專利名稱：一株陰溝腸桿菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株陰溝腸桿菌及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
韭菜(Alliumtuberosum Rottl. ex Spr.)為百合科蔥屬(Allium tuberosum)的多年生宿根植物，原產(chǎn)中國(guó)，國(guó)內(nèi)各地均有栽培。韭菜富含維生素及各種礦物質(zhì)，并且囚含有多種硫醚而具有特殊芳香味，可增進(jìn)食欲，并有一定的藥用價(jià)值。它的種子和葉等可入藥，具健胃、提神、止汗固澀、補(bǔ)腎助陽(yáng)、固精等功效。在中醫(yī)里，韭菜有一個(gè)很響亮的名字叫“壯陽(yáng)草”，還有人把韭菜稱為“洗腸草”，韭菜還有很多其它別名，如草鐘乳、起陽(yáng)草、長(zhǎng)生草、扁菜等。由于韭菜口感佳、味道鮮美所以受到大家的喜愛，尤其在春節(jié)前更是備受追捧，故而是一種經(jīng)濟(jì)植物。·種植韭菜需要使用大量化肥，這不儀影響了韭菜的品質(zhì)，也破壞了土壤環(huán)境，并且隨著化肥的大量使用，其利用率不斷降低已是眾所周知的事實(shí)。這說明，儀靠大量增施化肥來提高韭菜產(chǎn)量是有限的。為此各國(guó)科學(xué)家一直在努力探索提高化肥利用率，達(dá)到平衡施月巴、合理施肥以克服其弊端的途徑。微生物肥料在解決這方面問題上有獨(dú)到的作用。所以，根據(jù)我國(guó)作物種類和土壤條件，采用微生物肥料與化肥配合施用，既能保證增產(chǎn)，又減少了化肥使用量，降低成本，同時(shí)還能改善土壤及作物品質(zhì)，減少污染。微生物肥料是指一類含有活微生物的特定制品，應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，能夠獲得特定的肥料效應(yīng)。在這種效應(yīng)的產(chǎn)生過程中，活微生物起關(guān)鍵作用。目前一般將微生物肥料制品分為兩大類一類是狹義的微生物肥料，指通過微生物的生命活動(dòng)，增加了植物營(yíng)養(yǎng)元素的供應(yīng)量，包括土壤和生產(chǎn)環(huán)境中植物營(yíng)養(yǎng)元素的供應(yīng)總量，導(dǎo)致植物營(yíng)養(yǎng)狀況的改善，進(jìn)而產(chǎn)量增加，這一類微生物肥料的代表品種是根瘤菌肥；另一類是廣義的微生物肥料，指通過其中的微生物的生命活動(dòng)，不但能提高植物營(yíng)養(yǎng)元素的供應(yīng)量，還能產(chǎn)生植物生長(zhǎng)激素，促進(jìn)植物對(duì)營(yíng)養(yǎng)元素的吸收利用或有拮抗某些病原微生物的致病作用，減輕農(nóng)作物病蟲害而促進(jìn)作物產(chǎn)量的增加。與化學(xué)肥料相比，微生物肥料具有以下特點(diǎn)不破壞土壤結(jié)構(gòu)、保護(hù)生態(tài)、不污染環(huán)境，對(duì)人、畜和植物無毒無害；肥效持久；提高作物產(chǎn)量和改進(jìn)作物產(chǎn)品品質(zhì)；成本低廉；近年來，有關(guān)植物根際促生細(xì)菌(PGPR)的研究日益受到人們的關(guān)注。由于化肥、農(nóng)藥對(duì)環(huán)境造成嚴(yán)重污染，化肥價(jià)格高漲，能源緊缺，澳大利亞、美國(guó)、歐共體組織和日本等國(guó)，都開展了 PGPR的專項(xiàng)研究。1988 1997年已分別在加拿大、瑞士、澳大利亞和日本召開了四次國(guó)際研討會(huì)，并將繼續(xù)3年一屆輪流在世界各大洲舉行。PGPR研究和應(yīng)用已成為當(dāng)前農(nóng)業(yè)微生物研究的新熱點(diǎn)之一，與它有關(guān)的方面正在形成一個(gè)新的領(lǐng)域。作為微生物肥料的PGPR能直接為宿主植物提供營(yíng)養(yǎng)或間接為宿主植物根部的生長(zhǎng)提供積極的作用，或者幫助宿主植物與其它共生體形成有益的共生關(guān)系
