)成RNAi介導(dǎo)的基因抑制的第一個(gè)證明。鑒于血液中存在的高水平的核酸酶，通過流體動(dòng)力學(xué)注射而直接運(yùn)送到小鼠肝臟中的shRNA的有效性是使人驚訝的。這些shRNA有效降低肝臟中基因表達(dá)的觀察結(jié)果表明這些shRNA抑制劑(I)很有效，并且不需要在小鼠肝臟中達(dá)到高水平來產(chǎn)生基因抑制，(2)可以被足夠快速地運(yùn)送到肝臟中，如在其被核酸酶大量切割而阻礙抑制作用之前，或者(3)對(duì)核酸酶降解作用具有內(nèi)在穩(wěn)定性(或這些特征的結(jié)合)。有報(bào)道提示，由于非天然5’三磷酸的存在，來自噬菌體啟動(dòng)子的體外合成的轉(zhuǎn)錄 物可有效誘導(dǎo)干擾素(IFN) α和β [26]。此外，由pol III表達(dá)載體表達(dá)的shRNA也可誘導(dǎo)IFN[27]。這種干擾素誘導(dǎo)將如何影響ShRNA在HCV感染中的臨床應(yīng)用還不清楚。目前的HCV療法包括用干擾素α治療，這表明如果干擾素被shRNA所誘導(dǎo)，它可具有正效應(yīng)。迄今為止，還沒有報(bào)道過動(dòng)物在接受RNAi施用后出現(xiàn)干擾素-相關(guān)的副作用[3]。此外，已引起關(guān)注的是siRNA的脫靶效應(yīng)以及當(dāng)用慢病毒載體運(yùn)送siRNA或shRNA時(shí)的潛在細(xì)胞毒性作
BH [28]
川 O本發(fā)明還涉及測(cè)定靶向HCV IRES序列的siRNA和shRNA以鑒定具有足夠活性(如在選定的一組這種序列中的最高活性)以作為用于治療的候選物的那些序列的方法。測(cè)定也可包括篩除具有不想要的脫靶效應(yīng)或普遍的細(xì)胞毒性作用的小干擾活性。脫靶效應(yīng)包括，而不限于非靶基因的敲除、非靶基因表達(dá)的抑制和與天然小RNA(HiiciORNA)途徑的競(jìng)爭(zhēng)(Birmingham 等人，Nat. Methods. 20063 (3) :199-204 ;Grimm 等人，Nature 2006441(7092) :537-541)。在本領(lǐng)域已知鑒定細(xì)胞毒性作用的方法(例如，Marques等人，Nat.Biotechnol. 2006 24(5):559-565 ；Robbins 等人，Nat. Biotechnol. 2006 24(5):566-571 )。HCV 5’ -UTR中的IRES區(qū)是高度保守的(92-100%同一性[15’2931])并有幾個(gè)片段似乎是不變的，這使得IRES成為基于核酸的抑制劑的主要靶點(diǎn)。AUG翻譯起始密碼子周圍的區(qū)域尤其是高度保守的，正如在來自不同地理區(qū)域的超過81個(gè)分離株中觀察到的，在+8位到-65位(除了 -2位有單核苷酸變化外)是不變的[32]。盡管IRES基序中序列的保守性，但是不太可能靶向單一序列(即使其高度保守)就足以防止逃避突變體。已知RNA病毒具有高突變率，這是由于RNA聚合酶的高出錯(cuò)率和該酶缺乏校對(duì)活性所致。平均起來，HCV RNA每復(fù)制一次將有一個(gè)錯(cuò)誤加入新鏈中。此出錯(cuò)率會(huì)因病毒顆粒在活躍感染時(shí)的大量產(chǎn)生而增加(在慢性感染患者體內(nèi)，每日大約一兆)[33]。因此，在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，靶向幾個(gè)保守位點(diǎn)或，備選地，將如本文所述的shRNA用作聯(lián)合治療(如與三氮唑核苷和/或聚乙醇化干擾素一起)的組分。如本文證明的，單一錯(cuò)配不會(huì)完全阻斷shRNA活性(參見實(shí)施例2 ;圖2D);因此每個(gè)不同的shRNA都可具有一些對(duì)抗有限數(shù)量的突變的活性。因此，本發(fā)明包括利用可包括與靶序列的錯(cuò)配的shRNA來抑制HCV表達(dá)的方法。本發(fā)明還包括通過施用至少兩種不同的靶向HCV IRES的shRNA來抑制HCV表達(dá)的方法，其中的所述shRNA在靶向序列中有差異。McCaffrey與同事們報(bào)道了靶向在AUG翻譯起始位點(diǎn)處的保守HCVIRES位點(diǎn)的磷酰ニ胺嗎啉寡核苷酸有效抑制了報(bào)道基因的表達(dá)M。使用相同的嗎啉化合物抑制劑來與本文所述的shRNA抑制相對(duì)比。發(fā)現(xiàn)靶向保守HCV IRES位點(diǎn)的嗎啉化合物和shRNA兩者都有效并強(qiáng)烈地抑制了 IRES-依賴性的基因表達(dá)。在嗎啉化合物中需要有4個(gè)突變來阻斷活性，而在shRNA中有2個(gè)改變就足夠了，這說明更大的shRNA特異性。這種潛在優(yōu)點(diǎn)與shRNA抑制劑缺乏非天然殘基及由此所致的可能更少的副作用相聯(lián)合，可以與嗎啉寡聚物的穩(wěn)定性的增加相抵。使用雙報(bào)道基因螢光素酶質(zhì)粒，其中螢火蟲螢光素酶(flue)的表達(dá)取決于HCVIRESt24]。上游海腎螢光素酶的表達(dá)不是HCV IRES依賴性的，而是在帽依賴性過程中翻譯。HCV IRES shRNA的直接轉(zhuǎn)染，或者備選地，從pol III啟動(dòng)子載體表達(dá)shRNA，均有效地阻斷了人類293FT與Huh7細(xì)胞中HCV IRES介導(dǎo)的fLuc表達(dá)。包含雙突變的對(duì)照shRNA對(duì) fLuc表達(dá)幾乎沒有或完全沒有作用，并且僅包含単一突變的shRNA表現(xiàn)出部分抑制作用。還在小鼠模型中評(píng)估了這些shRNA，其中通過流體動(dòng)力學(xué)壓轉(zhuǎn)染經(jīng)由尾靜脈將DNA構(gòu)建體運(yùn)送到肝臟的細(xì)胞中。利用雙螢光素酶表達(dá)質(zhì)粒、shRNA和分泌性堿性磷酸酶質(zhì)粒轉(zhuǎn)染肝臟的細(xì)胞，并且在12到96小時(shí)的多個(gè)時(shí)間點(diǎn)上進(jìn)行動(dòng)物的成像。體內(nèi)成像顯示出，HCVIRESshRNA (直接地或者備選地從pol III質(zhì)粒載體表達(dá))抑制了 HCV IRES依賴性報(bào)道基因的表達(dá)；突變或無關(guān)shRNA幾乎不起或完全不起作用。這些結(jié)果表明以RNA形式運(yùn)送的或從病毒或非病毒載體表達(dá)的shRNA，可用作控制HCV和相關(guān)病毒的有效抗病毒劑。對(duì)靶向HCV IRES域IV上的不同位點(diǎn)的三個(gè)額外的shRNA的測(cè)定顯示出另ー個(gè)有效shRNA，即HCVd-wt，其靶位點(diǎn)自HCVa-wt的靶位點(diǎn)移動(dòng)6個(gè)核苷酸。HCVb-wt與HCVc-wt是低效得多的抑制劑。為了進(jìn)一歩研究局部序列對(duì)于效力的影響，測(cè)定了七個(gè)體外轉(zhuǎn)錄的包含與HCVIRES序列互補(bǔ)的19個(gè)堿基對(duì)序列的shRNA構(gòu)建體以及包含相同的19個(gè)堿基對(duì)序列的相應(yīng)合成的siRNA的抑制活性，其中所述shRNA構(gòu)建體和合成的siRNA靶向HCVa-wt的25個(gè)堿基對(duì)位點(diǎn)(344-368 )內(nèi)的所有可能位點(diǎn)。還測(cè)定了與HCVa-wt shRNA相應(yīng)的25個(gè)堿基對(duì)的合成siRNA。所有測(cè)試的構(gòu)建體都表現(xiàn)出高水平的活性。通常，19個(gè)堿基對(duì)的siRNA比19個(gè)堿基對(duì)的shRNA更有效。最有效的siHCV19-3在lnM(>90%抑制)、0. InM(大約90%抑制)以及甚至在0. OlnM濃度下(大約40%抑制)有效。因此，設(shè)計(jì)以靶向HCV IRES上344-374區(qū)的19-25個(gè)堿基對(duì)的shRNA和siRNA是通常有效的HCV表達(dá)的抑制劑，但有ー些局部差
巳升。本發(fā)明的小發(fā)夾RNA可任選地包括在shRNA的有義鏈和反義鏈之間導(dǎo)致強(qiáng)非共價(jià)鍵的結(jié)構(gòu)。這種非共價(jià)鍵的例子包括由金屬離子介導(dǎo)的交聯(lián)。可在天然或修飾的核苷酸殘基(包括，例如，修飾的堿基、糖和端基)之間形成這種交聯(lián)，如Kazakov和Hecht 2005，Nucleic Acid-Metal Ion Interactions,King, R. B.(編車耳)，Encyclopedia of InorganicChemistry.第二版，Wiley, Chichester,第 VI 卷，第 3690-3724 頁，如 5. 4. 3 部分中所述。所述鍵的變體的其它非限制實(shí)例可在專利申請(qǐng)WO 99/09045 (US2006074041 ;如圖10)中找到。通?？山宦?lián)的核苷酸殘基的位置處在當(dāng)雙鏈體形成時(shí)緊靠在一起的互補(bǔ)RNA鏈的末端。某些金屬離子(或金屬離子配位化合物)的加入可導(dǎo)致對(duì)這些金屬離子具有強(qiáng)親合力的官能團(tuán)(例如-SH、-SCH3、硫代磷酸酯、咪唑化物(imidazolide)、鄰菲咯啉及其它)的交聯(lián)?？梢栽谟辛xRNA鏈和反義RNA鏈的化學(xué)合成中，導(dǎo)入這些修飾的核苷酸。有義鏈和反義鏈中的修飾的核苷酸可形成堿基對(duì)或成為1-3個(gè)核苷酸的突出端的部分。革巴向序列(targeting sequence)說明書中提供了靶向序列的實(shí)例。在如表I和圖10中提供了靶向序列的非限定實(shí)例。并入靶向序列的SiRNA和shRNA的非限制性實(shí)例參見說明書(如圖I和圖16A-B中)。環(huán)還研究了 shRNA的環(huán)區(qū)的大小和序列的影響。shRNA莖-環(huán)的環(huán)區(qū)可小至2個(gè)到3個(gè)核苷酸，且沒有明確的大小上限；通常，環(huán)是4個(gè)到9個(gè)核苷酸，且通常為不引起不期望 的作用(如由與非靶基因互補(bǔ)導(dǎo)致的作用的序列)。可將如GNRA四環(huán)這樣的高度結(jié)構(gòu)化環(huán)序列用于shRNA的環(huán)區(qū)(如作為環(huán))。環(huán)可位于分子的任一端；即，有義鏈可為相對(duì)于環(huán)的5’或3’。此外，可以將非互補(bǔ)雙鏈區(qū)(大約I個(gè)到6個(gè)堿基對(duì)，如4個(gè)CG堿基對(duì))置于靶向雙鏈體和環(huán)之間，如充當(dāng)“ CG夾”來增強(qiáng)雙鏈體的形成。如果用了非互補(bǔ)的雙鏈體，就需要至少19個(gè)堿基對(duì)的靶互補(bǔ)雙鏈體。環(huán)結(jié)構(gòu)還可包括可逆的連接，如S-S鍵，其可由導(dǎo)入核苷酸殘基的-SH基團(tuán)的氧化而形成，例如，如(Earnshaw 等人，J. MoI. Biol.，1997, 274 :197-212 ；Sigurdsson 等人，Thiol-Containing RNA for the Study of Structure and Function of RiDozymes.METHODS: A Companion to Methods in Enzymology, 1999,18 :71-77)中所述。具有 SH 基團(tuán)的核苷酸殘基的定位的非限制性實(shí)例是位于在雙鏈體形成時(shí)緊靠在一起的互補(bǔ)RNA鏈的末端?？梢栽谛「蓴_RNA的有義RNA鏈和反義RNA鏈的化學(xué)合成期間，導(dǎo)入這種修飾的核苷酸。有義RNA鏈和反義RNA鏈中的此修飾核苷酸可形成堿基對(duì)或形成I個(gè)到3個(gè)核苷酸的非互補(bǔ)突出端。