密碼子優(yōu)化的Cry2Aa基因與重組載體以及改變作物抗性的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種Cry2Aa#基因，其為密碼子優(yōu)化的Cry2Aa基因，該Cry2Aa#基因具有SEQ?ID?No：1所示的序列，且該Cry2Aa#基因能夠編碼對鱗翅目等昆蟲具有致死活性的多肽。另一方面，本發(fā)明還提供了一種重組載體，其特征在于，該重組載體插入有如上所述的Cry2Aa#基因，并能使所插入的Cry2Aa#基因得到表達。另一方面，本發(fā)明還提供了一種改變作物抗性的方法，其特征在于，該方法包括將如上所述的重組載體轉(zhuǎn)化進所述作物中，使所述重組載體中插入的基因在在所述作物中表達。通過上述技術(shù)方案，殺蟲蛋白的表達量顯著提高，能夠為水稻提供對稻縱卷葉螟等水稻害蟲的高抗性。
【專利說明】密碼子優(yōu)化的Cry2Aa基因與重組載體以及改變作物抗性的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】[0001]本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地，涉及一種密碼子優(yōu)化的Cry2Aa基因、一種重組載體和一種改變作物抗性的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis, Bt)是自然界中普遍存在的一類細菌，Bt菌及Bt毒蛋白作為生物殺蟲劑，在農(nóng)業(yè)上有70多年的安全使用的歷史。1981年，Schnepft和Whiteley首次成功地克隆了第一個編碼Bt殺蟲蛋白基因，迄今為止，已先后分離并克隆了 600多個殺蟲蛋白基因,如:CrylA, Cry2A, CrylF等(Chickmore, 2011)。自1987年以來，Bt基因或改造后的Bt基因已被成功地導(dǎo)入煙草、玉米、棉花和水稻等多種植物，獲得了一大批具有良好抗蟲性的轉(zhuǎn)基因植物品種和種質(zhì)資源，產(chǎn)生了顯著的社會效益和經(jīng)濟效益。目前Bt基因已成為植物基因工程及轉(zhuǎn)基因育種中應(yīng)用最廣泛、最具有應(yīng)用前景的抗蟲基因。
[0003]雖然先后獲得了轉(zhuǎn)基因煙草(Vaeck et al, 1987;Adang et al, 1987;Bartonet al, 1987)、番爺(Fischhoff et al, 1987)、棉花(Perlak et al, 1990),但是殺蟲蛋白(Insecticidal Crystal Protein, ICP)在植物中表達水平普遍低,抗蟲效果也差。如美國Agra-cetus 公司的 Barton 等(1985)和 Agrigenefic 公司的 Adang( 1985)分別將 3’端缺失的CrylAa和CrylAc轉(zhuǎn)入煙草得到了抗蟲轉(zhuǎn)基因植株。但上述轉(zhuǎn)基因植物的抗蟲性都很弱，難以檢測出mRNA的轉(zhuǎn)錄，殺蟲蛋白的表達量很低，以重量計,僅占可溶性蛋白的0.001%。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供克服殺蟲蛋白在植物中表達水平普遍低、抗蟲效果也差的缺陷，提供一種在植物中表達水平高、抗蟲效果好的殺蟲蛋白。
[0005]為了實現(xiàn)上述目的，一方面，本發(fā)明提供了一種Cry2Aa#基因，其為密碼子優(yōu)化的Cry2Aa基因，其特征在于，該因具有SEQ ID No:1所示的序列，且該Cry2Aa#基因能夠編碼對鱗翅目昆蟲具有致死活性的多肽。
[0006]另一方面，本發(fā)明還提供了一種重組載體，其特征在于，該重組載體插入有如上所述的Cry2Aa#基因，并能使所插入的Cry2Aa#基因得到表達。
[0007]另一方面，本發(fā)明還提供了一種改變作物抗性的方法，其特征在于，該方法包括將如上所述的重組載體轉(zhuǎn)化進所述作物中，使所述重組載體中插入的基因在在所述作物中表達。
[0008]通過上述技術(shù)方案，殺蟲蛋白的表達量能夠達到18.88 μ g/g葉片鮮重,可以為水稻提供對稻縱卷葉螟等水稻害蟲的高抗性。
[0009]本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點將在隨后的【具體實施方式】部分予以詳細說明?！緦＠綀D】

【附圖說明】[0010]附圖是用來提供對本發(fā)明的進一步理解，并且構(gòu)成說明書的一部分，與下面的【具體實施方式】一起用于解釋本發(fā)明，但并不構(gòu)成對本發(fā)明的限制。在附圖中:
[0011]圖1:植物表達載體p3300-Cry2Aa#的構(gòu)建流程；
