一種新型的低溫脂肪酶的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種新型低溫脂肪酶，提供了該低溫脂肪酶的基因序列，經(jīng)過對該低溫脂肪酶的提取、分離純化及酶學性質(zhì)的研究確定了該低溫脂肪酶的酶學性質(zhì)：最適溫度為30℃，在0℃仍具有65％的相對酶活；最適PH＝10.0，且在pH＝3.0-10.5范圍內(nèi)穩(wěn)定性較好；60℃下保溫40min，仍有65％剩余酶活，熱穩(wěn)定性好；蛋白分子量為36kDa；最適作用底物為p-NPB等等，是一種新的低溫脂肪酶，可廣泛應(yīng)用于洗滌劑、食品工業(yè)、造紙、醫(yī)藥、皮革及環(huán)境保護領(lǐng)域。同時還提供了該低溫脂肪酶的發(fā)酵制備方法和發(fā)酵菌種的16S?rRNA基因序列，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。
【專利說明】ー種新型的低溫脂肪酶
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明提供了ー種新型低溫脂肪酶，提供了該低溫脂肪酶的基因序列，經(jīng)過對該低溫脂肪酶的提取、分離純化及酶學性質(zhì)的研究確定了該低溫脂肪酶的酶學性質(zhì):最適溫度為30°C，在(TC仍具有65%的相對酶活；最適PH = 10.0，且在pH = 3.0-10.5范圍內(nèi)穩(wěn)定性較好；60°C下保溫40min,仍有65%剩余酶活,熱穩(wěn)定性好；蛋白分子量為36kDa ;最適作用底物為P-NPB等等，是ー種新的低溫脂肪酶，可廣泛應(yīng)用于洗滌劑、食品エ業(yè)、造紙、醫(yī)藥、皮革及環(huán)境保護領(lǐng)域。同時還提供了該低溫脂肪酶的發(fā)酵制備方法和發(fā)酵菌種的16SrRNA基因序列，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]脂肪酶(lipase, EC3.1.1.3)又稱甘油三酰酯甘油水解酶(triacylglycerolacylhyrolase),能在油-水界面上催化其水不溶性的天然底物甘油三酰酯水解為脂肪酸和甘油[1]。在微水環(huán)境下，脂肪酶具有獨特的性能，其催化反應(yīng)具有可逆性，包括甘油酯及水不溶性酯類的水解、醇解、酸解以及酯化等反應(yīng)。除了能分解脂肪外，脂肪酶還可催化其它酯水解的能力，因此脂肪酶具有底物多祥性的同時又具有高度立體異構(gòu)專一性和化學選擇性。
[0003]脂肪酶廣泛存在于自然界中，動、植物和微生物都能產(chǎn)生脂肪酶。按其作用pH的不同，可以將脂肪酶分為酸性、中性、堿性脂肪酶；而按其作用溫度的高低則可以分為低溫脂肪酶(cold-active lipase)、中溫脂肪酶和高溫脂肪酶。微生物脂肪酶是生物技術(shù)中應(yīng)用酶類的重要組成部分，是繼蛋白酶、糖化酶的第三大商業(yè)用酶，已被廣泛應(yīng)用于洗滌劑、食品エ業(yè)、造紙、醫(yī)藥、皮革等方面。