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一株陰溝腸桿菌及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae) SXH-I,已于2012年06月26日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCCJia :北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏號(hào)為CGMCC No. 6296。陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae) SXH-1CGMCC No. 6296 簡(jiǎn)稱陰溝腸桿菌 SXH-1。本發(fā)明還保護(hù)陰溝腸桿菌SXH-I在促進(jìn)植物生長(zhǎng)中的應(yīng)用。所述植物具體可為韭菜。本發(fā)明還保護(hù)一種植物生長(zhǎng)促進(jìn)劑，其活性成分為陰溝腸桿菌SXH-I。所述植物具體可為韭菜。所述活性成分具體可為將陰溝腸桿菌SXH-I懸浮于水中得到的菌懸液。所述菌懸液中，陰溝腸桿菌SXH-I的濃度具體可為109CFU/mL。本發(fā)明還保護(hù)所述植物生長(zhǎng)促進(jìn)劑在促進(jìn)植物生長(zhǎng)中的應(yīng)用。所述植物具體可為
韭菜。以上任一所述的韭菜具體可為如下品種“大青苗”品種。本發(fā)明還保護(hù)陰溝腸桿菌SXH-I在生產(chǎn)I-氨基環(huán)丙烷-I-羧酸脫氨酶、吲哚乙酸或嗜鐵素中的應(yīng)用。應(yīng)用陰溝腸桿菌SXH-I生產(chǎn)I-氨基環(huán)丙烷-I-羧酸脫氨酶具體可包括如下步驟(I)將陰溝腸桿菌SXH-I懸浮于ADF培養(yǎng)液，振蕩培養(yǎng)后收集菌體；(2)將步驟(I)得到的菌體懸浮于0. lmol/L Tris-HCl緩沖液(pH=8. 0)，加入甲苯并破碎細(xì)胞，得到ACC脫氨酶。所述菌體、所述0. lmol/L Tris-HCl緩沖液(pH=8. 0)和所述甲苯的配比具體可為濕重為 0. 005g 的菌體:600 u L 0. lmol/L Tris-HCl 緩沖液(pH=8. 0) :30 y L 甲苯。步驟(I)中，所述破碎細(xì)胞的方法具體可為采用渦旋震蕩儀振蕩30s。應(yīng)用陰溝腸桿菌SXH-I生產(chǎn)吲哚乙酸具體可包括如下步驟將陰溝腸桿菌SXH-I接種于含有色氨酸的DF培養(yǎng)液，培養(yǎng)后得到吲哚乙酸。所述色氨酸在所述DF培養(yǎng)液中的濃度具體可為50-500 u g -Iiir10所述培養(yǎng)的條件可為室溫培養(yǎng)2天。所述培養(yǎng)的條件具體可為28°C、180r rnirT1振蕩培養(yǎng)2天(48小時(shí))。應(yīng)用陰溝腸桿菌SXH-I生產(chǎn)嗜鐵素具體可包括如下步驟將陰溝腸桿菌SXH-I接種于MKB培養(yǎng)基，培養(yǎng)過后得到嗜鐵素。所述培養(yǎng)的條件可為室溫培養(yǎng)2天。所述培養(yǎng)的條件具體可為28°C>180r mirT1振蕩培養(yǎng)2天(48小時(shí))。本發(fā)明還保護(hù)陰溝腸桿菌SXH-I的發(fā)酵液。所述發(fā)酵液是將陰溝腸桿菌SXH-I接種于發(fā)酵培養(yǎng)基并進(jìn)行發(fā)酵后得到的。所述發(fā)酵培養(yǎng)基具體可為含有色氨酸的DF培養(yǎng)液或MKB培養(yǎng)基。所述色氨酸在所述DF培養(yǎng)液中的濃度具體可為50-500 u g mL—1。所述發(fā)酵的條件可為室溫培養(yǎng)2天。所述發(fā)酵的條件具體可為振蕩培養(yǎng)2天。所述發(fā)酵液中含有吲哚乙酸或嗜鐵素。所述發(fā)酵液具有將來自Ca3(PO4)2的不溶形式磷酸根離子變?yōu)榭扇苄问搅姿岣x子的能力。本發(fā)明還保護(hù)陰溝腸桿菌SXH-I的細(xì)胞破碎物。所述細(xì)胞破碎物中含有I-氨基環(huán)丙烷-I-羧酸脫氨酶。從韭菜根際土中篩選出的根際菌再重新施用于韭菜可以避免根際菌對(duì)微環(huán)境的不適同時(shí)也可以更好的與其他根際菌共同作用達(dá)到對(duì)韭菜的促生效果。本發(fā)明所提供的陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae) SXH-I可在好氧條件下將ACC作為唯一氮源進(jìn)行生長(zhǎng)，同時(shí)將其分解。該菌株有望在韭菜促生方面起到重要作用。