[0012]圖2:a.轉(zhuǎn)基因水稻中Cry2Aa#基因PCR擴增產(chǎn)物的凝膠電泳圖。
[0013]b.轉(zhuǎn)基因水稻中Bar基因PCR擴增產(chǎn)物的凝膠電泳圖；
[0014]圖3:轉(zhuǎn)基因植株B2A4008S的Southern雜交印跡圖；
[0015]圖4:轉(zhuǎn)基因植株B2A4008S中的Cry2Aa#基因的RT-PCR檢測結(jié)果；
[0016]圖5:轉(zhuǎn)基因B2A4008S的葉片中Cry2Aa蛋白濃度的檢測結(jié)果；
[0017]圖6:轉(zhuǎn)基因植株B2A4008S對稻縱卷葉螟抗性的生物測定結(jié)果；
[0018]圖7:轉(zhuǎn)基因植株B2A4008S (T1代)的草銨膦抗性檢測結(jié)果。
[0019]圖8 =T2代轉(zhuǎn)基因植株B2A4008S的草銨膦抗性檢測結(jié)果。
【具體實施方式】
[0020]以下對本發(fā)明的【具體實施方式】進行詳細說明。應(yīng)當(dāng)理解的是，此處所描述的【具體實施方式】僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。
[0021]本發(fā)明提供了一種Cry2Aa#基因，其為密碼子優(yōu)化的Cry2Aa基因，其特征在于，該&5^^#基因具有SEQ ID No:1所示的序列，且該Cry2Aa#基因能夠編碼對鱗翅目等昆蟲具有致死活性的多肽。
[0022]本發(fā)明的密碼子優(yōu)化的Cry2Aa基因，其命名為Cry2Aa#基因，相比原始Cry2Aa基因，進行了密碼子優(yōu)化，基本替換掉了存在的水稻稀有密碼子，以使其密碼子相對使用度與水稻保持一致，同時也大大降低了密碼子ACG、TCG、GCG、CCG所占的比例，減少了可能發(fā)生甲基化的位點。密碼子優(yōu)化的Cry2Aa基因(即本發(fā)明的Cry2Aa#基因)與原始Cry2Aa基因的比較如表1所示，與原始Cry2Aa基因的DNA序列相比，其氨基酸組成不變，改變堿基492個，占堿基總數(shù)的25.91%，更改密碼子428個，占整個密碼子的67.61% ；G+C含量由原始序列的34.81%改變?yōu)?7.47% ;并且消除了潛在的Poly (A)加尾信號位點、內(nèi)含子剪切信號位點。而原始序列中存在9個潛在的Poly(A)加尾信號位點及4個內(nèi)含子剪切信號位點，他們可能會造成轉(zhuǎn)錄本的不正常剪切，從而導(dǎo)致成熟mRNA的不完整性。
[0023]根據(jù)本發(fā)明的Cry2Aa#基因，其中，該Cry2Aa#基因的5’端還含有SEQ ID No:3所不的序列，且該Cry2Aa#基因的3’端還含有SEQ ID No:4所不的序列，且該Cry2Aa#基因能夠編碼N端具有PRla信號肽序列、C端具有KDEL內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號序列并對鱗翅目等昆蟲具有致死活性的多肽。
[0024]優(yōu)選情況下，本發(fā)明的Cry2Aa#基因具有如SEQ ID No: 2所示的序列，SEQ ID No:2所示的序列是在以上密碼子優(yōu)化的Cry2Aa#基因序列(SEQ ID No:1)的5’端添加如SEQID No:3所示的序列，3’端添加如SEQ ID No:4所示的序列得到的。SEQ ID No:3為PRla信號肽序列，SEQ ID No:4為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號KDEL序列。SEQ ID No:2所示的序列中的信號肽和定位信號肽可以使表達后的Cry2Aa蛋白(SEQ ID No:5)靶向性的運輸?shù)郊毎膬?nèi)質(zhì)網(wǎng)等質(zhì)體內(nèi)并積累。
[0025]根據(jù)本發(fā)明的Cry2Aa#基因，其中，該Cry2Aa#基因的3’端還具有轉(zhuǎn)錄終止子序列，所述轉(zhuǎn)錄終止子序列包括SEQ ID No:10所示的序列并能夠終止轉(zhuǎn)錄。
[0026]根據(jù)本發(fā)明的Cry2Aa#基因，其中，該Cry2Aa#基因的5’端還具有啟動子序列和增強子序列；所述啟動子序列包括SEQ ID No:8所示的序列，且能夠啟動072八3#基因的轉(zhuǎn)錄；所述增強子序列包括SEQ ID No:9所示的序列，且能夠增強Cry2Aa#基因的轉(zhuǎn)錄。