可在實(shí)施例中找到環(huán)及其應(yīng)用，如在靶向HCV的shRNA和siRNA中的應(yīng)用的其它非限制性實(shí)例。末端如本文所述的shRNA的3’端可具有2個(gè)或更多個(gè)核苷酸的非靶互補(bǔ)性突出端，例如UU或dTdT，但是突出端可為包括化學(xué)修飾的核苷酸在內(nèi)的任何核苷酸，例如，促進(jìn)核酸酶耐受性的増加的核苷酸。在其它具體實(shí)施方案中，3’末端上有I個(gè)或0個(gè)核苷酸的突出端。5’末端可具有非互補(bǔ)的延伸，例如兩個(gè)G(如圖IB所示)，ー個(gè)GAAAAAA序列，或僅僅I個(gè)或0個(gè)延伸超出靶互補(bǔ)性雙鏈體區(qū)的核苷酸。在圖IB所示的序列中，包括兩個(gè)5’G主要是為了便于從17啟動(dòng)子進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。其它特征可任選地包括在用于抑制HCV表達(dá)的shRNA中并為本發(fā)明所包括的其它特征是靶互補(bǔ)性雙鏈體區(qū)從大約19個(gè)堿基對(duì)至大約30個(gè)堿基對(duì)的長(zhǎng)度變化，所靶向的序列的小的移動(dòng)(通常0個(gè)到大約2個(gè)核苷酸)，以及沿靶的任一方向的多至大約10個(gè)核苷酸的移動(dòng)可位于可靶向的區(qū)域內(nèi)。類似地，還可以耐受錯(cuò)配反義鏈中的大約I個(gè)到大約2個(gè)與有義鏈中的大約I個(gè)到大約9個(gè)(后者使發(fā)夾雙鏈體喪失穩(wěn)定性但不影響反義鏈對(duì)靶序列的結(jié)合強(qiáng)度)；耐受的數(shù)量部分取決于靶互補(bǔ)性雙鏈體的長(zhǎng)度。如本文所述，例如使用靶向HCVIRES的序列，在29個(gè)堿基對(duì)的靶互補(bǔ)性雙鏈體中具有至少7個(gè)G-U錯(cuò)配的shRNA能成功地用于抑制HCV表達(dá)。注意圖IB所示的兩個(gè)突變大幅消減了抑制作用，但在其它位置具有突變的其它突變體，尤其是如果它們密集在一起和/或緊靠末端，則可能被更好地耐受。某些變化在本技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)是已知的或在本申請(qǐng)中被證實(shí)。載體本文描述了用于制備shRNA和siRNA的適宜載體，其是本技術(shù)領(lǐng)域已知的。在非限制性實(shí)例中，可在來源于腺相關(guān)病毒或慢病毒的載體環(huán)境中用Pol III啟動(dòng)子例如U6或Hl表達(dá)shRNA。人U6細(xì)胞核RNA啟動(dòng)子和人Hl啟動(dòng)子為可用于表達(dá)shRNA的pol III啟動(dòng)子。通常在載體中想要的ー個(gè)特征是相對(duì)延長(zhǎng)的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。慢病毒載體能轉(zhuǎn)導(dǎo)非分裂細(xì)胞，并保持轉(zhuǎn)基因的持續(xù)長(zhǎng)期表達(dá)。腺相關(guān)病毒血清型8被認(rèn)為是安全的，并且其ー個(gè) 特征在于延長(zhǎng)的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。候選的shRNA 和 siRNA在有些情況下，ー個(gè)或多個(gè)小干擾RNA被鑒定為具有抑制靶病毒(如HCV)的活性?？蛇M(jìn)行其它實(shí)驗(yàn)來進(jìn)ー步表征這些RNA用于例如抑制動(dòng)物中的HCV表達(dá)的適宜性?？衫脛?dòng)物模型進(jìn)行這種實(shí)驗(yàn)。一個(gè)非限制性實(shí)例包括小鼠模型，例如，如實(shí)施例3所列舉的(下 文)。在本領(lǐng)域內(nèi)已知適合于測(cè)試對(duì)HCV的治療的其它動(dòng)物模型，如使用黒猩猩。方法本發(fā)明涉及抑制病毒中基因表達(dá)的方法，包括將病毒與小干擾RNA接觸，例如本文所述的包含至少部分互補(bǔ)于病毒的多核苷酸序列井能與之相互作用的序列的shRNA或SiRNA0在ー些具體實(shí)施方案中，接觸病毒包含將小干擾RNA導(dǎo)入包含病毒的細(xì)胞，S卩，被病毒感染的細(xì)胞。如本文所用的“抑制基因表達(dá)”指病毒的至少ー個(gè)基因的表達(dá)的減少(即，水平降低)或消除。例如，與被病毒感染的相應(yīng)的細(xì)胞或動(dòng)物相比的表達(dá)減少。在ー些具體實(shí)施方案中，對(duì)基因表達(dá)的抑制作用通過小干擾RNA所結(jié)合的病毒靶序列的斷裂來實(shí)現(xiàn)?？赏ㄟ^分析病毒RNA或病毒蛋白來測(cè)定基因表達(dá)。在有些情況下，通過評(píng)價(jià)感染動(dòng)物中癥狀的減少或與病毒感染有關(guān)的蛋白(例如，病毒蛋白如P24，或宿主蛋白如干擾素)的表達(dá)或活性的變化(如減少)來測(cè)定方法(例如，使用本文所述的組合物治療)的效カ。本發(fā)明還涉及在哺乳動(dòng)物中治療病毒感染或治療疑似被感染的對(duì)象(包括對(duì)于預(yù)防性治療而言暴露于病毒的対象)的方法，包括向哺乳動(dòng)物給予含有治療上有效量的小干擾RNA(如本文所述的包括至少部分互補(bǔ)于病毒的多核苷酸序列井能與其相互作用(如在生理?xiàng)l件下雜交，或?qū)崿F(xiàn)RNAi活性)的序列的shRNA或siRNA，所述病毒的多核苷酸序列為如HCV的IRES序列)。在ー些具體實(shí)施方案中，該哺乳動(dòng)物為人類。在ー個(gè)具體實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物是人類并且病毒感染是HCV感染，如HCV基因型Ia的感染，并且小干擾RNA包含至少與HCV的IRES序列互補(bǔ)的序列。如本文所用，“治療上的有效量”指能達(dá)到希望的治療效果(例如減少或消除病毒感染)的小干擾RNA的量。治療上的有效量可分ー劑或多劑施用。劑量的非限制性實(shí)例為大約0. lmg/kg到大約50mg/kg,例如大約I到大約5mg/kg。在本領(lǐng)域中已知適當(dāng)?shù)倪\(yùn)送方法，并且適當(dāng)?shù)倪\(yùn)送方法包括，例如，靜脈內(nèi)施用(例如經(jīng)由末梢靜脈或經(jīng)由導(dǎo)管)。非限制性實(shí)例包括經(jīng)由肝動(dòng)脈或門靜脈運(yùn)送。通常在治療哺乳動(dòng)物的病毒感染的方法中，小干擾RNA與藥學(xué)上可接受的載體ー起施用。如本文所用，“藥學(xué)上可接受的載體”(本文也可替換稱為“藥學(xué)上可接受的賦形劑")是便于ー種或多種小干擾RNA施用的相對(duì)惰性物質(zhì)。例如，載體可賦予組合物形狀或稠度或可充當(dāng)稀釋劑。藥學(xué)上可接受的載體是生物相容的(即對(duì)宿主無毒)，并適于藥學(xué)上有效的物質(zhì)的特定施用途徑。適宜的藥學(xué)上可接受的載體包括但不僅限于穩(wěn)定劑、濕潤(rùn)劑和乳化剤、改變滲透性的鹽、包囊劑、緩沖劑和皮膚滲透增強(qiáng)劑。在ー些具體實(shí)施方案中，藥學(xué)上可接受的載體為水或鹽 水。藥學(xué)上可接受的載體的實(shí)例描述于Remington’sPharmaceutical Sciences (Alfonso R. Gennaro,編輯,第 18 版，1990)。在治療病毒感染的方法中，如本文所述的小干擾RNA通常是胃腸外施用，例如皮下、靜脈內(nèi)或肌內(nèi)。組合物本發(fā)明提供抑制病毒基因表達(dá)和/或治療哺乳動(dòng)物的病毒感染的組合物，其包含至少ー種如本文所述的小干擾RNA。本發(fā)明的組合物可包含兩種或兩種以上的如本文所述的小干擾RNA。根據(jù)本發(fā)明，小干擾RNA (例如shRNA或siRNA)包含與大約19個(gè)到大約30個(gè)核苷酸的病毒多核苷酸序列基本互補(bǔ)的序列，其中小干擾RNA的基本互補(bǔ)序列與病毒的多核苷酸序列的相互作用，通過例如斷裂病毒多核苷酸序列而抑制病毒基因的表達(dá)。在ー些具體實(shí)施方案中，組合物包含包括選自由SEQ ID N0:12、17、18、19、20、21、22、23、24與25組成的組的序列的shRNA。在ー些具體實(shí)施方案中，組合物包含包括下列序列之一的 shRNA :SEQ ID NO:34, SEQ ID N0:35、SEQ ID NO:36, SEQ ID N0:37、SEQ IDNO:38,SEQ IDNO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41,SEQ ID NO:42,SEQ ID NO:43,SEQ IDNO:44、SEQ ID NO:45、SEQ BD NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ IDNO:48,SEQ ID NO:49、SEQ IDNO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55 或 SEQID NO:56 (表10)。在ー些具體實(shí)施方案中，組合物包含SEQ ID N0:57_110中的一種或多種shRNA。在ー些具體實(shí)施方案中，組合物包含包括從SEQ ID NO: 19、20、21、22、23、24和25中選出的序列的siRNA。在其它的具體實(shí)施方案中，組合物包含包括SEQ ID NO: 34,SEQID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ IDNO:37,SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQID NO:41,SEQ ID NO:42,SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45, SEQ IDNO:46,SEQID NO:47,SEQ ID NO:48,SEQ ID NO:49,SEQ ID NO:50,SEQ ID N0:51、SEQ ID NO:52,SEQID NO:53,SEQ ID NO:54,SEQ IDN0:55 或 SEQ ID NO:56 (圖 10)的序列的 siRNA。在ー些具體實(shí)施方案中，組合物包含shRNA或siRNA，其中所述shRNA或siRNA可以結(jié)合于HCV(如HCV基因型Ia)的IRES元件內(nèi)的大約19個(gè)到大約30個(gè)核苷酸的序列，即包含與HCV (如HCV基因型Ia)的IRES元件內(nèi)的大約19個(gè)到大約30個(gè)核苷酸的序列基本互補(bǔ)的序列。組合物可包括多于ー種的不同shRNA，如靶向IRES中的不同序列或靶向靶序列的不同等位基因或突變的shRNA。如本文所述的shRNA或siRNA可包括多于ー種的所鑒定到的序列。某些組合物包含多于ー種的不同shRNA或siRNA序列。在ー些具體實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含如本文所述的小干擾RNA和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。在ー些具體實(shí)施方案中，配制藥物組合物來對(duì)哺乳動(dòng)物，例如人類進(jìn)行腸胃外施用。可以配制包括短干擾RNA (例如siRNA或shRNA)的藥物組合物以便與其預(yù)定的施用途徑相客。施用途徑的實(shí)例包括腸胃外，例如靜脈內(nèi)、真皮內(nèi)、皮下、吸入、經(jīng)皮(局部)、經(jīng)黏膜和直腸施用或ロ服。