[0004]在相繼開發(fā)出中溫脂肪酶、中高溫堿性脂肪酶等的基礎(chǔ)上，低溫脂肪酶的研究和應(yīng)用也引起了廣泛關(guān)注。同中高溫脂`肪酶相比，低溫脂肪酶在低溫下具有良好的催化活性和低溫適應(yīng)性。根據(jù)Margesin等人的定義,`把酶最適反應(yīng)溫度在30°C左右，0°C時仍有一定催化活性的脂肪酶稱為低溫脂肪酶，在最適反應(yīng)溫度下此類酶活性與其在0°C時活性的比值一般小于80。由于低溫脂肪酶在低溫環(huán)境下具有高催化活性而其活化能和反應(yīng)最適溫度較低，有利于節(jié)約能源和防止產(chǎn)物結(jié)構(gòu)破壞，因此對于環(huán)境保護也有一定意義，所以生產(chǎn)和應(yīng)用低溫脂肪酶在某些領(lǐng)域中有著中高溫脂肪酶不可比擬的優(yōu)越性，具有廣闊的應(yīng)用前景，我們就是在這樣的思想指導下，積極地研究和挖掘新的低溫脂肪酶，經(jīng)過多次的試驗成功獲得ー種新的低溫脂肪酶。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明提供了ー種新型的低溫脂肪酶，提供了該低溫脂肪酶的基因序列并對該脂肪酶酶學性質(zhì)研究確定:該脂肪酶的最適PH= 10.0，且在pH = 3.0-10.5范圍內(nèi)穩(wěn)定性較好；最適溫度為30°C，在0°C仍具有65%的相對酶活，60°C下保溫40min，仍有60%剩余酶活，熱穩(wěn)定性好，具有一定的耐醇性；Na+、Mg2+對脂肪酶的活力有明顯的促進作用，Cu2+和Zn2+對脂肪酶的活力有明顯的抑制作用；非離子型表面活性劑Tween-40和Tween-60對脂肪酶活性有顯著的的激活作用，Tween-80對脂肪酶的活性有一定的抑制作用；最適作用底物為 P-NPB5Kni 值為 0.120mmol/L,Vmax 為 400U/mg，Kcat 為 240 S^1 ;蛋白分子量為 36kDa，是一種新的低溫脂肪酶。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案:用我們自己篩選得到的ー株產(chǎn)脂肪酶的野生菌種，進行種子培養(yǎng)和發(fā)酵產(chǎn)酶得到粗酶液，將粗酶液通過雙水相系統(tǒng)、DEAE-cellulos52和SephadexG-75分子篩層析純化得到的該低溫脂肪酶進行酶學性質(zhì)研究；經(jīng)PCR擴增得到該低溫脂肪酶基因，與Burkholderia相應(yīng)基因具有很高同源性，該低溫脂肪酶基因全長1095bp，可編碼364個氨基酸殘基；此克隆序列的氨基酸殘基129-133處為脂肪酶的高度保守區(qū)域即活性中心序列GXSXG ;脂肪酶蛋白N端存在信號肽序列。エ藝為:
[0007]1、脂肪酶的提取、分離純化過程及酶學性質(zhì)研究
[0008]發(fā)酵液制備一真空冷凍干燥一雙水相萃取一透析脫鹽一DEAE-cellulose離子交換層析一透析脫鹽一Sephadex G-75 — SDS-PAGE鑒定。
[0009]1.1雙水相萃取
[0010]配制質(zhì)量分數(shù)為40%磷酸鹽溶液，4°C冰箱中保存?zhèn)溆?。磷酸鹽由K2HPO4和NaH2PO4組成，調(diào)節(jié)二者比例得到所需的pH。按重量配制雙水相萃取體系，以20g為萃取體系總質(zhì)量，取凍干酶粉4g，用少量蒸餾水溶解。按照比例稱取一定量的醇類溶液和磷酸鹽溶液，質(zhì)量不足部分以水補足。l，500g離心5min使其充分分相。分別測定上下相的脂肪酶活力和總蛋白含量以及上下相的體積，按以下公式計算:相比R =上相體積/下相體積；分配系數(shù)K =上相脂肪酶比活力/下相脂肪酶比活力；萃取率S = RKバ1+RK)。
[0011]1.2 DEAE-cellulose 離子交換層析