圖I為陰溝腸桿菌SXH-I在ADF培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)狀況。圖2為陰溝腸桿菌SXH-I合成生長(zhǎng)激素的能力。圖3為陰溝腸桿菌SXH-I合成嗜鐵素的能力。圖4為陰溝腸桿菌SXH-I的溶磷能力。圖5為陰溝腸桿菌SXH-I對(duì)韭菜的大田促生效果。
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圖6為陰溝腸桿菌SXH-I對(duì)韭菜促生14天時(shí)的株高。圖7為陰溝腸桿菌SXH-I對(duì)韭菜促生14天時(shí)的植株地上部分鮮重。圖8為陰溝腸桿菌SXH-I對(duì)韭菜促生14天時(shí)的植株地上部分干重。
具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。I-氨基環(huán)丙燒-I-羧酸，英文名稱為 l-aminocyclopropane-l-carboxylic acid,簡(jiǎn)稱為ACC):購(gòu)于上海笛柏化學(xué)品技術(shù)有限公司，貨號(hào)為P201735。哌嗪-1，4-二乙磺酸，英文名稱為 piperazine-N, N' -bis (2-ethanesulfonic acid,簡(jiǎn)稱為 PIPES):購(gòu)于 Sigma公司，貨號(hào)為MFCD06658739。TSB培養(yǎng)液(pH7. 5):取胰蛋白胨17g、大豆胨3g、NaCl 5g、葡萄糖2. 5g和K2HP042. 5g,加入蒸懼水并用蒸懼水定容至1L。DF 培養(yǎng)液(pH7. 5):取 KH2P044g、Na2HP046g、MgSO4 7H20 0. 2g、FeSO4 7H20 Img、葡萄糖2g、葡萄糖酸2g、檸檬酸2g、(NH4)2S042g和微量元素溶液0. 1ml，加入蒸餾水并用蒸餾水定容至1L。ADF 培養(yǎng)液(pH7. 5):用 3. Ommol ACC 替代 DF 培養(yǎng)液中的 2. Og (NH4) 2S04，其它完全同DF培養(yǎng)液；ADF培養(yǎng)液中ACC為唯一氮源。微量元素溶液取H3BO3IOmg、MnSO4Il. 2mg、ZnSO4124. 6mg、CuS0478. 2mg 和MoO3IOmg,加入蒸懼水并用蒸懼水定容至100mL。MKB培養(yǎng)基(pH7. 2):取酸水解酪蛋白 5g、甘油 15mL、K2HP042. 5g、MgS04 *7H20 2. 5g，與蒸餾水混勻并用蒸餾水定容至1000mL。NBRIP 液體培養(yǎng)基(pH7. 0):取葡萄糖 10g、Ca3 (PO4) 25g、MgCl25g、MgSO4 7H200. 25g、KCl 0. 2g和(MM)2SO4O. lg，加入去離子水并用去離子水定容至1L。NBRIP固體培養(yǎng)基在NBRIP液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，每升添加瓊脂15g。實(shí)施例I、陰溝腸桿菌SXH-I的分離和鑒定一、菌株SXH-1的獲得I、取樣