[0027]優(yōu)選情況下，在上述組合序列(SEQ ID No:2)的5’端分別添加Kozak特征序列及限制性內(nèi)切酶SmaI識別位點序列(cccggg)、3’端添加SacI識別位點序列(gagctc),最終形成如SEQ ID No:6所示的DNA序列。SEQ ID No:6所示的DNA序列的5’端添加啟動子和表達增強子、3’端添加終止子，從而構(gòu)建基因表達框。優(yōu)選地，該植物表達框如SEQ ID No:7所示DNA序列，它5’端具有如SEQ ID No:8 (即Ubi啟動子)和SEQ ID No:9 (即Ω增強子序列)所示的序列作為表達Cry2Aa#基因的啟動子和增強子，3’端具有如SEQ ID No:10所示的序列作為表達Cry2Aa#基因的轉(zhuǎn)錄終止子。
[0028]根據(jù)本發(fā)明的Cry2Aa#基因，其中，該072么&#基因具有SEQ ID No:2所示的序列，且該Cry2Aa#基因能夠編碼對鱗翅目等昆蟲具有致死活性的多肽；優(yōu)選地，該Cry2Aa#基因具有SEQ ID No:6所示的序列，且該&5^^#基因能夠編碼對鱗翅目等昆蟲具有致死活性的多肽。
[0029]本發(fā)明還提供了一 種重組載體，其特征在于，該重組載體插入有如上所述的Cry2Aa#基因，該重組載體能使所插入的Cry2Aa#基因得到表達。
[0030]本發(fā)明中，所述重組載體由上述基因序列和載體組成，所述載體可以為T載體、原核表達載體和真核表達載體中的至少一種，其中，T載體和原核表達載體的主要作用是初步驗證功能基因和目標(biāo)蛋白的功能，而真核表達載體的作用是為了后續(xù)將其轉(zhuǎn)化進作物中，因此，能夠滿足上述應(yīng)用的各種T載體(PMD18-T、PMD19-T等)、原核表達載體(pET32a等)和真核表達載體(pCAMBIA3300、pCAMBIA3301等)均可用于本發(fā)明。
[0031]根據(jù)本發(fā)明的重組載體，其中，該重組載體還插入有Bar基因，并且能使Bar基因得到表達；所述Bar基因具有SEQ ID No:12所示的序列且所述Bar基因能夠編碼具有抗草銨膦活性的多肽。優(yōu)選地，所述重組載體由上述Cry2Aa#基因序列和真核表達載體(pCAMBIA3300、pCAMBIA3301 等)組成。
[0032]根據(jù)本發(fā)明的重組載體，其中，所述Bar基因的5’端還具有啟動子序列，所述Bar基因的3’端還具有終止子序列；所述啟動子序列包括SEQ ID No:11所示的序列，且能夠啟動Bar基因的轉(zhuǎn)錄；所述終止子序列包括SEQ ID No:13所示的序列，且能夠終止Bar基因的轉(zhuǎn)錄。優(yōu)選地，篩選標(biāo)記基因的表達框依次由CaMV35S啟動子(SEQ ID No:11)、篩選標(biāo)記基因 Bar 基因(SEQ ID No:12)以及 CaMV35S polyA 終止子(SEQ ID No:13)組成。
[0033]本發(fā)明還提供了一種改變作物抗性的方法，其特征在于，該方法包括將如上所述的重組載體轉(zhuǎn)化進所述作物中，使所述重組載體中插入的基因在所述作物中表達。
[0034]根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“作物”為本領(lǐng)域公知的概念，指大面積栽種或大面積收獲，供盈利或口糧用的植物。本發(fā)明的基因不僅可用于轉(zhuǎn)入水稻，也可以用于轉(zhuǎn)入玉米、高粱、小麥、棉花、油菜、大豆、土豆、蔬菜等。優(yōu)選地，所述作物為水稻，所述水稻包括各種水稻，如各亞種(秈稻、粳稻、爪哇稻)、各生態(tài)型(早稻、中稻、晚稻)水稻等。為了將該基因應(yīng)用于兩系法雜交水稻的育種，本發(fā)明中，所述水稻為光溫敏核不育系水稻，具體地，可為光溫敏核不育系水稻 7001S、農(nóng)墾 58S、P88S、4008S、Y58S、培矮 64S、N5088S、香 125S、測 64S、廣占 63S、GD-2S等。優(yōu)選地，本發(fā)明中選光溫敏核不育系水稻4008S作為轉(zhuǎn)化的受體作物。
[0035]實現(xiàn)轉(zhuǎn)基因的方法有本領(lǐng)域公知的農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法、基因槍法和花粉管通道法等。優(yōu)選地，本發(fā)明所用的轉(zhuǎn)化方法為農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法。所述農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法可以為傳統(tǒng)的常規(guī)法，如(Yukoh Hiei, et al.Transformation of rice mediatedby Agrobacterium tumefaciens.Plant Molecular Biology,1997, 35, 205-218)中報道的方法，也可米用(Seiichi Toki, et al.Early infection of scutellum tissuewith Agrobacterium allows high-speed transformation of rice.The PlantJournal, 2006, 47，969-976.)