用于腸胃外、真皮內(nèi)或皮下施用的溶液或懸液可包括下列組分滅菌的稀釋劑，例如注射用水、鹽水溶液、不揮發(fā)性油、聚こニ醇、甘油、丙ニ醇或其它合成的溶劑；抗細(xì)菌劑，例如苯甲醇或?qū)αu基苯甲酸甲酯；抗氧化劑，例如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑，例如こニ胺四こ酸；緩沖劑，例如醋酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽和用于調(diào)整滲漲度的試劑，例如氯化鈉或葡萄糖。可用酸或堿(例如鹽酸或氫氧化鈉)來調(diào)節(jié)pH。腸胃外制劑可封入由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多劑量瓶中。適于注射用途的藥物組合物包括無菌水溶液(當(dāng)為水溶性吋)或分散體及用于即時(shí)制備無菌可注射溶液或分散體的無菌粉末。就靜脈內(nèi)施用而言，適當(dāng)?shù)妮d體包括生理鹽水、抑菌水、Cremophor EL (BASF, Parsippany, NJ)或磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)。在所有情況下，組合物都必須是無菌的，并應(yīng)當(dāng)是達(dá)到易于注射的程度的流體。它應(yīng)當(dāng)在生產(chǎn)和儲(chǔ)存的條件下穩(wěn)定，并必須抗微生物如細(xì)菌和真菌的污染作用而保存。載體可為溶劑或分散介質(zhì)，其包含如水、こ醇、多元醇(例如甘油、丙ニ醇和液體聚こニ醇等)及它們的適宜混合物。 可以如通過利用如卵磷脂等包衣料，在分散體的情況下通過保持懸液中選定顆粒的大小以及通過利用表面活性剤，來保持適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性?？赏ㄟ^各種抗細(xì)菌的和抗真菌的試劑(例如對(duì)羥基苯甲酸酯類、氯代丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫柳汞等)來防止微生物作用。在有些情況下，可以包括等滲劑，例如糖或多元醇，如甘露醇、山梨醇，或氯化鈉。可注射組合物的延長(zhǎng)吸收可通過在組合物中包含延遲吸收劑(如單硬脂酸鋁或明膠)來實(shí)現(xiàn)。可通過將指定量的活性物質(zhì)混入含有上述列舉的ー種組分或多種組分的聯(lián)合的適當(dāng)溶劑中，按照需要，隨后過濾除菌，來制備無菌的可注射溶液。通常，通過將活性化合物混入包含基本分散介質(zhì)及從上述所列的或本領(lǐng)域已知的其它組分中選出的其它組分的無菌載體中來制備分散體。對(duì)于用于制備無菌可注射溶液的無菌粉末，優(yōu)選的制備方法為真空干燥與冷凍干燥，從相應(yīng)的前已除菌過濾的溶液產(chǎn)生活性組分加上任何的額外想要的組分的粉末。ロ服的組合物通常包括惰性稀釋劑或可食用的載體。為了實(shí)現(xiàn)ロ服治療施用的目的，可將活性化合物與賦形劑混合，并以片劑、鎖劑或膠囊劑(例如明膠膠囊)的形式使用?？砂ㄋ帉W(xué)上相容的粘合劑作為組合物的一部分。片劑、丸剤、膠囊劑、錠劑等可包含任何下列組分，或具有類似性質(zhì)的化合物粘合剤，例如微晶纖維素、黃蓍樹膠或明膠；賦形劑，例如淀粉或乳糖；崩解劑，例如藻酸、Primogel或玉米淀粉；潤(rùn)滑劑，例如硬脂酸鎂或Sterotes ;助流劑，例如膠體ニ氧化硅；甜味劑，例如蔗糖或糖精；或矯味劑，例如薄荷、水楊酸甲酯或橙味調(diào)料。為了通過吸入施用，從加壓容器或包含適當(dāng)推進(jìn)劑(如氣體，例如ニ氧化碳)的分配器或噴霧器中以氣溶膠噴霧的形式遞送組合物。還可通過經(jīng)黏膜或經(jīng)皮的途徑進(jìn)行全身施用。為了經(jīng)黏膜或經(jīng)皮施用，可在制劑中使用適于待被滲透的屏障的滲透劑。本領(lǐng)域中通常已知這種滲透劑，其包括，例如，用于經(jīng)黏膜施用的去污劑、膽鹽以及梭鏈孢酸衍生物。經(jīng)黏膜施用可通過使用鼻噴霧法或栓劑完成。就經(jīng)皮施用而言，將活性物質(zhì)配制成如通常本領(lǐng)域中已知的軟膏、油膏、凝膠或霜?jiǎng)?br> 還可以將組合物配制成栓劑(如具有傳統(tǒng)栓劑基質(zhì)，例如可可脂及其它甘油酷)或滯留灌腸劑形式用于直腸遞送。在ー個(gè)具體實(shí)施方案中，使用保護(hù)活性化合物使之免于從身體中被快速清除的載體來配制活性化合物，例如控釋制劑，包括植入物和微囊化的遞送系統(tǒng)?？墒褂每缮锝到獾摹⑸锟上嗳莸木酆衔?，例如こ烯-こ酸こ烯酯共聚物、聚酐、聚羥基こ酸、膠原、聚原酸酯和聚乳酸。這種制劑的制備方法對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的。還可從AlzaCorporation和Nova Pharmaceuticals, Inc商業(yè)獲得這些材料。脂質(zhì)體懸液(包括以抗病毒抗原的單克隆抗體靶向受感染細(xì)胞的脂質(zhì)體)也可用作藥學(xué)上可接受的載體。這些可根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法(例如如美國(guó)專利號(hào)4，522，811中所述)來制備。以單位劑量的形式配制ロ服或腸胃外的組合物有利于方便施用和統(tǒng)ー劑量。本文所用單位劑量形式指適于作為ー個(gè)劑量用于治療對(duì)象的物理上離散的単位；每個(gè)單位包含經(jīng)計(jì)算可以與選定的藥學(xué)載體共同產(chǎn)生想要的治療效果的預(yù)定量的活性化合物。本文公開的化合物的毒性和治療效カ可通過本領(lǐng)域已知的制藥方法，例如在細(xì)胞 培養(yǎng)物或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物中確定，如測(cè)定LD50 (使群體的50%致死的劑量)和ED50 (在群體的50%中產(chǎn)生治療效カ的劑量)。毒性與治療性效果之間的劑量比為治療指數(shù)，并且其可表示為比值LD50/ED50。優(yōu)選顯示高治療指數(shù)的化合物。盡管可以使用顯示毒副作用的化合物，但應(yīng)當(dāng)謹(jǐn)慎設(shè)計(jì)遞送系統(tǒng)以將這種組合物靶向患病組織部位，從而將對(duì)未患病細(xì)胞的潛在損害降到最小，并且由此減少副作用?？蓪募?xì)胞培養(yǎng)物試驗(yàn)和動(dòng)物研究獲得的數(shù)據(jù)用于配制人類用的劑量范圍?；衔锏膭┝?jī)?yōu)選位于幾乎沒有或完全沒有毒性的包括ED50的循環(huán)濃度范圍內(nèi)。劑量可根據(jù)使用的劑型和所用的施用途徑在此范圍內(nèi)變動(dòng)。就本發(fā)明方法中使用的任何化合物來說，最初可從細(xì)胞培養(yǎng)物試驗(yàn)中估算治療上有效的劑量?？稍趧?dòng)物模型中配制劑量，以達(dá)到包括如在細(xì)胞培養(yǎng)物中所測(cè)定的IC50 (即，達(dá)到癥狀的最大抑制的一半的受試化合物的濃度)的循環(huán)血漿濃度范圍。可將該信息用于更精確地確定人類中的有用劑量?？梢匀缤ㄟ^高效液相色譜法測(cè)定血漿中的水平。本發(fā)明還涉及制備用于治療如HCV感染的對(duì)象的藥物的方法。也可將該藥物用于有HCV感染危險(xiǎn)的對(duì)象或疑似感染了 HCV的對(duì)象進(jìn)行預(yù)防性治療。試劑盒本發(fā)明提供包含如本文所述的小干擾RNA的試劑盒。在ー些具體實(shí)施方案中，試劑盒還包括用于本文所述的抑制病毒基因表達(dá)的方法和/或治療哺乳動(dòng)物病毒感染的方法的使用說明書。說明書可以以印刷品形式或以如軟盤、CD或DVD等電子媒介的形式，或以能獲得此說明書的網(wǎng)址的形式提供。在ー些具體實(shí)施方案中，試劑盒包括本發(fā)明的藥物組合物，例如包括至少ー種小干擾RNA (例如shRNA或siRNA)的至少ー個(gè)單位劑量，以及在治療或預(yù)防病毒感染的用法方面給衛(wèi)生保健者提供信息的說明書。經(jīng)常小干擾RNA以無菌水性藥物組合物或干粉(例如凍干的)組合物形式包括在內(nèi)?？梢蕴峁┻m宜的包裝。如本文所用，“包裝”指通常用于系統(tǒng)中能在固定界限內(nèi)容納適于給個(gè)體施用的本發(fā)明組合物的固體基質(zhì)或材料。這種材料包括玻璃和塑料(例如聚こ烯、聚丙烯和聚碳酸酷)瓶、小瓶、紙、塑料和箔覆蓋的塑料封套等。如果使用電子光束(e-beam)消韋技術(shù)的話，包裝應(yīng)具有足夠低的 度來允許對(duì)內(nèi)各物消母。試劑盒還可任選地包括本發(fā)明的藥物組合物的施用裝置，例如注射器或靜脈內(nèi)施用裝置，和/或無菌溶液，例如稀釋劑，如水、鹽水或葡萄糖溶液，用于將干粉(例如凍干的)組合物配制為施用形式。表I本申請(qǐng)中公開的可并入shRNA或siRNA中的靶向序列以及這種shRNA和siRNA的
實(shí)例的列表

.本面'1>參 |k義— I"HCVIREg 上的靶位點(diǎn)的實(shí)例
SBOIDNO:27 VaMKJQA^mMMJAmAmmWfmJC344-3 HCVt-WtiliSNA
SE01DNO:28 UaroUOAGCTTOAOOAUUGOIIQCUC344-368HCVa-SNMshRKi
SEQIDNO:29 UCUUUGAGCOOTAGOAOTCXllOaiC344-368HC￥a-SNP2s_j
SBQIDNO;30 畫 UCUUOGAGCPUUAOOAIIUGOUOCTJC344-368HCVa-mul shRNA
SEQIDNO:31 CCUCCCX1GC5GCACUCGCAAC3CACXC299-323HCVb-wl shlNA
SBQH>NO:32 _ PGOUGCACGOUCUACGAOACCUCCC318-342HCVc-wt shRNA
SBQIDNO:33 C3GUUUUUCUUUGAOOUUUAGGAUUC350-374J HCVd-wt shlNA I
SEQ ID NO: 19 AOGUUUAGGAUUCOUGCUC344-362siRNA#! ,shSNA#
SBQIDNO:2§_ GAGGUUUAGGAUUCGUOCU345-363s!RNA#2, shENAK
SEQIDNO:21 UGAOGUUUAOOAUUCGUGC346-364silNA#3 sblNA
SEQIDNO;22_ UUGAC3GUUUAC3GAUUCX3UG347-365siRNA#4, sliENA#^
SEQIDNO:23 UUUGAGGUUUAGGAUUCGU348-366siRNA#5, shRNA# *
SEQ ID NO:24 CUUUOAGGUUUAGGAUIICG349-367s!RNA#6 s_A痕
SBQ ID NO:25 UCUUUGAGGUUUAC3GAUUC350-3685臟騰,shRNA#!圖16A-B列舉了包含靶向HCV IRES的序列以及使用本文所述的方法測(cè)試的shRNA的實(shí)例。
實(shí)施例下列實(shí)施例進(jìn)ー步舉例說明本發(fā)明。實(shí)施例僅以舉例說明為目的。它們不以任何方式被解釋為限制本發(fā)明的范圍或內(nèi)容。葷施例I :shRNA表汰盒的設(shè)計(jì)與構(gòu)建、T7轉(zhuǎn)錄反應(yīng)以及報(bào)道基因試驗(yàn)從IDT (Coralville, IA)得到化學(xué)合成的寡核苷酸，在無RNase與無致熱原的水(Biowhittaker)中重懸浮，并如下所述退火。下列用來制備shRNA的寡核苷酸對(duì)包含17啟動(dòng)子元件(雙下劃線)、有義和反義HCVIRES序列與miR-23小RNA環(huán)結(jié)構(gòu)(據(jù)報(bào)道有利于細(xì)
胞質(zhì)定位[21’22])。