[0012]雙水相萃取得到的上相溶液，經(jīng)透析以備上樣。將裝填有DEAE-cellulose陰離子交換介質(zhì)的層析柱(1.6CmX30Cm)首先用pH 7.2,20mmol/L Tris-HCl緩沖液平衡，直至流出液PH值達到7.2。將上述透析液過0.45 ii m膜，以2mL/min的流速上樣，上樣量為10mL。上樣完全后，用相同的緩沖液洗脫1.5個柱體積，沒有吸附上的蛋白即被洗脫出來，吸附上的蛋白則改用含lmol/L NaCl的20mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 7.2)進行線性洗脫，流速為2mL/min。收集脂肪酶酶活力高的洗脫液，透析，4°C貯存?zhèn)溆谩?br> [0013]1.3Sephadex G-75 分子篩層析
[0014]將Sephadex G-75 分子篩層析柱(1.6cm X 60cm)首先用 pH 7.2, 20mmol/LTris-HCl緩沖液平衡，然后取2mL樣品上柱，用相同的緩沖液洗脫，流速為0.5mL/min。收集酶活高的部分，濃縮，4°C保藏備用。
[0015]1.4蛋白及同エ酶電泳圖譜
[0016]SDS-PAGE濃縮膠濃度5 %，分離膠濃度12 %，考馬斯亮藍R-250染色，根據(jù)標準蛋白分子量曲線求得脂肪酶的分子量大小。
[0017]Native-PAGE:濃縮膠5%，分離膠12%，._SDS，電泳后，若考察發(fā)酵液中的蛋白質(zhì)數(shù)量，則用考馬斯 亮藍R-250染色；若考察同エ酶酶譜，染色采用改良后的脂肪酶經(jīng)典染色法:溶液A:200mg a -こ酸萘酯、200mg & -こ酸萘酯分別溶于IOmL丙酮，混合后加入pH7.0的Tris-HCl緩沖液定容至200mL。溶液B:5g鐵氰化鉀溶于IOOmL pH7.0的Tris-HCl緩沖液。將膠置于溶液A中，30°C染色15min后轉(zhuǎn)移至溶液B復染。[0018]1.5pH值對脂肪酶的影響
[0019]分別將酶液置于pH 6.5-10.5的lOOmmol/L緩沖液中，測定脂肪酶活力，考察脂肪酶最適反應(yīng)pH值。將酶液分別加入到pH 3.0-10.0的100mmol/L緩沖液中，4°C放置24h，以未處理酶液的活力計為100%，計算相對活力，考察脂肪酶的pH穩(wěn)定性。
[0020]1.6溫度對脂肪酶的影響
[0021]純酶分別在不同溫度(0_70°C )下，測定脂肪酶活力，考察脂肪酶的最適反應(yīng)溫度。將一定量的酶液溶解于20mmol/L，pH 8.5的Tris-HCl緩沖液，分別放置在40_70°C下保溫，在最適溫度下定期測定其殘余酶活，以未保溫酶液的酶活計為100%，計算相對酶活，考察脂肪酶的熱穩(wěn)定性。
[0022]1.7金屬離子對脂肪酶的影響
[0023]在酶溶液中分別添加不同的金屬離子，使其終濃度分別為I，5，IOmmoI/L，30°C保溫IOmin后，測定脂肪酶活力，以未添加金屬離子的酶液活力為100%，計算相對酶活。
[0024]1.8有機溶劑對脂肪酶的影響
[0025]在酶溶液中分別添加0-50% (v/v)的有機溶劑，測定不同濃度下有機溶劑對脂肪酶活力的影響，以未添加有機溶劑的酶液活力為100%，計算相對酶活。
[0026]1.9表面活性劑對脂肪酶的影響
[0027]在酶溶液中分別添加不同的表面活性劑，使其終濃度分別為0.1,0.3,0.5%,30°C保溫30min后，測定脂肪酶活力，以未添加金屬離子的酶液活力為100%，計算相對酶活。
[0028]1.10脂肪酶動力學研究
[0029]在底物p-NPB濃度分別為0.1,0.2,0.4,0.6,0.8、或1.0mmol/L條件下下測定脂肪酶活力。采用Lineweaver-Burk (雙倒數(shù))作圖法,求出脂肪酶動力學常數(shù)Km和Vmax,以及催化常數(shù)Kcat。