供試韭菜及土壤取于黑龍江省哈爾濱市呼蘭區(qū)雙井鎮(zhèn)(土壤理化性質(zhì)pH8. 15，全鹽含量I. 83%，堿解氮36mg/kg，有效磷8mg/kg，速效132mg/kg，有機(jī)質(zhì)2. 69%)。將韭菜及植物根際土壤裝入事先準(zhǔn)備好的干凈保鮮袋中，帶回實(shí)驗(yàn)室種植待測(cè)。2、篩選和純化(I)取Ig根際土樣于50mL PAF培養(yǎng)基中，28°C振蕩培養(yǎng)。PAF培養(yǎng)基含有蛋白胨、酪蛋白水解物、MgS04、K2HPO4和甘油。(2)取ImL (I)震蕩后的PAF培養(yǎng)液，于50mL PAF培養(yǎng)基中，28°C振蕩培養(yǎng)。(3)取ImL (2)得到的PAF培養(yǎng)液，于50mL DF鹽培養(yǎng)液中，28°C振蕩培養(yǎng)。DF鹽培養(yǎng)液含有 KH2P04、Na2HP04、MgS04、FeS04、葡萄糖、葡萄糖酸、檸檬酸、(NH4)2S04、H3B03、MnS04、ZnSO4、CuSO4 和 MoO3。(4)取ImL (3)得到的DF鹽培養(yǎng)液，于50mL不含(NH4)2S04，但含有3mM ACC的DF
鹽培養(yǎng)液中，28 °C振蕩培養(yǎng)。(5)取ImL (4)得到的培養(yǎng)液，涂布于含3mM ACC的DF鹽瓊脂培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)。(6)取(5)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落，純化并得到純培養(yǎng)的菌株。將得到的一株菌命名為SXH-I。二、菌株SXH-I的鑒定I、形態(tài)鑒定菌株SXH-I在ADF培養(yǎng)基上形成圓形、半透明、乳白色、突起光滑、邊緣整齊、有粘性的菌落(見圖I)。2、分子鑒定提取菌株SXH-I的基因組DNA，進(jìn)行16S rDNA的PCR擴(kuò)增和測(cè)序。PCR擴(kuò)增采用的引物如下利用引物F8/20 :5’-AGAGITTGATCCTGGCTCAG-3’ ；R1541/20 :5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’ 。PCR 擴(kuò)增條件94°C變性 3min ;94°C變性 30s，55°C退火 30s，72°C延伸 I. 5min，共30 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin ;4°C無限。對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果如序列表中序列I所示。三、菌株SXH-I的保藏通過步驟二的鑒定,菌株SXH-1屬于陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)。陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)SXH_l,已于2012年06月26日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCCJia :北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏號(hào)為CGMCC No. 6296。陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae) SXH-1CGMCC No. 6296 簡(jiǎn)稱陰溝腸桿菌 SXH-1。實(shí)施例2、陰溝腸桿菌SXH-I生產(chǎn)ACC脫氨酶的能力實(shí)驗(yàn)機(jī)理1_氨基環(huán)丙烷-I-羧酸在ACC脫氨酶的作用下，降解生成a _ 丁酮酸(a -KA)和氨氣。實(shí)驗(yàn)步驟如下I、將陰溝腸桿菌SXH-I在TSB培養(yǎng)液中過夜培養(yǎng)，4°C離心收集菌體并用DF培養(yǎng)液洗漆二次。2、將步驟I得到的菌體懸浮于ADF培養(yǎng)液，室溫(21 士 1°C )振蕩培養(yǎng)2d，4°C離心收集菌體，用0. lmol/L Tris-HCl緩沖液(pH=7. 6)洗滌三次。3、將步驟2得到的菌體(濕重約0. 005g)重新懸浮于600 u L 0. lmol/L Tris-HCl緩沖液(pH=8. 0)中，加入30 ii L甲苯并迅速振蕩30s (采用渦旋震蕩儀)以破碎細(xì)胞，整個(gè)破碎后體系即為細(xì)胞提取物。4、分組處理實(shí)驗(yàn)組取200 U L細(xì)胞提取物，加入20 U L 0. 5mol/L ACC水溶液并混勻，30°C培養(yǎng)15min (即反應(yīng)時(shí)間為15min，也就是0. 25小時(shí));然后加入ImL 0. 56mol/L HCl水溶液，