T7-HCVa-wt fw

5 -|_|pi8_*^)lgagcacgaatcctaaacctca

aagaCTTCCTGTCAtctttgaggtttaggattcgtgctcTT-3，(SEQ ID NO :1)；
T7-HCVa-wt rev 5，-AAgagcacgaatcctaaacctcaaagaTGACAGGAA Gtctttgaggtttaggattcgtgct gglllaglgiiicgliitft -3 ’(SEQ ID NO :2)(雙下劃線標(biāo)出17啟動(dòng)子序列)。除了將核苷酸改變(G— C與C — G)在單下劃線標(biāo)出的殘基處并入合成的寡核苷酸中以外，HCVa-mut shRNA的T7轉(zhuǎn)錄物是相同的。將HCVa-wt shRNA (圖 1B)設(shè)計(jì)為靶向 HCV IRES 上的 344-374 區(qū)；將 HCVbit 設(shè)計(jì)為靶向299-323區(qū)(圖1C);將HCVc-wt設(shè)計(jì)為靶向318-342區(qū)(圖1C);并且將HCVd-wt設(shè)計(jì)為靶向350-374區(qū)(圖1C)。使用MEGAscript 試劑盒(Ambion)體外轉(zhuǎn)錄ShRNA#l-7 (靶向 HCV IRES 上 的位置 344-362，345-363，346-364，347-365，348-366，349-367，350-368 ;參見圖 4A，其描述了 19個(gè)堿基對(duì)的病毒識(shí)別序列)，ShRNA#I-7包含與HCVa-wt shRNA相同的環(huán)序列和5’、3’突出端。在Dharmacon (Lafayette, CO)化學(xué)合成SiRNA#l_7 (參見圖4A，其描述了 19個(gè)堿基對(duì)的病毒識(shí)別序列)，SiRNA#l-7在有義和反義鏈上都包含3’ -UU突出端。用來制備對(duì)照shRNA229的寡核苷酸對(duì)(其靶向腫瘤壞死因子a )為229-5’ - I A A I ACG A( I ( AC I A I ACC GGCGGTGCCTATGTCTCAGCCTCTTCTCACTTCCTGTCATGAGAAGAGGCTGAGACATAGGCACCGCCTT-3’ (SEQ ID NO:3)和

229-3’-AAGGCGGTGCCTATGTCTCAGCCTCTTCTCATGACAGGAAGTGAGAAGAGGCTGAGACATAG
I* fTT j.a rjnnr'i *j.-
ひ C5 ( 丨彳:Q -t) oPolIII U6 shRNA表達(dá)載體的構(gòu)建——小發(fā)夾shRNA表達(dá)載體的設(shè)計(jì)在95°C下將寡核苷酸對(duì)在RNA聚合酶緩沖液中一起溫育(例如60 U 15X退火緩沖液(Promega ；IX=10mM Tris-HCl (pH7. 5)，50mM NaCl)中每種 100 y M 寡核苷酸各 120u I)兩分鐘，并經(jīng)I小時(shí)緩慢冷卻(退火)至低于40°C。所述寡核苷酸被設(shè)計(jì)成提供4個(gè)堿基突出端，以便快速克隆入Bbsl/BamHl消化的pCRII-U6質(zhì)粒中(用下劃線標(biāo)出寡核苷酸序列中的Bbsl與BamHl識(shí)別位點(diǎn)或突出端)。利用TA克隆試劑盒(Invitrogen),將利用引物huU6_5’ATCGATCCCCAGTGGAAAGACGCGCAG(SEQID NO :5)和 huU6_3’-GGATCCGAATTCGAAGACCA CGGTGT irCGTCCITTCCACAA-5’ (SEQ ID N0:6) [23]從人 HT-1080 基因組 DNA 得到的 PCR 產(chǎn)物亞克隆入pCRII載體(Invitrogen)，以制備pCRII-U6polIII表達(dá)質(zhì)粒。將由退火的寡核苷酸(編碼HCV IRES shRNA)組成的盒連入Bbsl/BamHl消化的pCRII-U6質(zhì)粒中。該表達(dá)的shRNA包含便于細(xì)胞質(zhì)定位[21’22]的miR-23小RNA環(huán)結(jié)構(gòu)。通過測(cè)序確認(rèn)最終的pCRII_U6構(gòu)建體。所用的引物對(duì)為pHCVa-wt 5' -ACCGGAGCACGAATCCTAAACCTCAAAGACTTCCTGTCATCTTTGAGGTTTAGGATTCGTGCTCTTTTTTG-S' (SEQ ID NO:7)和 5’-GATCCAAAAAAGAGCACSAATCCTAA
Acctcaaagatgacaggaagtctttgaggtttaggattcgtgctc-S' (seq id no: 8)。如圖 ib 和以上所述，用在下劃線標(biāo)出的殘基處(參見上面)包含適當(dāng)序列改變的寡核苷酸產(chǎn)生PCRII-U6/HCVa-mut (雙突變體)、HCV snpl (5’側(cè)的單個(gè)改變)和HCVsnp2 (3’端的單個(gè)改變)。按照類似方式，用寡核苷酸 5’ -ACCGGGCGGTGCCTATGTCTCAGCCTCTTCTCACTTCCTGTCATGAGAAGAGGCTGAGACATAGGCACCGCCTTTTTT-3’ (SEQ IDN0:9)以及 3’-GATCAAAAAAGGCGGTGCCTATGTCTCAGCCTCTTCTCATGACAGGAAGTGAGAAGAGGCTGAGACATAGGCACCGCC-5’ (SEQ ID NO: 10)來制備對(duì)照 pCRII-U6/229。
T7轉(zhuǎn)錄反應(yīng)95°C下在RNA聚合酶緩沖液中溫育寡核苷酸對(duì)兩分鐘(例如，60 ill 5X轉(zhuǎn)錄緩沖液(Promega)中姆種IOOy M寡核苷酸各120 y I),并經(jīng)I小時(shí)緩慢冷卻(退火)至低于40°C。用 AmpliScribe T7Flash轉(zhuǎn)錄試劑盒(Epicentre Technologies)在42°C下從5 U M生成的退火雙鏈DNA模板轉(zhuǎn)錄ShRNA 4小時(shí),然后在凝膠過濾旋轉(zhuǎn)柱(Microspin G-50,AmershamBiosciences)上純化,所述的凝膠過濾旋轉(zhuǎn)柱已用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)徹底清洗3遍以除去防腐劑。SiRNA通過退火化學(xué)合成的(Dharmacon)RNA的互補(bǔ)鏈來制備siRNA,所述互補(bǔ)鏈各包含適當(dāng)?shù)淖R(shí)別序列加上3’末端的(突出的)UU延伸。轉(zhuǎn)染和報(bào)道基因試驗(yàn) 在補(bǔ)充2mM L-谷氨酰胺和ImM丙酮酸鈉的具有10%胎牛血清(HyClone)的DMEM( Bio^ hittaker )中，維持人 293FT (Invitrogen)和 Huh7 細(xì)胞(美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，馬納薩斯，弗吉尼亞)。轉(zhuǎn)染前一天，按照I. 7xl05細(xì)胞/孔，在24孔板中接種細(xì)胞，導(dǎo)致在轉(zhuǎn)染時(shí)大約80%細(xì)胞匯合。按照制造商的說明書,用Lipofectamine 2000 (Invitrogen,卡爾斯巴德，加利福尼亞)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。就抑制實(shí)驗(yàn)而言，用40ng的p⑶NA3/HCV IRES雙螢光素酶(海腎和螢火蟲)報(bào)道基因構(gòu)建體、50ng的pSEAP2對(duì)照質(zhì)粒(BD Biosciences Clontech，作為轉(zhuǎn)染對(duì)照)和所示量的17產(chǎn)生的shRNA (典型的量Ipmole)或pCRII-U6shRNA表達(dá)構(gòu)建體(710ng)共同轉(zhuǎn)染293FT或Huh7細(xì)胞(一式三份)。將補(bǔ)償性PUC18質(zhì)粒加入轉(zhuǎn)染混合物，以達(dá)到每個(gè)轉(zhuǎn)染800ng總核酸的最終濃度。48小時(shí)后，取出上清液，在65°C下加熱15-30分鐘，并將5-10 ill上清液加入150 ill對(duì)硝基苯基磷酸酯液體底物系統(tǒng)(pNPP，Sigma)中。室溫溫育30-60分鐘之后，在Molecular DevicesThermomax微板讀取器上讀取樣品(405nm),并用SOFTmax軟件(Molecular Devices)定量。裂解剩下的細(xì)胞，并用雙螢光素酶報(bào)道基因測(cè)定系統(tǒng)(Promega)和MicroLumat LB96P光度計(jì)(Berthold)測(cè)定螢光素酶的活性。小鼠從斯坦福大學(xué)動(dòng)物研究所得到6周齡的雌性Balb/c小鼠。根據(jù)動(dòng)物保護(hù)的NIH原則和斯坦福大學(xué)的原則來處理動(dòng)物。小鼠流體動(dòng)力學(xué)注射以及體內(nèi)成像根據(jù)McCaffrey和同事所述,但其中包括省去RNasint24]的小改變,進(jìn)行流體動(dòng)カ學(xué)尾部靜脈注射。用大約五秒，將總量I. 8ml的包含抑制劑(RNA或質(zhì)粒)、IOii g pHCV dualLuc質(zhì)粒和2 u g pSEAP2對(duì)照質(zhì)粒(BDBiosciences Clontech,包含SV40早期啟動(dòng)子)的磷酸鹽緩沖鹽水穩(wěn)定地注射入小鼠尾部靜脈(N=每組4-6只動(dòng)物)。在所示的時(shí)間處，腹膜內(nèi)注射100 u I的30mg/ml螢光素。注射后10分鐘，使用IVIS7成像系統(tǒng)(Xenogen公司，阿拉米達(dá)，加利福尼亞)分析活的麻醉的小鼠，且使用Livinglmage軟件(Xenogen)對(duì)得到的光發(fā)射數(shù)據(jù)進(jìn)行定量。以每分鐘相對(duì)的檢測(cè)到的光報(bào)告原始數(shù)值，并且顯示了每組(N=4-5只動(dòng)物)的平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤。分泌性堿性磷酸酶(SEAP)試驗(yàn)在第5天，通過眼睛的眼眶后靜脈對(duì)小鼠取血。用微量離心機(jī)從血細(xì)胞中分離血清，在65°C下加熱30分鐘來失活內(nèi)源的堿性磷酸酶，將5-10 u I血清加入150 u I pNPP液體底物系統(tǒng)(參見上面)中。在室溫下溫育30-60分鐘后，如上所述讀取樣品(405nm)并定量。實(shí)施例2 :人類組織培養(yǎng)細(xì)胞中HCV IRES-介導(dǎo)的基因表達(dá)的shRNA抑制在本研究中，測(cè)試按實(shí)施例I設(shè)計(jì)并構(gòu)建的靶向丙型肝炎IRES保守區(qū)的短干擾RNA (shRNA和siRNA)在人類組織培養(yǎng)細(xì)胞中抑制HCVIRES-介導(dǎo)的報(bào)道基因表達(dá)的能力。圖IA顯示HCV IRES靶位點(diǎn)(A圖)以及自從包含17啟動(dòng)子序列和HCV IRES靶的雜交寡核苷酸制備的模板經(jīng)由17轉(zhuǎn)錄得到的HCV shRNA (圖1B)。下劃線標(biāo)出的殘基是為產(chǎn)生突變HCV shRNA而進(jìn)行改變的殘基。該shRNA包含此前被提示可以有利于細(xì)胞質(zhì)定位的mir-23小RNA環(huán)結(jié)構(gòu)[21’22]和25個(gè)堿基對(duì)的RNA莖以及在5’ (2個(gè)鳥嘌呤)和3’ (2個(gè)尿苷)末端的2個(gè)核苷酸(其也可通過非Watson-Crick G:U堿基配對(duì)來雜交)。