[0030]1.11脂肪酶對不同底物的水解能力
[0031 ] 分別以p-NPB，p-NPA, p-NPC, p-NPP為底物測定純化后脂肪酶的酶活以確定對不同長度碳鏈脂肪酸的水解能力。
[0032]2、低溫脂肪酶基因的克隆及序列分析
[0033]2.1.引物設(shè)計
[0034]LIPF:ATGGTCAGAT CGATGCGTTC CAG
[0035]LIPR:CTGAAA ACGGAGGGCG TGTAG
[0036]2.2低溫脂肪酶基因克隆
[0037]以基因組DNA為模板，LIPF和LIPR為上下游引物進行擴增。
[0038]25 ii L 的 PCR 反應(yīng)體系含有:DNA 模板 I y L，dNTP 2 y L，引物 LIPFl y L，引物 LIPRI u L, 10XPCR buffer 2.5 u L, Taq 酶 0.5 y L，ddH20 17 y し
[0039]PCR 擴增條件為:94°C 4min, (94°C 30s，55°C 30s.,72°C 90s)共進行 30 個循環(huán)，16°C保存。
[0040]2.3脂肪酶基因序列的測定及分析
[0041]將經(jīng)過PCR擴增的低溫脂肪酶基因進行DNA序列測定，得到低溫脂肪酶的基因序列，利用DNAMAN6.0軟件對序列進行拼接和分析，將DNA測序的拼接結(jié)果以及推導的氨基酸序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行Blast比對。[0042]根據(jù)對脂肪酶酶學性質(zhì)的研究及對脂肪酶基因序列的測定的分析，確定為ー種新的低溫脂肪酶。
[0043]本發(fā)明的有益效果:
[0044]首先提供了ー種新型的低溫脂肪酶，該低溫脂肪酶與已發(fā)現(xiàn)的低溫脂肪酶相比較具有如下特點:
[0045]1、熱穩(wěn)定性好。在40°C下保溫60min仍能保持70%的酶活，60°C下保溫40min，仍有60%剩余酶活。
[0046]2、具有一定的耐醇性在異丙醇濃度為12.5%時，脂肪酶分配系數(shù)和萃取率達到最大?
[0047]3、該酶在較寬的pH范圍內(nèi)pH(3.0-10.5)穩(wěn)定性較好，適用PH范圍廣。
[0048]4、粗酶性質(zhì)穩(wěn)定。
[0049]5、低溫環(huán)境下具有高催化活性，在0 °C時酶活仍有最大值的60 %左右，有廣闊的應(yīng)用前景。
[0050]由于低溫脂肪酶在低溫環(huán)境下具有高催化活性而其活化能和反應(yīng)最適溫度較低，有利于節(jié)約能源和防止產(chǎn)物結(jié)構(gòu)破壞，因而在エ業(yè)應(yīng)用上具有廣闊的前景，同時對于環(huán)境保護也有一定意義。低溫脂肪酶的催化特性是近年來酶學研究的ー個熱點，其生物適冷機制、新菌種的收集鑒定與菌種系統(tǒng)發(fā)育分析以及新型生物活性物質(zhì)的研究開發(fā)等方面也受到世界各國的重視。因此本發(fā)明ー種新型的低溫脂肪酶將有廣泛的エ業(yè)使用價值和較顯著的經(jīng)濟效益前景。
【具體實施方式】
[0051]實施例1
[0052]1、低溫脂肪酶的提取、分離純化及酶學性質(zhì):
[0053]1.1發(fā)酵液于4°C 10，800g離心20min，取上清液，即胞外脂肪酶粗酶液，經(jīng)真空冷凍干燥制成粗酶粉，4°C冰箱保存。
[0054]1.2發(fā)酵液蛋白含量的測定采用Bradford檢測法。在試管中加入0.1mL酶液，對照為IOOii L雙蒸水替代相應(yīng)的酶液，再加入4mL 0.01 %考馬斯亮藍G-250溶液，振蕩搖勻。5min后測定595nm處吸光度。測量在Ih內(nèi)完成。