中報道的快速轉(zhuǎn)化方法。本發(fā)明的發(fā)明人對現(xiàn)有技術(shù)的快速農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法進行了改進，具體地，Seiichi Toki等人進行農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化時，愈傷組織誘導(dǎo)后不進行繼代而直接浸染，而本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，根據(jù)所用的愈傷組織的狀態(tài)，誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織繼代第3天達到最佳狀態(tài)時再進行浸染能夠得到更高的侵染效率。即，優(yōu)選地，所述農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法包括，用上述的重組載體的農(nóng)桿菌菌液與作物的愈傷組織共培養(yǎng)，并對共培養(yǎng)后的愈傷組織進行篩選、預(yù)分化和分化，其中，所述愈傷組織為誘導(dǎo)后繼代的愈傷組織。
[0036]此外，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法中，在共培養(yǎng)和預(yù)分化愈傷組織時，所用固體培養(yǎng)基中的瓊脂粉含量為10_15g/L，優(yōu)選為12g/L能夠使愈傷組織的狀態(tài)良好，分化效率提高。
[0037]以下將通過實施例對本發(fā)明進行詳細描述。
[0038]其中，DNA序列SEQ ID No:6委托大連寶生物公司合成并連接在pMD19T載體上；各種PCR引物的合成和基因測序工作委托華大基因公司進行；各種酶均購自大連寶生物公司；pMD19T載體購自大連寶生物公司；pCAMIA3300載體提供自澳大利亞農(nóng)業(yè)分子生物學(xué)應(yīng)用中心(CAMBIA, http://www.cambia.0rg);質(zhì)粒的提取、純化和酶切以及其他常規(guī)分子生物學(xué)操作參考《分子克隆》(科學(xué)出版社，第三版)進行。
[0039]實施例1
[0040]本實施例用于說明本發(fā)明的Cry2Aa#基因的密碼子優(yōu)化方法
[0041]Cry2Aa 原始基因序列來自 NCBI (http: //www.ncb1.nlm.nih.gov/)，其查詢號為AY496458。選擇水稻品種日本晴基因組數(shù)據(jù)庫作為分析對象，網(wǎng)址為http://rgp.dna.affrc.g0.jp/giot/INE.html。首先篩選蛋白表達量較高、功能注釋詳細的基因的編碼序列作為分析對象，運用 Codonff (http: //mobyle.pasteur.fr/cg1-bin/portal.py?form=codonw)及 SeqnConverter (http://www.cibj.com/seqnconverter.zip)分析軟件，對篩選得到的101條完整的蛋白編碼序列進行密碼子使用頻率分析，結(jié)果見表1。
[0042]在保持Cry2Aa蛋白氨基酸順序不變的前提下，把其中RSCU值(即同義密碼子相對使用度，指某一密碼子所使用的頻率與其在無偏性使用時預(yù)期頻率之間的比值)小于0.5的密碼子替換成水稻偏愛的密碼子，即在同義密碼子組中RSCU值最大的水稻密碼子；RSCU值在0.5-1之間的密碼子只是部分替換成水稻偏愛的`密碼子；而RSCU值在I以上的密碼子不作改變。同義密碼子替換過程中，降低密碼子ACG、TCG、GCG、CCG所占的比例，以減少可能發(fā)生甲基化的位點。
[0043]Cry2Aa基因經(jīng)過水稻偏愛密碼子替換后，已不存在造成植物轉(zhuǎn)錄不穩(wěn)定的AT富集區(qū)及PolyA加尾識別信號序列。但仍然存在4處內(nèi)含子切割識別信號位點，繼續(xù)通過同義密碼子替換法消除內(nèi)含子切割識別信號位點。
[0044]表1人工優(yōu)化合成的Cir2Aa基因、原始的Cir2Aa基因與水稻編碼蛋白基因的密碼子相對使用度(RS⑶)比較
[0045]
"TT3 ^^RSCU C密碼子相對使MJ度)
氨基酸密碼f_|_^_

水稻蛋ft編碼基因imm Cfy2Aa mm優(yōu)化的0>,2如基W