就載體 運(yùn)送的shRNA而言，將重疊的寡核苷酸亞克隆入poIII表達(dá)載體(pCRII-U6，參見實(shí)施例I)中。將靶向HCV IRES結(jié)構(gòu)域IV中的附近位點(diǎn)的其它3種shRNA也設(shè)計(jì)成具有相同莖長(zhǎng)和環(huán)序列(圖1C)。根據(jù)生化足跡研究，HCVb-wt shRNA靶向高度結(jié)構(gòu)化的區(qū)域(用作陰性對(duì)照，以比較效力)，而HCVc-wt和HCVd-wt shRNA祀向更“易接近”的區(qū)域(圖ID ；Brown等人，Nucleic Acids Res.，1992，20:5041-5)。類似于 HCVa-wt shRNA，將所有 RNA 由包含 T7啟動(dòng)子的dsDNA模板進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。為了測(cè)定HCV shRNA抑制HCV IRES介導(dǎo)的基因表達(dá)的有效性，將人293FT或肝細(xì)胞Huh7細(xì)胞用p⑶NA3/HCV IRES雙螢光素酶表達(dá)質(zhì)粒、分泌型堿性磷酸酶表達(dá)質(zhì)粒(PSEAP2，控制轉(zhuǎn)染效率)以及體外合成的shRNA或備選地包含相應(yīng)shRNA盒的pol III表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染。如圖IF所示，靶向AUG翻譯起始位點(diǎn)緊下游的IRES區(qū)域(分別為344-368位和350-374位)的HCVa-wt與HCVd-wt shRNA,均強(qiáng)烈地抑制人293FT細(xì)胞中HCV IRES介導(dǎo)的fLuc表達(dá)。正如預(yù)期的一祥，HCVc-wt (靶向318-342)顯示出中度抑制作用，而HCVb-wt(299-323)顯示出即使有也是非常低的活性。因此，初步篩選掲示出有效的shRNA，即HCVa-wt,其被選出用于進(jìn)ー步的詳細(xì)研究。在293FT細(xì)胞中shRNA對(duì)HCV IRES-介導(dǎo)的基因表達(dá)的抑制的特異性和效カ為了進(jìn)ー步測(cè)定對(duì)HCV-IRES驅(qū)動(dòng)的基因表達(dá)的抑制，用雙螢光素酶報(bào)道基因和SEAP表達(dá)質(zhì)粒以及Ipmol體外轉(zhuǎn)錄的shRNA共轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞。靶質(zhì)粒為pCDNA3/HCV IRES雙螢光素酶報(bào)道基因(HCV IRES,如圖IE所示)。將pUC18質(zhì)粒加入轉(zhuǎn)染混合物，以使每孔(24孔組織培養(yǎng)板)毎次轉(zhuǎn)染的最終總核酸濃度達(dá)到800ng。48小時(shí)后，取出上清液用于SEAP分析，然后裂解細(xì)胞并按照實(shí)施例I所述測(cè)定螢火蟲和海腎(未顯示)螢光素酶活性。將螢火蟲螢光素酶和SEAP活性按100進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。結(jié)果如圖2A所示。靶向AUG翻譯起始位點(diǎn)緊下游的IRES區(qū)域的HCVa-wt shRNA強(qiáng)烈抑制了人293FT(圖2)和肝細(xì)胞Huh7 (圖3B)細(xì)胞系兩者中HCV IRES介導(dǎo)的fLuc表達(dá)。使用在RNA發(fā)夾的配對(duì)中有兩個(gè)改變的突變shRNA (HCVa-mut)(對(duì)于錯(cuò)配位置，參見圖IB)或無關(guān)的TNF(229) shRNA都觀察到幾乎沒有或完全沒有抑制作用。229TNF shRNA對(duì)抑制TNF表達(dá)非常有效(Seyhan等人，RNA, 2005,11 :837_846)，表明RNAi元件可以有效利用此shRNA。發(fā)夾區(qū)的單ー核苷酸變化，不論是在上游或下游的位點(diǎn)(分別是SNPl和SNP2 ;參見圖2C)，都有部分效果。當(dāng)將HCV shRNA靶向類似的雙螢光素酶構(gòu)建體(其中HCV IRES被腦心肌炎病毒(EMCV) IRES替代)吋，觀察到幾乎沒有或完全沒有抑制(圖2B和3B)。因此，圖2B的數(shù)據(jù)說明HCVa-wt shRNA不抑制缺乏HCV IRES的類似靶。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)里，除了用pCDNA3/EMCV雙螢光素酶報(bào)道基因(EMCV IRES)代替p⑶NA3/HCV作為靶以外，其余按照?qǐng)D2A轉(zhuǎn)染細(xì)胞。在圖2B中用按100進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化的SEAP活性除螢光素酶活性所得的值表示這些數(shù)據(jù)。為了驗(yàn)證shRNA通過降解其革EmRNA起作用，進(jìn)行Northern印跡分析(圖2F)。從未以抑制劑或以HCVa-wt、HCVmutI/2或229shRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中分離出總RNA，通過凝膠電泳分離等量的這些RNA。將分離的RNA轉(zhuǎn)至膜上并與特異于fLuc、SEAP和延伸因子IA(EFlA)的放射性標(biāo)記的cDNA探針雜交。在用磷屏成像儀(phosphorimager)定量之后，HCVa-wtshRNA (道3)特異性抑制fLuc mRNA積累(當(dāng)基于SEAP與EFlA mRNA水平進(jìn)行校正后，與229shRNA (道2)相比63%抑制；對(duì)于HCVa_mutl/2而言未觀察到抑制作用)(比較道3和 道4)。這些數(shù)據(jù)表明shRNA降解靶mRNA。劑量反應(yīng)實(shí)驗(yàn)表明HCVa-wt shRNA在293FT細(xì)胞中以0. 3nM (96%抑制，參見圖2D)并且在Huh7細(xì)胞中以0. InM (75%抑制，參見圖3A)有效抑制了 HCV IRES依賴性的基因表達(dá)。為了進(jìn)一歩研究局部序列對(duì)效カ的影響，測(cè)定了靶向HCVa的31個(gè)堿基對(duì)位點(diǎn)(344-374 ;圖4A)中所有可能位點(diǎn)的7個(gè)體外轉(zhuǎn)錄的19bpshRNA和相應(yīng)的合成19堿基對(duì)siRNA的抑制活性。還測(cè)定了對(duì)應(yīng)于HCVa-wt shRNA的、25個(gè)堿基對(duì)的人工合成的siRNA。它們都表現(xiàn)出高水平的活性(圖4B)。最有效カ的是HCVa的siRNA和shRNA以及siRNA#3(其在InM (>90%抑制，圖4B)以及0. InM (大約90%抑制，圖4C)有效)。因此，設(shè)計(jì)以靶向HCV IRES上的344-374區(qū)域的19-25個(gè)堿基對(duì)的shRNA和siRNA是有效的，具有ー些局部差異。實(shí)施例3 :小鼠樽型系統(tǒng)中HCV IRES介導(dǎo)的基因表汰的shRNA抑制將HCV shRNA和HCV shRNA表達(dá)質(zhì)粒抑制靶基因表達(dá)的能力，通過使用流體動(dòng)カ學(xué)注射將這些核酸運(yùn)送到小鼠肝臟的方式，而延伸到小鼠模型系統(tǒng)。圖5顯示了將包含pHCV dual Luc、pSEAP2和shRNA (基于shRNA或表達(dá)shRNA的pol III表達(dá)載體的質(zhì)量，10倍過量于靶)的大體積PBS (I. 8ml)注射到小鼠尾部靜脈(n=4-5只小鼠)的結(jié)果。在如圖5B所示的時(shí)間點(diǎn)處，腹膜內(nèi)注射螢光素并用高靈敏性、冷卻的CCD相機(jī)給小鼠拍照。(圖5A顯示84小時(shí)時(shí)間點(diǎn)上從每組(姆組4-5只小鼠沖選出的代表性小鼠)。在所有測(cè)試的時(shí)間點(diǎn)上，HCV shRNA都強(qiáng)抑制了螢光素酶表達(dá)，與注射P UC18而非shRNA抑制劑的小鼠相比，具有從98% (84小時(shí)時(shí)間點(diǎn))到94% (48小時(shí)時(shí)間點(diǎn))的抑制。突變(mut)或?qū)φ?229)shRNA幾乎沒有或根本沒有作用。應(yīng)該注意螢光素酶活性隨著時(shí)間降低，這可能是由于DNA的丟失或啟動(dòng)子沉默M所致的，并且數(shù)據(jù)在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)上均進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化(參見上述圖5的描述)。圖6顯示HCVa-wt shRNA抑制活性與之前已證實(shí)可以有效靶向此相同位點(diǎn)的磷酰ニ胺嗎啉寡聚物M的比較。HCVa-wt shRNA與嗎啉寡聚物兩者在測(cè)試的所有時(shí)間點(diǎn)上都有效阻斷螢光素酶的表達(dá)。顯示了 48小時(shí)時(shí)間點(diǎn)的數(shù)據(jù)，其中分別對(duì)應(yīng)于HCVa-wt shRNA和嗎啉化合物抑制劑，抑制作用為99. 95%與99. 88%。
實(shí)施例4 :俥用shRNA對(duì)塞姆利某森林病毒(Semliki Forest Virus, SFV)的抑制已將SFV用作毒カ更強(qiáng)的正鏈RNA病毒的模型系統(tǒng)。為了測(cè)定RNAi對(duì)SFV生長(zhǎng)的抑制作用，產(chǎn)生祀向4個(gè)SFV基因(nsp-l、nsp_2與nsp_4與衣殼)的shRNA和I個(gè)nsp_4位點(diǎn)的錯(cuò)配對(duì)照，并由U6啟動(dòng)子表達(dá)出來。測(cè)定其抑制SFV-A7-EGFP增殖的能力，所述SFV-A7EGFP為ー種表達(dá)eGFP報(bào)道基因的高度復(fù)制的SFV菌株SFV_A7[49]。顯示出利用靶向nsp-1 (圖7)時(shí)SFV-GFP復(fù)制被適度減少(大約35%)，但靶向nsp-2、nsp-4或衣殼編碼區(qū)的shRNA及錯(cuò)配siRNA無此作用(未顯示)。此前已經(jīng)證明對(duì)辛德畢斯(Sindbis)病毒有效的衣殼編碼區(qū)內(nèi)的位點(diǎn)[5°]對(duì)SFV無效。此位點(diǎn)上辛德畢斯(Sindbis)-SFV序列的同源性僅為77%。SFV是生長(zhǎng)非常迅速的病毒，在其感染周期中產(chǎn)生多達(dá)200，000個(gè)細(xì)胞質(zhì)RNA。為了觀察是否能在緩慢生長(zhǎng)的病毒的情況下更好地保護(hù)細(xì)胞，在兩個(gè)單獨(dú)實(shí)驗(yàn)中，測(cè)試這些SiRNA對(duì)SFV-GFP的復(fù)制-缺陷菌株的作用。圖8顯示靶向此SFV菌株的U6表達(dá)的shRNA在不超過5天的時(shí)間中可減少病毒表達(dá)彡70%o祀向非結(jié)構(gòu)基因nsp-l、nsp_2與nsp_4的siRNA以及相對(duì)于nsp_4而言帶有I個(gè)錯(cuò)配的siRNA顯示出了該作用，但靶向衣殼基因(其在此缺陷病毒中是缺乏的)的 SiRNA或其它對(duì)照未顯示出該作用(圖8)。注意shRNA所靶向的序列的長(zhǎng)度是29個(gè)核苷酸，且nsp-4錯(cuò)配shRNA中所用的單個(gè)錯(cuò)配對(duì)RNAi的作用明顯地不具有破壞性。在不同shRNA的效カ上的廣泛差異強(qiáng)調(diào)了當(dāng)處理快速?gòu)?fù)制和高突變性病毒(例如SFV)時(shí)，文庫方法在尋找最佳的siRNA與shRNA中的重要性。