16000g離心5min，取上清液；取ImL上清液，加入800ii L 0. 56mol / L Hcl水溶液和300 y L2，4-二硝基苯肼溶液(溶劑為2M此1水溶液)，301培養(yǎng)301^11，加入21^ 2mol / L NaOH水溶液，540nm測(cè)吸光度，得到OD54tlnm數(shù)值?？瞻讓?duì)照組用20 ii L水代替20 ii L 0. 5mol / L ACC水溶液，其它同實(shí)驗(yàn)組。采用a -丁酮酸標(biāo)準(zhǔn)品代替以上細(xì)胞提取物進(jìn)行步驟4的實(shí)驗(yàn)組相同的實(shí)驗(yàn)并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程(方程甲)如下y=192x-l. 7864，R2=O. 9713，x代表OD54tlnm數(shù)值，y 代表 a- 丁酮酸(Ii mo I / L)。采用考馬斯亮藍(lán)法(Bradford法)檢測(cè)細(xì)胞提取物的總蛋白含量。以采用牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程(方程乙)如下y=404. 53x-l. 6665,R2=O. 9972，y代表總蛋白濃度(mg / L)，x代表OD595nm吸光值。ACC脫氨酶活性的計(jì)算方法如下將(實(shí)驗(yàn)組的OD54tlnm數(shù)值-空白對(duì)照組的OD54tol數(shù)值)的結(jié)果代入方程甲，得到數(shù)值A(chǔ) ;將細(xì)胞提取物的總蛋白濃度作為數(shù)值B ;用數(shù)值A(chǔ)除以數(shù)值B，再除以反應(yīng)時(shí)間(0.25小時(shí))，得到的結(jié)果即為ACC脫氨酶活性，單位為ymola -KA (mg 蛋白質(zhì) hr1。陰溝腸桿菌SXH-I得到的細(xì)胞提取物具有ACC脫氨酶活性，數(shù)值為0. 465 u mo I a -KA (mg 蛋白質(zhì) h) 1O實(shí)施例3、陰溝腸桿菌SXH-I生產(chǎn)生長(zhǎng)激素(吲哚乙酸，IAA)的能力I、將陰溝腸桿菌SXH-I在DF培養(yǎng)液中28°C、180 r ^mirT1振蕩培養(yǎng)2d，再微量轉(zhuǎn)入添加不同濃度色氨酸(L-Trp)的DF培養(yǎng)液(L-Trp的濃度為0、50、100、200或500 y g -m^1)中繼續(xù)培養(yǎng)2d，取樣于600nm測(cè)吸光度(OD6tltol數(shù)值)，其余培養(yǎng)液室溫下8000g離心取上清液。2、取500 u L步驟I的上清液，添加2mL Salkowski試劑(每升含150mL H2SO4,250mLddH20和7. 5mL 0. 5mol / L Fecl30水溶液，其余為水)，室溫黑暗培養(yǎng)20min后在535nm處測(cè)吸光度(OD535nm數(shù)值)。將DF培養(yǎng)液代替步驟I的上清液進(jìn)行步驟2的實(shí)驗(yàn)，作為測(cè)吸光度的調(diào)零處理。將不同濃度的IAA水溶液代替步驟I的上清液進(jìn)行步驟2的實(shí)驗(yàn)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程如下y=0. 0784x-0. 0139，R2=O. 9792，x代表OD535nm數(shù)值，y代表IAA濃度(U g mL_1) o對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算步驟I得到的上清液中的IAA濃度。將IAA濃度除以O(shè)D6tltol數(shù)值，結(jié)果見表I和圖2。