[0055]1.3脂肪酶活性測定:以對硝基苯丁酸酯(p-NPB)為底物。將3.7mL 0.lmol/LTris-HCl (pH 9.0)緩沖液和 0.2mL IOmmoI/L p-NPB 組成的反應(yīng)體系，30°C保溫 15min 后加入0.1mL酶液,在405nm下測定吸光值。以Imin內(nèi)催化產(chǎn)生Iiimol的對硝基酹(￡ =1.86 X IO4CnT1XM-1)所需的酶量為I個酶活力單位(U)。
[0056]1.4脂肪酶酶的提取及分離純化過程
[0057]發(fā)酵液制備一真空冷凍干燥一雙水相萃取一透析脫鹽一DEAE-cellulose離子交換層析一透析脫鹽一Sephadex G-75 — SDS-PAGE鑒定。
[0058]1.4.1雙水相萃取
[0059]配制質(zhì)量分數(shù)為40%磷酸鹽溶液，4°C冰箱中保存?zhèn)溆?。磷酸鹽由K2HPO4和NaH2PO4組成，調(diào)節(jié)二者比例得到所需的pH。按重量配制雙水相萃取體系，以20g為萃取體系總質(zhì)量，取凍干酶粉4g，用少量蒸餾水溶解。按照比例稱取一定量的醇類溶液和磷酸鹽溶液，質(zhì)量不足部分以水補足。l，500g離心5min使其充分分相。分別測定上下相的脂肪酶活力和總蛋白含量以及上下相的體積，按以下公式計算:相比R =上相體積/下相體積；分配系數(shù)K =上相脂肪酶比活力/下相脂肪酶比活力；萃取率S = RKバ1+RK)。
[0060]1.4.2DEAE_celIulose 離子交換層析
[0061]雙水相萃取得到的上相溶液，經(jīng)透析以備上樣。將裝填有DEAE-cellulose陰離子交換介質(zhì)的層析柱(1.6CmX30Cm)首先用pH 7.2,20mmol/L Tris-HCl緩沖液平衡，直至流出液PH值達到7.2。將上述透析液過0.45 ii m膜，以2mL/min的流速上樣，上樣量為10mL。上樣完全后，用相同的緩沖液洗脫1.5個柱體積，沒有吸附上的蛋白即被洗脫出來，吸附上的蛋白則改用含lmol/LNaCl的20mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 7.2)進行線性洗脫，流速為2mL/min。收集脂肪酶酶活力高的洗脫液，透析，4°C貯存?zhèn)溆谩?br> [0062]1.4.3Sephadex G-75 分子篩層析
[0063]將Sephadex G-75 分子篩層析柱(1.6cm X 60cm)首先用 pH 7.2, 20mmol/LTris-HCl緩沖液平衡，然后取2mL樣品上柱，用相同的緩沖液洗脫，流速為0.5mL/min。收集酶活高的部分，濃縮，4°C保藏備用。
[0064]1.4.4蛋白及同エ酶電泳圖譜
[0065]SDS-PAGE濃縮膠濃度5 %，分離膠濃度12 %，考馬斯亮藍R-250染色，根據(jù)標準蛋白分子量曲線求得脂肪酶的分子量大小。
[0066]Native-PAGE:濃縮膠5%，分離膠12%，._SDS，電泳后，若考察發(fā)酵液中的蛋白質(zhì)數(shù)量，則用考馬斯亮藍R-250染色；若考察同エ酶酶譜，染色采用改良后的脂肪酶經(jīng)典染色法:溶液A:200mg a -こ酸萘酯、200mg & -こ酸萘酯分別溶于IOmL丙酮，混合后加入pH7.0的Tris-HCl緩沖液定容至200mL。溶液B:5g鐵氰化鉀溶于IOOmL pH7.0的Tris-HCl緩沖液。將膠置于溶液A中，30°C染色15min后轉(zhuǎn)移至溶液B復染。
