專利名稱：一種β-木糖苷酶及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于遺傳酶工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及ー種￠-木糖苷酶及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
0 -木糖苷酶(0-xylosidase, EC 3. 2. I. 37),是ー種木聚糖裂解酶?？膳c木聚糖 酶協(xié)同作用，將木聚糖徹底分解，是木聚糖降解的關(guān)鍵酶之一。￠-木糖苷酶主要以外切方 式作用于木ニ糖或低聚木糖的非還原端木糖苷鍵并釋放出木糖，因此在整個(gè)協(xié)同水解過程 中可以降低木聚糖的水解產(chǎn)物從而可以較大程度的解除產(chǎn)物對(duì)木聚糖酶的抑制，是木聚糖 水解過程中的限速酶。￠-木糖苷酶在將單糖或こ醇連接到木糖単元或從木糖単元中切割 下來的葡基轉(zhuǎn)移反應(yīng)中也是有效的。￠-木糖苷酶還可以作用于萜類、留體等甙元與木糖形 成的糖苷鍵，釋放出甙元。^ -木糖苷酶的水解反應(yīng)和葡基轉(zhuǎn)移反應(yīng)在降解和利用農(nóng)業(yè)廢物中具有重要經(jīng)濟(jì) 價(jià)值，例如在木糖、木糖寡聚物和木糖醇的產(chǎn)生過程中(這些物質(zhì)在食品、蜜餞和藥物中作 為增甜劑，特別是作為糖替代品是有用的)。并且，此酶或其產(chǎn)物可以用作面包改進(jìn)劑并可 用于啤酒釀制エ業(yè)中。在造紙エ業(yè)的紙漿漂白中，￠-木糖苷酶與木聚糖酶協(xié)同作用可以 有效提高漂白性能；在醫(yī)藥行業(yè)中，木聚糖酶和木糖苷酶水解特定底物可產(chǎn)生在醫(yī)藥行業(yè) 具有重要應(yīng)用價(jià)值的中間轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。因此對(duì)于木聚糖酶和木糖苷酶的研究具有廣泛而重要 的用途。研究發(fā)現(xiàn)，不同來源的￠-木糖苷酶存在作用效果上的差異，因此，篩選出不同來 源的￠-木糖苷酶，除了可以研究其酶學(xué)特性以外，還可以為研究糖苷水解酶家族特征及 酶的體外定向改造提供理論上的指導(dǎo)。并可為エ業(yè)生產(chǎn)性能優(yōu)良的纖維素及半纖維素水解 酶提供新型酶制劑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供ー種P -木糖苷酶及其應(yīng)用，即ー種具有エ業(yè)應(yīng)用價(jià)值的新 型￠-木糖苷酶，從而彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足。本發(fā)明ー個(gè)方面涉及ー種木糖苷酶，包括有a)序列為 SEQ ID NO 1 的酶；b)在a)中的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失或添加ー個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有a中所述 酶的活性的，由a衍生的酶。編碼上述木糖苷酶的核苷酸，其ー種序列為SEQ ID NO :2。本發(fā)明還提供用于表達(dá)上述木糖苷酶的重組表達(dá)質(zhì)粒，是將序列為SEQ IDNO 2 的核苷酸片段插入到原核表達(dá)載體中構(gòu)建的。本發(fā)明還涉及攜帯有表達(dá)上述木糖苷酶的重組表達(dá)質(zhì)粒的重組菌。本發(fā)明的木糖苷酶用于制備木ニ糖。本發(fā)明提供的重組菌所產(chǎn)P -木糖苷酶主要為胞外酶，發(fā)酵進(jìn)行到第5天時(shí)，發(fā)酵液酶量達(dá)到24. 78U/ml。其最適溫度為50°C，最適pH為6. 6。本發(fā)明篩選出的木糖苷酶在木聚糖降解為低聚木糖的過程中發(fā)揮了十分重要的作用，可以用來生產(chǎn)木二糖，具有工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值。而且篩選出的β_木糖苷酶可以用來轉(zhuǎn)化工程菌，從而獲得具有表達(dá)木糖苷酶的重組菌。


圖I :本發(fā)明的β -木糖苷酶基因DNA電泳圖譜；圖2 :本發(fā)明的質(zhì)粒pGm_x449的構(gòu)建圖；
圖3 :本發(fā)明木糖苷酶在不同溫度下的相對(duì)活力；圖4 :本發(fā)明木糖苷酶在不同pH值下的相對(duì)活力。圖5 :本發(fā)明木糖苷酶在不同溫度下的熱穩(wěn)定性。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)例對(duì)本發(fā)明的方法做進(jìn)一步說明。但實(shí)例僅限于說明，并不限于此。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通?？砂闯Ｒ?guī)條件，如J.薩姆布魯克(Sambrook)等編寫的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件運(yùn)行。