表I陰溝腸桿菌SXH-I生產(chǎn)IAA的能力，單位為y g (mL OD600) ―1
步驟I的DF培養(yǎng)液屮的L-Trp濃度1mL1)050100 200 500 陰溝腸桿菌 SXH-1 生產(chǎn) IAA 的能力 0.402 2. 584 4. 070 6. 470 7- 027結(jié)果表明，陰溝腸桿菌SXH-I能產(chǎn)生吲哚乙酸，且隨著L-Trp濃度的增加，吲哚乙酸合成量也隨之增加。實(shí)施例4、陰溝腸桿菌SXH-I生產(chǎn)嗜鐵素的能力某些菌株通過產(chǎn)生嗜鐵素(Siderophores)與環(huán)境中的鐵離子高度結(jié)合，使植物病原菌缺乏鐵營(yíng)養(yǎng)而不能生長(zhǎng)繁殖，從而占據(jù)一定的生態(tài)位。
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一、鉻天青S固體培養(yǎng)基平板的制備I、藍(lán)色染液的制備(I)將 0. 06g 絡(luò)天青 S (chrome azurol S)溶于 50ml 去離子水。(2)取0. 0027g FeCl 6H20溶于IOml IOmM HCl水溶液(溶劑為去離子水)。(3)取0. 073g CTAB (十六烷基三甲基溴化銨)溶于40ml去離子水。(4)將全部步驟(I)的溶液與9ml步驟⑵的溶液混合，再混合全部步驟(3)的溶液，此時(shí)為藍(lán)色，121°C滅菌20min。2、鉻天青S固體培養(yǎng)基平板的制備(1)MM9 培養(yǎng)液將 15g KH2PO4,25g NaCl 和 50g NH4Cl 溶于 500ml 去離子水。(2)將20g葡萄糖溶于IOOmL去離子水，110°C滅菌。(3)將3g酪蛋白水解物溶于27ml去離子水，濾膜過濾并收集濾液。(4)鉻天青S固體培養(yǎng)基平板的制備將100ml MM9培養(yǎng)液與750ml去離子水混勻，然后加入32. 24g PIPES并使其溶解，加入15g瓊脂，121°C滅菌20min后冷卻到50°C，然后加入30ml步驟(3)得到的濾液和IOml步驟(2)得到的溶液，然后緩慢加入IOOml步驟I制備的藍(lán)色染液(沿玻璃瓶壁加入，充分混勻)，倒板。一、陰溝腸桿菌SXH-I生產(chǎn)嗜鐵素的能力將陰溝腸桿菌SXH-I接種至于鉻天青S固體培養(yǎng)基平板上，28°C培養(yǎng)48h，觀察菌落周圍的顏色變化，如有橘黃色圈產(chǎn)生說明陰溝腸桿菌SXH-I產(chǎn)生了嗜鐵素。28°C培養(yǎng)48h后的照片見圖3。陰溝腸桿菌SXH-I菌落周圍有橘黃色暈圈產(chǎn)生，即陰溝腸桿菌SXH-I可產(chǎn)生嗜鐵素。分別測(cè)量橘黃色圈的直徑(D)和菌落直徑(d)，直徑比(D / d)為 I. 359。三、CAS檢測(cè)液的制備I、將 0. 182g CTAB 溶于 50ml 去離子水。2、將 0. 0054g FeCl 6H20 溶于 20ml IOmM HCl 水溶液。3、將0. 0605g鉻天青S溶于50ml去離子水。4、將I. 5ml步驟2得到的溶液與7. 5ml步驟3得到的溶液混合，再與6ml步驟I得到的溶液混合，得到混合液。5、將 4. 307g PIPES 用 20_30ml 去離子水溶解，加入 6. 25ml 濃 HC1，調(diào) pH 為 5. 6。
6、將全部步驟4得到的溶液和全部步驟5得到的溶液混合，并用去離子水定容至溶 100mlo四、陰溝腸桿菌SXH-I生產(chǎn)嗜鐵素的能力I、將陰溝腸桿菌SXH-I接種于MKB培養(yǎng)基，28°C、180r mirT1振蕩培養(yǎng)48h，離心(10000rpm/min, IOmin)取上清液。2、將3ml步驟I得到的上清液與3ml CAS檢測(cè)液混勻，28°C靜置lh，然后在630nm