[0067]L 5pH值對脂肪酶的影響
[0068]分別將酶液置于pH 6.5-10.5的lOOmmol/L緩沖液中，測定脂肪酶活力，考察脂肪酶最適反應(yīng)pH值。將酶液分別加入到pH 3.0-10.0的100mmol/L緩沖液中，4°C放置24h，以未處理酶液的活力計為100%，計算相對活力，考察脂肪酶的pH穩(wěn)定性。
[0069]1.6溫度對脂肪酶的影響
[0070]純酶分別在不同溫度(0_70°C )下，測定脂肪酶活力，考察脂肪酶的最適反應(yīng)溫度。將一定量的酶液溶解于20mmol/L，pH 8.5的Tris-HCl緩沖液，分別放置在40_70°C下保溫，在最適溫度下定期測定其殘余酶活，以未保溫酶液的酶活計為100%，計算相對酶活，考察脂肪酶的熱穩(wěn)定性。
[0071]1.7金屬離子對脂肪酶的影響
[0072]在酶溶液中分別添加不同的金屬離子，使其終濃度分別為I，5，IOmmoI/L，30°C保溫IOmin后，測定脂肪酶活力，以未添加金屬離子的酶液活力為100%，計算相對酶活。
[0073]1.8有機溶劑對脂肪酶的影響
[0074]在酶溶液中分別添加0-50% (v/v)的有機溶劑，測定不同濃度下有機溶劑對脂肪酶活力的影響，以未添加有機溶劑的酶液活力為100%，計算相對酶活。
[0075]1.9表面活性劑對脂肪酶的影響
[0076]在酶溶液中分別添加不同的表面活性劑，使其終濃度分別為0.1,0.3,0.5%,30°C保溫30min后，測定脂肪酶活力，以未添加金屬離子的酶液活力為100%，計算相對酶活。
[0077]1.10脂肪酶動力學研究
[0078]在底物p-NPB濃度分別為0.1,0.2,0.4,0.6,0.8、或1.0mmol/L條件下下測定脂肪酶活力。采用Lineweaver-Burk (雙倒數(shù))作圖法,求出脂肪酶動力學常數(shù)Km和Vmax,以及催化常數(shù)Kcat。
[0079]1.11脂肪酶對不同底物的水解能力
[0080]分別以p-NPB，p-NPA, p-NPC, p-NPP為底物測定純化后脂肪酶的酶活以確定對不同長度碳鏈脂肪酸的水解能力。
[0081]經(jīng)過上述實驗、比較、分析，我們確定新型的低溫脂肪酶的酶學性質(zhì)如下:
[0082]1、分子量為 36kDa。
[0083]2、最適pH為10.0，屬于堿性脂肪酶。其中:
[0084]2.1PH對酶活性的影響表現(xiàn)為pH 10.5時仍保有pH 10.0時90%的酶活；pH8.0時的酶活僅為pH 10.0時的20%。
[0085]2.2PH對酶穩(wěn)定性的影響則在pH 3.0-10.5的范圍內(nèi)均表現(xiàn)比較穩(wěn)定，pH適應(yīng)范
圍比較廣。
[0086]3、該脂肪酶酶活在0_30°C之間隨著溫度的增加而增加,在30°C時達到最大。此外，在0°C時酶活仍有最大值的65%左右，屬于低溫脂肪酶。在70°C還保持50%左右的酶活。
`[0087]4、Na+、Mg2+對脂肪酶的活力有明顯的促進作用，在IOmmoI/L金屬鹽離
[0088]子濃度時，可提高近一倍的酶活力；Cu2+和Zn2+對脂肪酶的活力有明顯的抑制作用。
[0089]5、非離子型表面活性劑Tween-40和Tween-60對脂肪酶活性有顯著的的激活作用Jween-SO對脂肪酶的活性有一定的抑制作用；其他表面活性劑對脂肪酶的催化活性改善作用不明顯。
[0090]6、低濃度こ醚、異戊醇及正丁醇能刺激酶活的升高，隨濃度的升高，產(chǎn)生抑制的影響，仍能但酶活仍能保持90%以上；2_丁酮、丙酮對脂肪酶酶活有很強的抑制作用?？梢钥闯鲈撝久笇θ鯓O性有機溶劑有較好的耐受性。
