專利名稱：一種登革病毒/黃熱病毒/西尼羅病毒/基孔肯雅病毒鑒別檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種四種蟲媒性傳播病原體鑒別檢測的試劑盒，特別是涉及一種利用多重實(shí)時(shí)突光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)檢測登革病毒、黃熱病毒、西尼羅病毒、基孔肯雅病毒的試劑盒。本試劑盒主要包括RT-PCR反應(yīng)液、引物探針混合液、RT-PCR反應(yīng)酶系、DEPC H2O,以及分隔并集中包裝這些試劑瓶或管的包裝盒。由于本試劑盒能準(zhǔn)確區(qū)分登革病毒、黃熱病毒、西尼羅病毒以及基孔肯雅病毒，可廣泛應(yīng)用于由上述蟲媒傳播病毒所引起的的鑒別診斷、檢驗(yàn)檢疫、疫情防控等多個(gè)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
蟲媒病毒(Arbovirus)是指由吸血昆蟲傳播的病毒，其特點(diǎn)是病毒可在昆蟲體內(nèi) 繁殖，但昆蟲本身不發(fā)病，通過叮咬將病毒傳播給人、畜，因此蟲媒病毒可以引起人畜共患病。國際上已發(fā)現(xiàn)537種蟲媒病毒，其中130余種可引起人畜疾病，導(dǎo)致發(fā)熱、皮疹和關(guān)節(jié)痛、出血熱、休克等，嚴(yán)重的可以引起死亡。此外30種蟲媒病毒可引起腦炎。蟲媒病毒分布世界各地，并可因人群的流動(dòng)、宿主和媒介的遷移而傳播到異地。登革熱(Dengue fever)、黃熱(Yellow fever virus)、西尼羅熱(West Nile fever)和基孔肯雅熱(Chikungunyafever)四種疾病是威脅著熱帶或亞熱帶國家人民健康的重要蟲媒病毒性傳染病，分別因感染登革熱病毒(Dengue virus, DV)、黃熱病毒(Yellow fever virus, YFV)、西尼羅病毒(West Nile virus,WNV)和基孔肯雅病毒(Chikungunya virus,CHIK)所引起。我國廣東、廣西、貴州、海南、云南等地處亞熱帶氣候，有多種蟲媒病毒存在和傳播的條件，自1978年在廣東佛山發(fā)生登革熱流行以來，廣東省每年都有可能由輸入性病例引起的登革熱后續(xù)感染流行的疫情報(bào)告，黃熱每年都有發(fā)生，而西尼羅熱和基孔肯雅熱極有可能存在輸入的可能并造成流行。由于登革熱、西尼羅熱和基孔肯雅熱在臨床癥狀上非常相似，而診斷鑒別對(duì)分離培養(yǎng)條件要求較高，因此不排除已存在輸入性西尼羅熱或基孔肯雅熱病例；另外，海南、云南二省已經(jīng)發(fā)現(xiàn)過基孔肯雅病毒并從人群中檢出過相應(yīng)的抗體。登革、黃熱、西尼羅和基孔肯雅等四種病毒中，除黃熱病毒在我國南方區(qū)域廣泛存在外，其余三種病毒，特別是登革病毒，需嚴(yán)防入境人員或蚊蟲帶入；即使已經(jīng)傳入，各地醫(yī)療、疾控部門也必需盡早發(fā)現(xiàn)，以把疫情控制在最小范圍。WHO統(tǒng)計(jì)的數(shù)字顯示，全球每年感染登革病毒的人數(shù)高達(dá)5000萬人，特別在我們毗鄰的東南亞各國，一年四季都有登革熱流行，對(duì)人民的身體健康造成極大的危害；西尼羅熱是起源和流行于非洲的蟲媒傳染病，在二十世紀(jì)末，作為一種再發(fā)的傳染病(Emerging Infectious Disease)傳到北美洲后,給美國和加拿大等北美各國帶來了重大經(jīng)濟(jì)損失和極大的恐慌，單在美國2002年就報(bào)告4156例，死亡284例，隨后疫情擴(kuò)散到44個(gè)州，2003年又報(bào)告9306病例，死亡240例；而近幾年中，在我國周邊的印度、斯里蘭卡等國家，數(shù)以萬計(jì)的人感染基孔肯雅熱，2006年上半年，僅印度南部嘻拉拉邦(Kerala)暴發(fā)由蚊子傳播的基孔肯雅熱,最少造成了 87人死亡；2005年3月，太平洋島國留尼汪的官方數(shù)據(jù)顯示，全國20%的人口約157000人被基孔肯雅病毒感染，死亡77人。周邊國家如此嚴(yán)峻的形勢正在威脅著我們，我國自從加入WTO后，經(jīng)國境口岸的人員和貨物往來極其頻繁，登革、西尼羅、基孔肯雅等病毒隨時(shí)都有可能被感染的人或蚊蟲帶入的危險(xiǎn)。亟待建立快速鑒別和檢測的方法并進(jìn)行應(yīng)用。登革熱、黃熱、西尼羅熱和基孔肯雅熱四種疾病都是通過帶毒蚊子叮咬人而傳播，發(fā)病初期癥狀極其相似，難以鑒別；并且具有傳染快、易流行等特點(diǎn)，一旦發(fā)生，將嚴(yán)重威脅人們健康和社會(huì)安定。