實(shí)施劑量-反應(yīng)實(shí)驗(yàn)來檢測(cè)Huh7細(xì)胞中由HCVa-wt shRNA和HCVa-mut shRNA以及非特異性對(duì)照shRNA (229)引起的HCV復(fù)制子系統(tǒng)的抑制。在穩(wěn)定復(fù)制HCV RNA-的細(xì)胞系中測(cè)定受試化合物的抗病毒活性，所述HCV RNA-復(fù)制細(xì)胞系為通過轉(zhuǎn)染人成肝細(xì)胞瘤(hepatoblastoma)細(xì)胞系 Huh7 衍生的 AVA5 (Blight 等人，Science, 2000, 290:1972)。用DsRed表達(dá)質(zhì)粒與基于RNA的抑制劑共轉(zhuǎn)染大約80%匯合的培養(yǎng)物。用斑點(diǎn)印跡雜交測(cè)定轉(zhuǎn)染后48小時(shí)HCV RNA的水平。在一式三份的培養(yǎng)物中進(jìn)行測(cè)定。將總共4_6個(gè)未經(jīng)處理的對(duì)照培養(yǎng)物，和用10、3和llU/mla-干擾素(無細(xì)胞毒性的抗病毒活性)，以及用100、10和IuM三氮唑核苷(無抗病毒活性和細(xì)胞毒性)處理的一式3份培養(yǎng)物作為陽性抗病毒和毒性的對(duì)照物。用熒光顯微術(shù)(DsRed表達(dá))估計(jì)轉(zhuǎn)染的效率。按照未經(jīng)處理的培養(yǎng)物(總共6個(gè))中檢測(cè)到的RNA的平均水平的百分比，來確定一式三份處理的培養(yǎng)物中HCV和b-肌動(dòng)蛋白R(shí)NA兩者的水平。P -肌動(dòng)蛋白R(shí)NA的水平既用作毒性的量度，又用來在每個(gè)樣品中標(biāo)準(zhǔn)化細(xì)胞RNA的量。30%或更低的HCV RNA水平(相對(duì)于對(duì)照培養(yǎng)物)被認(rèn)為具有陽性抗病毒作用，50%或更低的b-肌動(dòng)蛋白R(shí)NA水平(相對(duì)于對(duì)照培養(yǎng)物)被認(rèn)為具有細(xì)胞毒性作用。用建立的中性紅染料攝取試驗(yàn)(Korba，B.E.和J. L. Gerin (1992)用標(biāo)準(zhǔn)化的細(xì)胞培養(yǎng)物試驗(yàn)來測(cè)定核苷類似物抗こ型肝炎病毒復(fù)制的活性(Antivir. Res. 19:55-70)。)測(cè)定細(xì)胞毒性。HCVa-wt shRNA 與 HCVa-mut shRNA 以及不相關(guān)的對(duì)照 shRNA (229)在 Huh7 細(xì)胞中對(duì)HCV復(fù)制子系統(tǒng)的抑制；劑量反應(yīng)。在穩(wěn)定復(fù)制HCV RNA-細(xì)胞系中測(cè)定測(cè)試復(fù)合物的抗病毒活性，所述HCV RNA-復(fù)制細(xì)胞系為由人類肝胚細(xì)胞瘤細(xì)胞系Huh7轉(zhuǎn)染衍生的AVA5(Blight等人，Science, 2000, 290:1972)。用DsRed表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染基于RNA的抑制劑，形成80%融合的培養(yǎng)物，并用斑點(diǎn)印跡雜交測(cè)定轉(zhuǎn)染后48小時(shí)HCV RNA的水平。在一式三份的培養(yǎng)物中進(jìn)行測(cè)定。將總共4-6個(gè)未經(jīng)處理的對(duì)照培養(yǎng)物，和用10、3和lIU/ml a -干擾素(無細(xì)胞毒性的抗病毒活性)處理的3份培養(yǎng)物，以及100、10和IuM利巴韋林(無抗病毒活性和細(xì)胞毒素)作為陽性抗病毒和毒性的對(duì)照物。用熒光顯微術(shù)(DsRed表達(dá))測(cè)定轉(zhuǎn)染的效率。按照未經(jīng)處理的培養(yǎng)物(總共6個(gè))中測(cè)定的RNA的平均水平的百分比，來確定三份處理的培養(yǎng)物中HCV和P -肌動(dòng)蛋白R(shí)NA兩者的水平。P -肌動(dòng)蛋白R(shí)NA的水平既用作毒性的尺度，又用來在每個(gè)樣品中標(biāo)準(zhǔn)化細(xì)胞RNA的量。30%或更低的HCV RNA的水平(相對(duì)于對(duì)照培養(yǎng)物)被認(rèn)為具有正的抗病毒作用，50%或更低的b-肌動(dòng)蛋白R(shí)NA的水平(相對(duì)于對(duì)照培養(yǎng)物)被認(rèn)為具有細(xì)胞毒素作用。用建立的中性紅色染料吸收試驗(yàn)(Antivir.Res. 19:55-70)測(cè)定細(xì)胞毒性。用標(biāo)準(zhǔn)化的細(xì)胞培養(yǎng)物試驗(yàn)來測(cè)定核苷類似物抗こ型肝炎病毒復(fù)制的活性(Korba等人，1992，上述)。實(shí)施例5 :對(duì)抑制組織培養(yǎng)細(xì)胞中HCV IRES依賴性基因表達(dá)的shRNA的鑒定研究體外轉(zhuǎn)錄的小發(fā)夾RNA (shRNA)抑制培養(yǎng)細(xì)胞中丙型肝炎病毒內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(HCV IRES)依賴性基因表達(dá)的能力。如上所述，發(fā)現(xiàn)靶向靠近AUG轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的HCV IRES 3’端的25個(gè)堿基對(duì)的shRNA HCVa-wt (表2)可以有效破壞HCV的表達(dá)。為了 測(cè)定共轉(zhuǎn)染的shRNA構(gòu)建體干擾IRES功能的能力，使用報(bào)道基因構(gòu)建體(pHCV雙螢光素酶質(zhì)粒)，其中螢火蟲螢光素酶(fLuc)的表達(dá)依賴于HCV IRES (圖I ;Wang等人，MoL Ther.，2005，12:562-568)。在這些實(shí)驗(yàn)中，培養(yǎng)293FT細(xì)胞，并用報(bào)道基因構(gòu)建體和HCVa-wt或其它受試序列之ー按照Wang等人，2005，上引文所述實(shí)施轉(zhuǎn)染。發(fā)現(xiàn)在InM濃度下，HCVa-wt導(dǎo)致293FT細(xì)胞中HCV IRES-依賴性螢光素酶表達(dá)受至Ij90%抑制(Wang等人，2005，同上引文)。在隨后的實(shí)驗(yàn)中，設(shè)計(jì)并測(cè)試了另外26個(gè)靶向HCVIRES的不同區(qū)域的shRNA(圖10、圖16A-B);26個(gè)中的3個(gè)為上文所述的副本(HCVb、HCVc、HCVd-wt)；23個(gè)為新序列，以鑒定HCV的其它抑制劑。目標(biāo)是要鑒定可用于與HCVa-wt聯(lián)合的shRNA，使得病毒更難于通過突變HCVa-wt靶位點(diǎn)而產(chǎn)生抗性，或鑒定可用作HCVa-wt的替代物的shRNA。選擇要測(cè)試的shRNA以避免在不同HCV基因型之間存在變化的區(qū)域。使用例如在jura. wi. mit. edu/bioc/siRNAext/可獲得的算法挑選了ー些受試序列，并且排除意在靶向HCV-IRES序列但由于其CG含量及其它特征而導(dǎo)致不被多數(shù)算法所推薦的其它受試序列，例如GC豐富的或高度結(jié)構(gòu)化的區(qū)域。使用I7RNA聚合酶由dsDNA模板體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生shRNA,并且為了促進(jìn)轉(zhuǎn)錄效率，shRNA從序列5’ -pppGGG開始。該5’序列形成兩個(gè)到三個(gè)核苷酸的突出端，確切長(zhǎng)度取決于靶位點(diǎn)在其5’末端是否包含一個(gè)或多個(gè)鳥苷殘基(參見圖16A-B)。如果與靶序列相配的RNA有義鏈的最后ー個(gè)核苷酸是‘G’，則只必須再加入兩個(gè)G以便有效轉(zhuǎn)錄，并且這些G在shRNA5’端上為單鏈，不與靶互補(bǔ)。如果與靶相配的shRNA有義鏈的最后ー個(gè)核苷酸不是G，那么為了在試驗(yàn)系統(tǒng)中有效轉(zhuǎn)錄，需要加入不與靶互補(bǔ)的三個(gè)G。所有在本組實(shí)驗(yàn)中測(cè)試的shRNA都具有長(zhǎng)21-25個(gè)堿基對(duì)的雙鏈體莖和如針對(duì)HCVa-wt所述的小RNA-23的10個(gè)核苷酸的環(huán)。按照Wang，2005所述來測(cè)定所有的shRNA (總共27個(gè)，包括HCVa-wt)的活性。簡(jiǎn)要地說，用PHCV雙螢光素酶■報(bào)道基因表達(dá)質(zhì)粒(Promega，Madison, WI)和用于控制轉(zhuǎn)染效率和可能的脫祀效應(yīng)(off-target effect)的分泌型堿性磷酸酶表達(dá)質(zhì)粒(pSEAP2,(101^6(*，]\10111^3111￥16￥，04)以及8111 應(yīng)，共轉(zhuǎn)染人 293 1'細(xì)胞。結(jié)果如圖 10所示。SEAP水平在所有樣品中是一致的，表明在InM到5nM的shRNA濃度下可以實(shí)現(xiàn)有效轉(zhuǎn)染且無非特異性抑制或毒性作用。大多數(shù)的shRNA僅僅表現(xiàn)中等活性(InM下小于60%抑制)。不遵循任何特定理論，該作用可能是由于IRES上的靶區(qū)域的高度結(jié)構(gòu)化所致。例外情況是HCVd-wt、sh37、sh39、hcvl7，其靶向靠近 HCVa-wt 位點(diǎn)的 IRES 位置。這些 shRNA 在 InM 濃度下導(dǎo)致HCV IRES依賴性基因表達(dá)受到85-90%抑制。選擇InM的低shRNA濃度以允許容易地鑒定到具有超高功能性的shRNA。如果在IOnM shRNA下進(jìn)行篩選，則更多shRNA將表現(xiàn)出高活性；然而，在一些情況下在該濃度下觀察到顯著的非特異性抑制。因此，本篩選揭示了 44個(gè)核苷酸的區(qū)域(HCV IRES上的331-374位)，其中5個(gè)重疊的shRNA顯示出高活性。實(shí)施例6 :單堿基錯(cuò)配對(duì)于shRNA活性的影響期望的是用于HCV的療法可以有效地抵抗突變的HCV。為了確定本文所述的RNA在這方面的性能(例如，靶向HCV IRES的shRNA)，以及為了闡明脫靶效應(yīng)是否構(gòu)成問題，測(cè)試指向HCV IRES的所選shRNA對(duì)靶序列中的點(diǎn)突變的敏感性。就這些實(shí)驗(yàn)而言，用QllikdUiIlge(K) n定點(diǎn)誘變?cè)噭┖?Stratagene，拉荷亞，加利福尼亞)將C340 — U突變引入HCV IRES中。所測(cè)試的27種shRNA中，九個(gè)靶向突變區(qū)(圖11)，因此其活性理論上會(huì) 受到這種突變的影響。用PHCV的突變形式分析了所有這些shRNA，并將靶向其它位點(diǎn)的所選shRNA用作對(duì)照。就所有受試的shRNA而言，都發(fā)現(xiàn)與原來完全匹配的靶相比，活性未受影響或稍微降低(圖10)。然而，在復(fù)制子系統(tǒng)中，驚奇地發(fā)現(xiàn)shRNA是SNP-敏感的(見下文)。實(shí)施例7 :靶位點(diǎn)的精細(xì)作圖設(shè)計(jì)六個(gè)短的19個(gè)堿基對(duì)的shRNA來靶向靠近HCV IRES 3’端的44個(gè)核苷酸的位點(diǎn)3個(gè)靶向核苷酸331-353，3個(gè)靶向核苷酸354-374。這些分子包含10個(gè)核苷酸的環(huán)和5’ -GG以及3’ -UU突出端。