[0091]7、脂肪酶的 Km 值為 0.120mmol/L，最大反應(yīng)速度 Vmax 為 400U/mg，Kcat 為 240S—1。
[0092]8、脂肪酶對底物p-NPB，p-NPA, p-NPC, p-NPP表現(xiàn)出不同的水解能力；以p_NPB、P-NPC(C4-C8)為底物測定時表現(xiàn)較高的酶活，而以P-NPA(C2)和P-NPP(C16)為底物測定吋，酶活較低，可見該脂肪酶對中長鏈脂肪的水解能力較強。
[0093]2、低溫脂肪酶基因的克隆、表達及序列分析
[0094]2.1.引物設(shè)計
[0095]LIPF:ATGGTCAGAT CGATGCGTTC CAG
[0096]LIPR:CTGAAA ACGGAGGGCG TGTAG
[0097]2.2低溫脂肪酶基因克隆
[0098]以基因組DNA為模板，LIPF和LIPR為上下游引物進行擴增。
[0099]25 ii L 的 PCR 反應(yīng)體系含有:DNA 模板 I u L，dNTP 2 y L，引物 LIPFl y L，引物 LIPRI u L, IOXPCR buffer 2.5 u L, Taq 酶 0.5 y L，ddH20 17 y し[0100]PCR 擴增條件為:94°C 4min, (94°C 30s, 55°C 30s.,72°C 90s)共進行 30 個循環(huán)，16°C保存。
[0101]2.3脂肪酶基因序列的測定及分析
[0102]將經(jīng)過PCR擴增的低溫脂肪酶基因進行DNA序列測定，得到低溫脂肪酶的基因序列(見序列表)，利用DNAMAN6.0軟件對序列進行拼接和分析，將DNA測序的拼接結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行Blast比對。
[0103] 根據(jù)對脂肪酶酶學性質(zhì)的研究及對脂肪酶基因序列的測定的分析，確定為ー種新的低溫脂肪酶。
【權(quán)利要求】
1.ー種新型的低溫脂肪酶，具有如下的酶學特征: ，1.1分子量為36kDa ； ，1.2最適pH為10.0，屬于堿性脂肪酶；其中: ， 1.2.1PH對酶活性的影響表現(xiàn)為pH 10.5時仍保有pH 10.0時90%的酶活；pH 8.0時的酶活僅為PH 10.0時的20% ； ，1.2.2PH對酶穩(wěn)定性的影響則在pH 3.0-10.5的范圍內(nèi)均表現(xiàn)比較穩(wěn)定，pH適應(yīng)范圍比較廣； ，1.3該脂肪酶酶活在0-30°C之間隨著溫度的增加而增加，在30°C時達到最大。此外，在0°C時酶活仍有最大值的60%左右， 屬于低溫脂肪酶。在70°C還保持50%左右的酶活；1.4Na+、Mg2+對脂肪酶的活力有明顯的促進作用，在lOmmol/L金屬鹽離子濃度時，可提高近一倍的酶活力；Cu2+和Zn2+對脂肪酶的活力有明顯的抑制作用； ，1.5非離子型表面活性劑Tween-40和Tween-60對脂肪酶活性有顯著的的激活作用；Tween-80對脂肪酶的活性有一定的抑制作用；其他表面活性劑對脂肪酶的催化活性改善作用不明顯； ， 1.6低濃度こ醚、異戊醇及正丁醇能刺激酶活的升高，隨濃度的升高，產(chǎn)生抑制的影響，仍能但酶活仍能保持90%以上；2_ 丁酮、丙酮對脂肪酶酶活有很強的抑制作用。可以看出該脂肪酶對弱極性有機溶劑有較好的耐受性； ，1.7脂肪酶的Km值為0.120mmol/L，最大反應(yīng)速度Vmax為400U/mg，Kcat為240S—1 ，1.8脂肪酶對底物p-NPB，p-NPA, p-NPC, p-NPP表現(xiàn)出不同的水解能力；以p_NPB、P-NPC(C4-C8)為底物測定時表 現(xiàn)較高的酶活，而以P-NPA(C2)和P-NPP(C16)為底物測定吋，酶活較低，可見該脂肪酶對中長鏈脂肪的水解能力較強。