為了有效防控上述蟲媒病毒性疾病的發(fā)生與傳播，在疾病發(fā)生早期實(shí)行快速診斷是一個(gè)重要的環(huán)節(jié)，而對(duì)于各出入境口岸來說，在不影響入境人員和貨物快速通關(guān)前提下，如能在有效時(shí)間內(nèi)，實(shí)現(xiàn)對(duì)人員以及船艙、貨物中可能攜帶的蚊子進(jìn)行快速篩查；同時(shí)，快速檢測各口岸周邊環(huán)境中蚊子攜帶病毒情況、建立有效防控網(wǎng)絡(luò)，以防上述病毒的傳入，將具有非常重大的意義。目前，國內(nèi)外對(duì)上述病毒的診斷方法，主要還是依靠血清學(xué)試驗(yàn)、組織培養(yǎng)和常規(guī)的PCR檢測，其中，血清學(xué)試驗(yàn)、組織培養(yǎng)。具有靈敏度低、免疫交叉反應(yīng)以及周期長等缺 點(diǎn)；而常規(guī)PCR也存在容易污染的不足。多重實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)是將PCR技術(shù)和多色熒光標(biāo)記探針相結(jié)合的先進(jìn)技術(shù)，該方法具有快速、特異、靈敏、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)，結(jié)合防污染技術(shù)處理，特別適合于大規(guī)模、快速診斷的需求。該技術(shù)采用多色熒光對(duì)多條種特異性探針進(jìn)行標(biāo)記，配合多重PCR技術(shù)，可以在同一個(gè)PCR反應(yīng)管中對(duì)多個(gè)病毒同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增，各色熒光的增長信號(hào)與相應(yīng)PCR產(chǎn)物的增長量成等比關(guān)系，并被自動(dòng)化熒光檢測儀收集，最后可通過分析熒光增長曲線達(dá)到診斷病毒類型的目的。由于，熒光PCR技術(shù)具有擴(kuò)增片段短，引物、探針具有雙重特異等優(yōu)點(diǎn)，因此，將多重實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)應(yīng)用于4種蟲媒的快速檢測，能夠節(jié)約時(shí)間、減少取材數(shù)量、提高工作效率，能在短時(shí)間內(nèi)判斷疑似病例或可疑媒介是否感染某種病毒，及時(shí)采取必要的防控措施，防止這些病毒從境外傳入，降低傳染病疫情在國內(nèi)流行爆發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)，為快速診斷、有效監(jiān)測和控制疾病的發(fā)生和傳播提供支持和依據(jù)。本發(fā)明采用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)中的多重實(shí)時(shí)熒光PCR方法，對(duì)四種蟲媒病毒(登革病毒、黃熱病毒、西尼羅病毒、基孔肯雅病毒)核酸進(jìn)行擴(kuò)增，根據(jù)標(biāo)記的四色熒光的擴(kuò)增情況，來鑒別四種蟲媒病毒。本發(fā)明的試劑盒可廣泛地運(yùn)用于由登革病毒、黃熱病毒、西尼羅病毒、基孔肯雅病毒的檢驗(yàn)檢疫、疫情監(jiān)測。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種利用多重實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)進(jìn)行四種蟲媒病毒鑒別檢測的試劑盒，利用本試劑盒可以準(zhǔn)確區(qū)分登革病毒、黃熱病毒、西尼羅病毒、基孔肯雅病毒。在對(duì)GENBANK上所有已知的登革病毒、黃熱病毒、西尼羅病毒、基孔肯雅病毒株的核酸序列進(jìn)行比對(duì)的基礎(chǔ)上，分別尋找三種病毒核酸序列的特異性保守區(qū)，并針對(duì)保守區(qū)設(shè)計(jì)靶核苷酸引物和探針。這些引物探針在含有耐熱DNA聚合酶，逆轉(zhuǎn)錄酶、高質(zhì)量脫氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)的RT-PCR反應(yīng)酶系以及含有Mg2+等成份的RT-PCR反應(yīng)液中，通過熒光PCR儀實(shí)現(xiàn)體外核酸的循環(huán)擴(kuò)增。本發(fā)明所涉及的試劑盒主要包括I) RT-PCR反應(yīng)液、引物探針混合液、RT-PCR反應(yīng)酶系、DEPC H2O,陰性質(zhì)控品、陽性質(zhì)控品和2)分隔并集中包裝這些試劑瓶或管的包裝盒。