進(jìn)行篩選以鑒定在這些受試序列中最有效抑制HCV表達(dá)的非重疊候選物。所有6個(gè)受試的shRNA都能在測(cè)試系統(tǒng)中抑制活性。六個(gè)shRNA中的三個(gè)(sh52、sh53和sh54)被確認(rèn)為是最有效的(圖12)。這并不排除在組合物中使用效カ較低的那些shRNA，如用于治療HCV，例如作為包括超過ー種shRNA和/或siRNA的組合物的一部分。實(shí)施例8 :shRNA設(shè)計(jì)苯長(zhǎng)、環(huán)長(zhǎng)和序列以及3’端的影響進(jìn)行附加實(shí)驗(yàn)以測(cè)試shRNA設(shè)計(jì)如何影響基因沉默活性。HCVa-wt包含具有25個(gè)堿基對(duì)的莖和5’ -GG和3’ -UU突出端(其可形成非標(biāo)準(zhǔn)堿基對(duì))及10個(gè)核苷酸的miR-23環(huán)。為了測(cè)試在抑制表達(dá)的有效性上這些參數(shù)的重要性，分別改變每項(xiàng)參數(shù)(圖13A)。最初挑選小RNA-23環(huán)序列是因?yàn)樗亲匀淮嬖诘男蛄?Lagos-Quintana等人，Science, 2001,293:854-258)并因此不大可能有毒性。測(cè)試了 2個(gè)備選的10個(gè)核苷酸的環(huán)、以及6個(gè)核苷酸、5個(gè)核苷酸和4個(gè)核苷酸的環(huán)(每種有兩個(gè)序列版本)。發(fā)現(xiàn)環(huán)大小和序列都不影響這些25個(gè)堿基對(duì)的shRNA的活性(圖13B ;參見圖16A-B的序列)。缺少3’ -UU末端序列(單鏈突出端)的小發(fā)夾RNA與包含該特征的親代shRNA具有相同的效力。具有全長(zhǎng)(25個(gè)核苷酸)的有義鏈但短(13個(gè)核苷酸)的反義區(qū)的對(duì)照shRNA不具有活性，證實(shí)靶向序列中的雙鏈體結(jié)構(gòu)的重要性。具有3’ -CC而非3’ -UU末端的shRNA(允許形成2個(gè)附加的Watson-Crick堿基對(duì))與HCVa-wt相比在降低HCV表達(dá)方面更有效，但也影響了 SEAP的水平。該非特異性抑制可能是由更長(zhǎng)的莖(27個(gè)堿基對(duì))所致的結(jié)果，該較長(zhǎng)莖可能誘導(dǎo)干擾素反應(yīng)途徑的基因和活化蛋白激酶R (PKR)0令人驚訝的是，將該環(huán)移動(dòng)到shRNA的另一端，產(chǎn)生了活性的劇烈下降(InM下為15%而非90%抑制)。對(duì)該效應(yīng)的可能解釋包括Dicer加工位置(以及由此所靶向的序列)的移動(dòng)以及5’-末端處的不同GC含量。因?yàn)樽C實(shí)19個(gè)堿基對(duì)的shRNA顯示出與25個(gè)堿基對(duì)的shRNA有類似的效力，所以測(cè)定19個(gè)堿基對(duì)的shRNA的環(huán)變異的作用。結(jié)果如圖14所示；序列參見圖16A-B。測(cè)試了 10、6、5和4個(gè)核苷酸的環(huán)大小，每種有兩個(gè)序列版本。包含所有這些環(huán)大小的序列都顯示出抑制基因表達(dá)的能力。然而，與25個(gè)堿基對(duì)shRNA的結(jié)果相比，環(huán)大小的減少(尤其是低于5個(gè)核苷酸)導(dǎo)致19個(gè)堿基對(duì)shRNA在兩種受試環(huán)序列下均有降低的活性。具有至少5-6個(gè)核苷酸的環(huán)表現(xiàn)出最大活性。 3’ -UU的去除也導(dǎo)致19個(gè)堿基對(duì)以及20個(gè)堿基對(duì)(但并非25個(gè)堿基對(duì))的shRNA活性的劇烈下降。不遵照任何特定理論，3’ -UU和5’ -GG可形成非標(biāo)準(zhǔn)堿基對(duì)，并且shRNA雙鏈體的總長(zhǎng)度是重要的，因?yàn)闉榱擞行Ъ庸ぃp鏈體不能小于21個(gè)堿基對(duì)。因此，就25個(gè)堿基對(duì)的shRNA而言，環(huán)長(zhǎng)度或3’ -UU的存在都是無關(guān)緊要的，但是這些參數(shù)對(duì)短的(例如19個(gè)堿基對(duì)的)shRNA的效カ卻是重要的。不遵照任何特定理論，可能是在加工之前Dicer結(jié)合于末端并且如果是較長(zhǎng)shRNA的話將不會(huì)“感覺到”環(huán)，但在19個(gè)堿基對(duì)的shRNA的情況下，當(dāng)Dicer從末端“測(cè)量” 19-21個(gè)核苷酸時(shí)將會(huì)“感覺到”環(huán)。因此，發(fā)現(xiàn)19個(gè)堿基對(duì)的shRNA可如25個(gè)堿基對(duì)的shRNA和19個(gè)堿基對(duì)的siRNA一樣有效力。還發(fā)現(xiàn)ー些shRNA分子在0. I-InM的低濃度下具有活性(“超強(qiáng)效shRNA”。其它組典型地使用10-25-50-100nMsiRNA)。這些數(shù)據(jù)證明不包括3’ -UU并且有至少22個(gè)堿基對(duì)(例如23個(gè)堿基對(duì)、24個(gè)堿基對(duì)或25個(gè)堿基對(duì))的序列可適用于抑制HCV的表達(dá)。類似地,環(huán)的大小對(duì)至少22個(gè)堿基對(duì)長(zhǎng)度的shRNA而言并非關(guān)鍵的。實(shí)施例9 HCV復(fù)制子系統(tǒng)將ー些shRNA和siRNA抑制劑以及陰性對(duì)照用于轉(zhuǎn)染穩(wěn)定表達(dá)HCV亞基因組復(fù)制子(Blight等人，Science，2000，290:5498)的人類肝細(xì)胞(AVA5，Huh7細(xì)胞系的衍生物)，且確定HCV的表達(dá)量。測(cè)試各種濃度，并確定導(dǎo)致50%抑制(IC50或EC50)的RNA濃度。從兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)得到的IC50并列顯示于圖15中。結(jié)果與在293FT細(xì)胞中用fLuc/IRES系統(tǒng)獲得的數(shù)據(jù)一般相關(guān)，具有下列差異(I) 19個(gè)堿基對(duì)的shRNA在復(fù)制子系統(tǒng)中比19個(gè)堿基對(duì)的siRNA更有效力，而在報(bào)道基因系統(tǒng)中，19個(gè)堿基對(duì)的siRNA比shRNA更有效力；(2)具有點(diǎn)突變的shRNAHCVa-wt在復(fù)制子系統(tǒng)中并未表現(xiàn)出活性，而其在fLuc/IRES報(bào)道基因系統(tǒng)中是有效的；(3) —般而言，25個(gè)堿基對(duì)的siRNA與25個(gè)堿基對(duì)的shRNA與測(cè)試的其它19個(gè)堿基對(duì)的shRNA和siRNA相比具有較小的活性。一般而言，IRES與復(fù)制子系統(tǒng)可用于鑒定候選序列?？捎帽疚乃龅姆椒ê捅绢I(lǐng)域中已知的方法進(jìn)ー步測(cè)試用于確認(rèn)所選shRNA或siRNA的效カ(例如，抑制對(duì)象中的HCV表達(dá))的方法。其它的
具體實(shí)施例方式應(yīng)當(dāng)理解，盡管本發(fā)明已通過詳述進(jìn)行了描述，但上述描述用來舉例說明而非限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍由后附權(quán)利要求的范圍限定。其它方面、優(yōu)點(diǎn)和修改都在下列權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。
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權(quán)利要求
1.RNA序列，其組成為 a.第一RNA 序列，其中該第一 RNA 序列是 SEQ ID NO: 34,SEQ IDNO:35,SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO:37,SEQ ID NO:38,SEQ ID NO:39,SEQ ID NO:40,SEQ ID NO:41,SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ IDN0:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49,SEQ ID NO:50,SEQ ID NO:51,SEQ ID NO:52,SEQ IDN0:53、SEQ ID NO:54,SEQ ID NO:55, SEQ ID NO: 56或與前述序列有一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)核苷酸差異的序列； b.第二RNA序列，其與第一序列互補(bǔ)； c.位于第一和第二核酸序列之間的環(huán)序列，環(huán)序列由4-10個(gè)核苷酸組成；以及 d.任選地，兩個(gè)核苷酸的突出端。
2.權(quán)利要求I所述的RNA序列，其中第一RNA序列是SEQ ID NO: 34,SEQ ID NO: 35,SEQID NO:36,SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ IDNO:39,SEQ ID NO:40,SEQ ID NO:41,SEQID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQIDNO:48,SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50,SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52,SEQ ID NO:53,SEQID NO:54、SEQ ID NO:55 或 SEQ ID NO:56。
3.權(quán)利要求I所述的RNA序列，其中所述RNA序列包含至少一個(gè)修飾的核苷酸。
4.權(quán)利要求I所述的RNA序列，其中環(huán)序列為4個(gè)核苷酸、5個(gè)核苷酸、6個(gè)核苷酸、7個(gè)核苷酸、8個(gè)核苷酸、9個(gè)核苷酸、10個(gè)核苷酸或至少十個(gè)核苷酸。
5.包含由含有至少一個(gè)非核苷酸分子的環(huán)連接在一起的權(quán)利要求I所述的核酸序列和權(quán)利要求I所述序列的互補(bǔ)序列的shRNA。
6.包含權(quán)利要求4所述的核酸序列的shRNA，其中環(huán)位于shRNA的有義鏈的3’以及shRNA的互補(bǔ)反義鏈的5’。
7.包含權(quán)利要求4所述核酸序列的shRNA，其中環(huán)位于shRNA的反義鏈的3’以及shRNA的互補(bǔ)有義鏈的5’。
8.權(quán)利要求I所述的RNA序列，其中RNA序列包括兩個(gè)核苷酸的突出端，S卩，3’UU。
9.根據(jù)權(quán)利要求I到8的任一項(xiàng)所述的RNA序列，其中第一序列是SEQID NO: 33,SEQID NO:55 或 SEQ ID NO:56。
10.權(quán)利要求I所述的RNA序列，其中該序列是SEQID NO:57-79, SEQ ID NO: 12, SEQID NO: 16、SEQ ID NO: 17 或 SEQ ID NO: 18 中的任一項(xiàng)。
11.包含編碼權(quán)利要求I到10任一項(xiàng)所述的RNA的序列的DNA序列。
12.包含權(quán)利要求11所述DNA序列的表達(dá)載體。
13.包含權(quán)利要求11所述DNA序列的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。