2.該脂肪酶基因核酸基因序列為:
I ATGGTCAGAT CGATGCGTTC CAGGGTGGTG GCAGGGGCAG TGGCATGCGC GATGAGCATC
，61 GCGCCGTTCG CGGGGACGAC TGTGGCAATG ACGCTCGCGA CGACGCACGC GGCGAGAGCG
，121 GCGACCGCGC CCGCCGATGG CTACGCGGCG ACGCGTTATC CGATCATCCT CGTGCACGGG
，181 CTGACGGGTA CCGACAAGTA CGCCGGCGTG CTCGAGTACT GGTACGGGAT CCAGGAGGAC
，241 CTGCAACAGA ACGGTGCGAC CGTCTACGTC GCGAACCTGT CGGGGTTCCA GAGTGACGAC
，301 GGCCCGAACG GGCGCGGCGA GCAGTTGCTC GCTTACGTGA AGACGGTGCT CGCGGCGACG
，361 GGGGCGACCA AGGTCAATCT CAGAGGCCAC AGCCAGGGGG GCCTCACGTC GCGCTATGTT
，421 GCTGCCGTCG CGCCCGATCT CGTTGCGTCG GTGACGACGA TCGGTACGCC GCATCGCGGC
，481 TCCGAATTCG CCGACTTCGT GCAGACCGTC CTGGCATACG ACCCGACCGG ACTTTCGTCA
，541 TCGGTGATCG CCGCGTTCGT CAATGTGTTC GGTATCCTGA CGAGCAGCAG CCACAACACG
，601 AACCAGGACG CGCTCGCCGC GCTGCAGACG CTGACGACCG CACGCGCTGC CACGTACAAC
，661 CAGAACTATC CGAGTGCGGG CCTGGGTGCG CCCGGCAGTT GCCAGACCGG CGCGCCGACG
，721 GAAACCGTCG GCGGCAACAC GCACCTGCTG TATTCGTGGG CCGGCACGGC GATCCAGCCG
，781 ACGCTCTCCG CGTTCGGCGT GACGGGCGCA ACGGATACGA GCACCATTCC GCTCGTCGAT
，841 CCGGCGAACG CGCTCGACCT GTCGACGCTT GCCCTGTTCG GCACGGGTAC GGTGATGATC
，901 AATCGTAGCT CCGGGCAGAA CGACGGGCTC GTGTCGAAGT GCAGTGCGCT GTACGGCAAG
，961 GTGCTGAGCA CGAGCTACAA GTGGAACCAC CTCGACGAGA TCAACCAGCT GCTCGGCGTG.1021 CGCGGTGCAT ATGCGGAAGA TCCGGTCGCG GTGATCCGCA CGCATGCGAA CCGGCTGAAA1081 ACGGAGGGCG TGTAG該脂肪酶基因核酸序列長1095bp。
【文檔編號】C12N9/20GK103571807SQ201210278061
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2012年8月7日 優(yōu)先權(quán)日:2012年8月7日
【發(fā)明者】李洪兵, 張峰, 張明 申請人:湖南鴻鷹生物科技有限公司