Ala GCT0,45(335}1.20(9)0,77(6)
GCC1.70(1262)0.93(7)2.19(17)
GCA0.32(239)1.07(8)0,13(1)
GCG1,53(1137)0.80(6)0,90(7)
Cys TGT0.37(77)1.50(3)0.00(0)
TGC1.63(339)0.50(1)2.00(5)
Asp GAT0.51(355)2.00(24)0.56(7)
GAC1,49(1034)0.00(0)1.44(18)
Glu GAA0.43(310)1.58(15)0.20(2)
GAG1,57(1127)0.42(4)1.80(18)
Phe TTT0.31(120)1.70(28)0.16(3)
TTC1.69(660}0.30(5)1.84(34)
[0046]
【權(quán)利要求】
1.一種Cry2Aa#基因，其為密碼子優(yōu)化的Cry2Aa基因，其特征在于，該Cry2Aa#基因具有SEQ ID No:l所示的序列，且該Cry2Aa#基因能夠編碼對鱗翅目昆蟲具有致死活性的多肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的Cry2Aa#基因，其中，該Cry2Aa#基因的5’端還含有SEQIDNo:3所不的序列，且該Cry2Aa#基因的3’端還含有SEQ ID No:4所不的序列，且該Cry2Aa#基因能夠編碼N端具有PRla信號肽序列、C端具有KDEL內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號序列并對鱗翅目昆蟲具有致死活性的多肽，優(yōu)選所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID No:5所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的Cry2Aa#基因，其中，該Cry2Aa#基因的3’端還具有轉(zhuǎn)錄終止子序列，所述轉(zhuǎn)錄終止子序列包括SEQ ID No:10所示的序列并能夠終止Cry2Aa#基因的轉(zhuǎn)錄。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任意一項所述的Cry2Aa#基因，其中，該Cry2Aa#基因的5’端還具有啟動子序列和增強子序列；所述啟動子序列包括SEQ ID No:8所示的序列，且能夠啟動Cry2Aa#基因的轉(zhuǎn)錄；所述增強子序列包括SEQ ID No:9所示的序列，且能夠增強Cry2Aa#基因的轉(zhuǎn)錄。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的Cry2Aa#基因，其中，該072八&#基因具有SEQID No:2所示的序列；優(yōu)選地，該Cry2Aa#基因具有SEQ ID No:6所示的序列。
6.—種重組載體,其特征在于，該重組載體插入有權(quán)利要求1-5中任意一項所述的Cry2Aa#基因，該重組載體能使所插入的Cry2Aa#基因得到表達。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組載體，其中，該重組載體還插入有Bar基因，并且能使Bar基因得到表達；所述Bar基因具有SEQ ID No: 12所示的序列且所述Bar基因能夠編碼具有抗草銨膦活性的多肽。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的重組載體，其中，所述Bar基因的5’端還具有啟動子序列，所述Bar基因的3’端還具有終止子序列；所述啟動子序列包括SEQ ID No:11所示的序列，且能夠啟動Bar基因的轉(zhuǎn)錄；所述`終止子序列包括SEQ ID No:13所示的序列，且能夠終止Bar基因的轉(zhuǎn)錄。
9.一種改變作物抗性的方法,其特征在于,該方法包括將權(quán)利要求6-8中任意一項所述的重組載體轉(zhuǎn)化進所述作物中，使所述重組載體中插入的基因在所述作物中表達。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中，所述作物為水稻，優(yōu)選為水稻光溫敏核不育系4008S。
【文檔編號】C12N15/32GK103571853SQ201210280832
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2012年8月8日 優(yōu)先權(quán)日:2012年8月8日
【發(fā)明者】肖國櫻, 翁綠水 申請人:中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所