14.權(quán)利要求13所述的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其中當(dāng)細(xì)胞被載體感染時(shí)，產(chǎn)生可表達(dá)權(quán)利要求I所述RNA序列的原病毒。
15.包含如權(quán)利要求I到10的任一項(xiàng)所述的RNA序列以及藥學(xué)上可接受的賦形劑的組合物。
16.—種組合物，其包含含有編碼權(quán)利要求I到10的任一項(xiàng)所述的RNA序列的序列的載體。
17.權(quán)利要求15所述的組合物，其包含至少兩種權(quán)利要求I所述的RNA序列。
18.抑制丙型肝炎病毒的表達(dá)或活性的方法，該方法包括a.提供能表達(dá)丙型肝炎病毒的細(xì)胞，以及 b.將該細(xì)胞與如權(quán)利要求I到10的任一項(xiàng)所述的RNA序列相接觸。
19.權(quán)利要求18所述的方法，其中細(xì)胞是哺乳動(dòng)物的。
20.權(quán)利要求18所述的方法，其中哺乳動(dòng)物是人。
21.權(quán)利要求18所述的方法，其中哺乳動(dòng)物是非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物。
22.權(quán)利要求18所述的方法，其中該細(xì)胞與至少兩種不同的權(quán)利要求I所述的RNA序列相接觸。
23.—種方法,包括 a.鑒定已感染或疑似感染丙型肝炎病毒的對(duì)象； b.向?qū)ο筇峁┲委熒嫌行Я康臋?quán)利要求15、16或17的任一項(xiàng)所述的組合物。
24.權(quán)利要求23所述的方法，還包括在(b)之后確定對(duì)象的病毒載量是否降低。
25.權(quán)利要求23所述的方法，還包括在(b)之后確定對(duì)象中至少一種病毒蛋白或病毒核酸序列是否降低。
26.—種抑制病毒中基因表達(dá)的方法,該方法包括將小干擾RNA引入包含病毒的細(xì)胞中，其中小干擾RNA包含與病毒的多核苷酸序列至少部分互補(bǔ)的序列，其中該小干擾RNA的所述至少部分互補(bǔ)序列與該病毒的所述多核苷酸序列相互作用導(dǎo)致病毒中的基因表達(dá)受到抑制。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中小干擾RNA是shRNA。
28.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中小干擾RNA是siRNA。
29.根據(jù)權(quán)利要求26-28的任一項(xiàng)所述的方法，其中小干擾RNA識(shí)別大約19到大約30個(gè)核苷酸的病毒序列。
30.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中病毒是丙型肝炎病毒。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中小干擾RNA與丙型肝炎病毒的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)序列內(nèi)的序列相互作用。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中IRES序列包含如SEQID NO : 11所述的序列。
33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中小干擾RNA識(shí)別SEQID NO :26所述區(qū)域內(nèi)大約19個(gè)到大約30個(gè)核苷酸的序列。
34.根據(jù)權(quán)利要求30-33的任一項(xiàng)所述的方法，其中小干擾RNA是shRNA。
35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中shRNA包含選自由SEQIDNO :12、SEQ ID NO 17、SEQ ID NO 18, SEQ ID NO 27, SEQ IDNO :32 和 SEQ ID NO :33 組成的組的序列。
36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中shRNA具有如SEQID NO 12所述的序列。
37.根據(jù)權(quán)利要求30-33的任一項(xiàng)所述的方法，其中小干擾RNA是siRNA。
38.根據(jù)權(quán)利要求37所述的方法，其中siRNA包含選自由SEQID NO: 19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :22、SEQ ID NO :23、SEQ ID NO :24、SEQ ID NO :25、SEQ IDNO :27、SEQ ID NO 32 和 SEQ ID NO 33 組成的組的序列。
39.一種治療哺乳動(dòng)物中病毒感染的方法，所述方法包括給予哺乳動(dòng)物包含治療上有效量的小干擾RNA的組合物，所述小干擾RNA包含與病毒的多核苷酸序列至少部分地互補(bǔ)的序列，其中所述小干擾RNA的至少部分互補(bǔ)序列與所述病毒的多核苷酸序列相互作用導(dǎo)致病毒中基因表達(dá)受到抑制。
40.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中小干擾RNA是shRNA。
41.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中小干擾RNA是siRNA。
42.根據(jù)權(quán)利要求39-41的任一項(xiàng)所述的方法，其中小干擾RNA識(shí)別大約19到大約30個(gè)核苷酸的病毒序列。
43.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是人并且病毒感染包含丙型肝炎病毒。
44.根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法，其中小干擾RNA包含與丙型肝炎病毒的IRES序列內(nèi)的多核苷酸序列至少部分互補(bǔ)的序列。
45.根據(jù)權(quán)利要求44所述的方法，其中IRES序列包含如SEQID ΝΟ:11所述的序列。
46.根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，其中小干擾RNA結(jié)合并識(shí)別如SEQIDNO 26所述的區(qū)域內(nèi)的大約19到大約30個(gè)核苷酸的序列。
47.根據(jù)權(quán)利要求43-46的任一項(xiàng)所述的方法，其中小干擾RNA是shRNA。
48.根據(jù)權(quán)利要求47所述的方法，其中shRNA包含選自由SEQIDNO :12、SEQ ID NO 17,SEQ ID NO 18, SEQ ID NO 19, SEQ IDNO 20, SEQ ID NO 2USEQ ID NO 22, SEQ ID NO:23、SEQ IDNO :24 和 SEQ ID NO :25、SEQ ID NO :27、SEQ ID NO 32 以及 SEQID NO 33 組成的組的序列。
49.根據(jù)權(quán)利要求48所述的方法，其中shRNA具有如SEQID NO: 12所述的序列。
50.根據(jù)權(quán)利要求43-46的任一項(xiàng)所述的方法，其中小干擾RNA是siRNA。
51.根據(jù)權(quán)利要求50所述的方法，其中siRNA包含選自由SEQID NO 19, SEQ ID NO:20,SEQ ID NO 2USEQ ID NO :22、SEQ ID NO :23、SEQ ID NO :24 和 SEQ ID NO :25、SEQ IDNO 27, SEQ ID NO :32以及SEQ ID NO :33組成的組的序列。
52.一種組合物，其含有shRNA，所述shRNA包含選自由SEQ ID NO 12,SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO 18, SEQ ID NO 19, SEQ ID NO 20, SEQ ID NO 2U SEQ ID NO 22, SEQ ID NO:23、SEQ ID NO 24, SEQ ID NO 25, SEQ ID NO 27, SEQ ID NO 32 以及 SEQ ID NO :33 組成的組的序列。
53.一種組合物，其含有siRNA，所述siRNA包含選自由SEQ ID NO : 19、SEQ ID NO :20、SEQ ID NO 2USEQ ID NO :22、SEQ ID NO :23、SEQ ID NO :24、SEQ ID NO :25 和 SEQ ID NO:27、SEQ ID NO 32以及SEQ ID NO 33組成的組的序列。
54.一種藥物組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求52所述的shRNA和藥學(xué)上可接受的賦形劑。
55.一種藥物組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求53所述的siRNA和藥學(xué)上可接受的賦形劑。
56.一種試劑盒，其包含shRNA和用于根據(jù)權(quán)利要求26、30-33、39、43-46和18-25的任一項(xiàng)所述的方法的說明書。
57.根據(jù)權(quán)利要求56所述的試劑盒，其中shRNA包含選自由SEQIDNO 12, SEQ ID NO:17、SEQ ID NO :18、SEQ ID NO :19、SEQ IDNO :20、SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :22、SEQ IDNO :23、SEQ IDNO :24、SEQ ID NO :25、SEQ ID NO :27、SEQ ID NO 32 以及 SEQID NO 33 組成的組的序列。
58.一種試劑盒，其包含siRNA和用于根據(jù)權(quán)利要求25、29-32、38和42-45的任一項(xiàng)所述的方法的說明書。
59.根據(jù)權(quán)利要求58所述的試劑盒，其中siRNA包含選自由SEQIDNO : 19、SEQ ID NO:`20、SEQ ID NO 2USEQ ID NO 22, SEQ IDNO 23, SEQ ID NO 24, SEQ ID NO :25 和 SEQ IDNO 27, SEQ IDNO :32以及SEQ ID NO :33組成的組的序列。
60.根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法，其中丙型肝炎病毒是基因型la。
61.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中哺乳動(dòng)物是人。
全文摘要
本發(fā)明提供包含可用于抑制病毒介導(dǎo)的基因表達(dá)的小干擾RNA(shRNA或siRNA)的方法、組合物和試劑盒。如本文所述的小干擾RNA可用于治療HCV感染的方法中。本發(fā)明描述了靶向HCV的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)序列的shRNA和siRNA構(gòu)建體。
文檔編號(hào)C12N15/63GK102827841SQ20121027734
公開日2012年12月19日 申請(qǐng)日期2006年6月1日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月12日
發(fā)明者R·L·卡斯帕爾, H·伊爾韋斯, A·A·塞伊汗, A·V·弗拉索夫, B·H·約翰斯頓 申請(qǐng)人:索馬根尼科斯公司