處測(cè)吸光值(OD63tlnm數(shù)值)，結(jié)果為A。3、將3ml MKB培養(yǎng)基與3ml CAS檢測(cè)液混勻，28°C靜置lh，然后在630nm處測(cè)吸光值(OD63tlnm數(shù)值)，結(jié)果為Ar。A/Ar值越小，說明合成嗜鐵素能力越強(qiáng)。陰溝腸桿菌SXH-I的A/Ar值為I. 067，說明其具有一定的合成嗜鐵素的能力。實(shí)施例5、陰溝腸桿菌SXH-I的溶磷能力一、溶磷性測(cè)定將陰溝腸桿菌SXH-I點(diǎn)接在NBRIP固體培養(yǎng)基上，30°C培養(yǎng)4天，拍照并測(cè)量溶磷圈直徑(D)和菌落直徑(d)。照片見圖4。陰溝腸桿菌SXH-I具有溶解Ca3(PO4)2的能力，可以使磷酸根離子由不溶形式變?yōu)榭扇苄问?，從而被植物或菌株利用。陰溝腸桿菌SXH-I的D/d值為I. 958。二、溶磷量測(cè)定I、將陰溝腸桿菌SXH-I按1%的接種量接種于NBRIP液體培養(yǎng)基中，使得陰溝腸桿菌SXH-I的初始濃度為109CFU/mL，30°C、170r/min振蕩培養(yǎng)7天，然后10000r/min離心IOmin,收集上清液。2、檢測(cè)步驟I得到的上清液的含磷量(鑰銻抗比色法)。硫酸鑰銻抗混合顯色劑的制備①52ml濃硫酸注入IOOml去離子水?dāng)嚢?；@5g鑰酸銨溶于60°C、50ml去離子水中0. 5%酒石酸銻鉀0. 125g酒石酸銻鉀溶于25ml去離子水中；將①倒入②中，再將③加入①和②的混合液中，用水定容到250ml，然后每IOOml加A I. 5g左旋抗壞血酸；現(xiàn)配現(xiàn)用。取5ml步驟I得到的上清液，置于50ml容量瓶中，加入5ml 7. 5mol / L硫酸鑰銻抗混合顯色劑，加去離子水定容至刻度，充分搖勻，靜置30min，然后在660nm處測(cè)吸光值(OD66tlnm 數(shù)值)采用不同濃度的磷酸水溶液代替步驟I得到的上清液進(jìn)行上述實(shí)驗(yàn)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程如下y=2. 0858x+0. 0868，R2=O. 969 (x為OD66tlnm數(shù)值，y代表磷酸濃度Og/ ml)。對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線，步驟I得到的上清液中的磷酸根濃度為5. 549iig / ml，即陰溝腸桿菌SXH-I的溶磷能力較強(qiáng)。實(shí)施例6、陰溝腸桿菌SXH-I對(duì)韭菜的促生效果韭菜本實(shí)施例中進(jìn)行試驗(yàn)的韭菜為黑龍江省哈爾濱市呼蘭區(qū)雙井鎮(zhèn)的“大青苗”品種的韭采，購(gòu)頭于呼蘭區(qū)雙井鎮(zhèn)雙井村。一、陰溝腸桿菌SXH-I菌液的制備將陰溝腸桿菌SXH-I接種于TSB培養(yǎng)液，28°C下振蕩培養(yǎng)，4°C離心收集菌體，用無菌水洗滌2次后重懸于無菌水中，使活菌數(shù)在無菌水中的終濃度達(dá)IO9CFU / mL，即為陰溝腸桿菌SXH-I菌液。二、灌根實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)組對(duì)黑龍江省哈爾濱市呼蘭區(qū)雙井鎮(zhèn)田地中生長(zhǎng)的多年生韭菜進(jìn)行灌根實(shí)驗(yàn)，即澆灌步驟一得到的菌液，每平方米澆灌2000毫升，正常管理，一個(gè)月后拍照，照片見圖5 ；對(duì)照組用2000毫升水代替2000毫升步驟一得到的菌液，其它同實(shí)驗(yàn)組。結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組韭菜的生長(zhǎng)情況顯著優(yōu)于對(duì)照組的韭菜。三、浸種實(shí)驗(yàn)