一、本發(fā)明的木糖苷酶的分離I、紙狀葡萄穗霉菌總DNA提取(I)將紙狀葡萄穗霉菌(購(gòu)自中國(guó)微生物菌種保管委員會(huì)普通微生物中心，CGMCC3. 5365)用CMC液體培養(yǎng)基在30°C，200rpm,搖床培養(yǎng)48h ；(2)用無菌紗布過濾得菌絲體，將菌絲體在液氮中磨成粉末。(3)與提取方法參考試劑盒Fungal DNA kit (購(gòu)自O(shè)MEGA bio-tek)。2、β-木糖苷酶基因的克隆和篩選根據(jù)紙狀葡萄穗霉菌全基因組分析得到的β -木糖苷酶基因序列即SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列，設(shè)計(jì)一對(duì)寡核苷酸引物Pl和Ρ2，其序列為Pl:5/ -CCATTACGTAAGAATGCTGACCTCTCTTGTACTCCTG-3'P2:5/ -CTAGTCTAGATTATGCAACCTCACGGGCCGTC-3'取實(shí)施例I提取的基因組DNA溶液I. 5 μ I作為模版擴(kuò)增β -木糖苷酶基因。 反應(yīng)混合物(50 μ I)如下dd H20,34 μ I ；K0D buffer,5 μ I ；MgCl2 buffer,2 μ I ；dNTP Μ χ、4μ I ；P1 引物、I. 0μ I ；Ρ2 引物、I. O μ I ;基因組 DNA、1.5y I ；K0DU μ I。反應(yīng)程序如下第一階段變性95°C，3min ;第二階段變性94°C，30s，退火58°C，30s，延伸68°C 3min，共進(jìn)行25個(gè)循環(huán)；第三階段延伸72°C，10min。得到的PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果見圖I。PCR產(chǎn)物用SnaB I和Xba I雙酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收酶切產(chǎn)物片段。與經(jīng)同樣限制型內(nèi)切酶酶解并切膠回收的質(zhì)粒PGm連接，轉(zhuǎn)化感受太大腸桿菌(E. coli)DH5 α后，涂于含有Amp的LB固體培養(yǎng)基上。37°C培養(yǎng)14-16小時(shí)，進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，有正確條帶的，挑取單克隆轉(zhuǎn)接到4ml LB液體培養(yǎng)集中進(jìn)行培養(yǎng)(含Amp)，14-16小時(shí)后，提取質(zhì)粒鑒定和測(cè)序。將重組質(zhì)粒pGm-x449轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主黑曲霉Gl，含有該重組質(zhì)粒的重組菌株為 Gl-pGm_x449。其中的酶切及連接反應(yīng)均參照表1。表1酶切體系及連接體系
權(quán)利要求
1.ー種β-木糖苷酶，包括有 a)序列為SEQID NO 1的酶； b)在a)中的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失或添加ー個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有a中所述酶的活性的，由a衍生的酶。
2.一種核苷酸，其特征在于，所述核苷酸用于編碼權(quán)利要求I所述的木糖苷酶。
3.如權(quán)利要求2所述的核苷酸，其特征在于所述的序列為SEQID Ν0:2。
4.一種用于表達(dá)權(quán)利要求I所述的木糖苷酶的重組表達(dá)質(zhì)粒,是將序列為SEQ IDNO 2的核苷酸片段插入到原核表達(dá)載體中構(gòu)建的。
5.ー種重組菌，其特征在于所述的重組菌攜帶有權(quán)利要求4所述的重組表達(dá)質(zhì)粒。
6.權(quán)利要求I所述的木糖苷酶的應(yīng)用，其特征在于，所述的木糖苷酶用于制備木ニ糖。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種β-木糖苷酶及其應(yīng)用，包括有a)序列為SEQ ID NO1的酶；)在a)中的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有a中所述酶的活性的，由a衍生的酶。本發(fā)明篩選出的β-木糖苷酶在木聚糖降解為低聚木糖的過程中發(fā)揮了十分重要的作用，可以用來生產(chǎn)木二糖，具有工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值。而且篩選出的β-木糖苷酶可以用來轉(zhuǎn)化工程菌，從而獲得具有表達(dá)木糖苷酶的重組菌。
文檔編號(hào)C12P19/14GK102827819SQ201210281598
公開日2012年12月19日 申請(qǐng)日期2012年8月8日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月8日
發(fā)明者王華明, 于海玲 申請(qǐng)人:天津工業(yè)生物技術(shù)研究所