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土壤取于黑龍江省哈爾濱市呼蘭區(qū)雙井鎮(zhèn)，采集樣品時(shí)在每個(gè)區(qū)域內(nèi)設(shè)置5個(gè)樣方，樣方面積為1X0. 3m2,收集表層土壤((T20cm), 土壤混合后,裝入事先準(zhǔn)備好的干凈保鮮袋中，迅速將土樣帶回實(shí)驗(yàn)室，土壤經(jīng)碾碎，混勻，風(fēng)干后過篩保存。將韭菜種子用0. 5% (體積比)次氯酸鈉水溶液表面消毒lOmin，用無菌水洗滌，然后分組處理實(shí)驗(yàn)組用步驟一制備的菌液浸泡Ih ;對(duì)照組用無菌水浸泡lh。然后將處理后的韭菜種子均勻種在盆中(填充物為土壤),每盆20株，每組種植5盆，于培養(yǎng)室內(nèi)25°C培養(yǎng)，隔天澆水。發(fā)芽14天后觀察生長(zhǎng)情況并測(cè)量株高、植株地上部分鮮重及植株地上部分干重。株高測(cè)量結(jié)果見圖6 (縱坐標(biāo)的單位為cm)。與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組韭菜的株高增加 46. 76%。植株地上部分鮮重(縱坐標(biāo)單位為g，以10株植株計(jì))測(cè)量結(jié)果見圖7。與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組韭菜的鮮重增加314. 22%。植株地上部分干重(縱坐標(biāo)單位為g，以10株植株計(jì))測(cè)量結(jié)果見圖8。與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組韭菜的干重增加243. 84%。結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組韭菜的生長(zhǎng)情況顯著優(yōu)于對(duì)照組韭菜。
權(quán)利要求
1.陰溝腸桿菌(Enterobactercloacae) SXH-1,它的保藏編號(hào)為 CGMCC No. 6296。
2.權(quán)利要求I所述陰溝腸桿菌SXH-I在促進(jìn)植物生長(zhǎng)中的應(yīng)用。
3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述植物為韭菜。
4.一種植物生長(zhǎng)促進(jìn)劑，其活性成分為權(quán)利要求I所述陰溝腸桿菌SXH-I。
5.如權(quán)利要求4所述的植物生長(zhǎng)促進(jìn)劑，其特征在于所述植物為韭菜。
6.權(quán)利要求4所述植物生長(zhǎng)促進(jìn)劑在促進(jìn)植物生長(zhǎng)中的應(yīng)用。
7.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述植物為韭菜。
8.權(quán)利要求I所述陰溝腸桿菌SXH-I在生產(chǎn)I-氨基環(huán)丙烷-I-羧酸脫氨酶和/或吲哚乙酸和/或嗜鐵素中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求I所述陰溝腸桿菌SXH-I的發(fā)酵液。
10.權(quán)利要求I所述陰溝腸桿菌SXH-I的細(xì)胞破碎物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株陰溝腸桿菌及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)SXH-1，它的保藏編號(hào)為CGMCCNo.6296。本發(fā)明還保護(hù)陰溝腸桿菌SXH-1在促進(jìn)植物生長(zhǎng)中的應(yīng)用。所述植物具體可為韭菜。本發(fā)明所提供的陰溝腸桿菌(Enterobactercloacae)SXH-1可在好氧條件下將ACC作為唯一氮源進(jìn)行生長(zhǎng)，同時(shí)將其分解。該菌株有望在韭菜促生方面起到重要作用。
文檔編號(hào)C12N9/88GK102787088SQ20121027916
公開日2012年11月21日 申請(qǐng)日期2012年8月7日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月7日
發(fā)明者史煦涵, 蔡洪生, 郭長(zhǎng)虹, 霍智慧, 馬軍 申請(qǐng)人:哈爾濱師范大學(xué)