本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案是引物探針混合液由一對(duì)登革病毒特異性的正、反向引物，一條登革病毒特異性的探針，一對(duì)黃熱病毒特異性的正、反向引物，一條黃熱病毒特異性的探針，一對(duì)西尼羅病毒特異性的正、反向引物，一條西尼羅病毒特異性的探針，一對(duì)基孔肯雅病毒特異性的正、反向引物，一條基孔肯雅病毒特異性的探針組成，其特征在于登革病毒特異性的正向和反向引物的序列分別是5’ -GATTCTCAAAAGGATTGCTCTC-3’ (SEQ ID NO :1)和 5’-TTGTTAGGAATGCTATGAAGGC-3’ (SEQ ID NO 2);登革病毒特異性的探針的序列是 5’ _catca+Cca+Att+Tca+Tgg+Gtc_3’ (SEQID NO 3)(喊基如含“ + ” 表不該喊基為LNA修飾)，探針的兩端分別結(jié)合有熒光發(fā)生基團(tuán)FAM和熒光淬滅基團(tuán)BHQl ;黃熱病毒特異性的正向和反向引物的序列分別是5’ -AAACAAAACAAATTGGAAACAG-3’ (SEQID NO:4)和5’ -TTTTCCAGTCAAAATGTTGAAC-3’ (SEQ ID NO :5)，黃熱病毒特異性的探針的序列是 5’ _cttg+Aac+Acc+Tct+tgA+agG+Tcc_3’ (SEQID NO :6)(喊基如含 “ + ” 表不該喊基為LNA修飾)，探針的兩端分別結(jié)合有熒光發(fā)生基團(tuán)Cy5和熒光淬滅基團(tuán)Eclipse ;西尼羅病毒特異性的正向和反向引物的序列分別是5 ’ -CCGCCACCGGAAGTTGA—3，(SEQ ID NO7)和5’ -CGAGACGGTTCTGAGGGCT-3，(SEQID NO :8)，西尼羅病毒特異性的探針的序列是 5’ -caa+Cccc+Agga+Ggact-3’ (SEQ ID NO :9)(堿基前含 “ + ” 表示該堿基為 LNA 修飾)，探針的兩端分別結(jié)合有熒光發(fā)生基團(tuán)ffiX和熒光淬滅基團(tuán)Eclipse ;基孔肯雅病毒特異性的正向和反向引物的序列分別是 5’-GTGGGAGTACCGTATAAGACTC-3’ (SEQ ID NO 7)和 5’-CAGACAGAAGCTCCATCTCC-3’ (SEQID NO :8)，基孔肯雅病毒特異性的探針的序列是5’_cta+Cag+Ccc+Cat+Ggt+Act-3’ (SEQ ID NO :9)(堿基前含“ + ”表示該堿基為LNA修飾)，探針的兩端分別結(jié)合有熒光發(fā)生基團(tuán)Texas Red和熒光淬滅基團(tuán)Eclipse。本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案是引物探針混合液中引物濃度均為0.2mmol/L，探針濃度均為0. lmmol/Lo本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案是RT-PCR反應(yīng)液由Tris-HCl (50mmol/L, pH8. 0)、MgCl2 (8mmol/L) > KCl (250mmol/L)組成。本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案是RT-PCR反應(yīng)酶系由熱啟動(dòng)Taq酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、dNTPs組成。逆轉(zhuǎn)錄酶可選擇mMLV等常用逆轉(zhuǎn)錄酶。熱啟動(dòng)Taq酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、dNTPs均可采用市售產(chǎn)品，如Qiagen公司的產(chǎn)品，其中每人份RT-PCR反應(yīng)酶系中熱啟動(dòng)Taq酶的用量為5U，逆轉(zhuǎn)錄酶用量為5U，dNTPs用量為IOmmol。本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案是PCR擴(kuò)增的條件為50°C 15分鐘，95°C 15分鐘；94°C 15秒，55°C 45秒，40個(gè)循環(huán)(55°C時(shí)收集熒光信號(hào))；40°C 10秒。本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案是試劑盒提供了質(zhì)控品，分別為陰性質(zhì)控品和陽性質(zhì)控品。陰性質(zhì)控品為生理鹽水，陽性質(zhì)控品為含有四種病毒核酸的DEPC H2O溶液，由四種病毒陽性核酸按照濃度為2. OX 103copies/mL 5. OX 107copies/mL等體積比混合而成。優(yōu)選I. OX 105copies/mL,并以等體積比混合均勻制備成陽性質(zhì)控品。試劑盒中進(jìn)行待檢標(biāo)本檢測可同時(shí)進(jìn)行兩種質(zhì)控品的檢測，僅當(dāng)陽性質(zhì)控品檢測時(shí)FAM、HEX、Texas Red及CY5通道熒光信號(hào)均呈陽性，陰性質(zhì)控品檢測四個(gè)通道熒光信號(hào)均呈陰性時(shí)，待檢標(biāo)本的檢測結(jié)果才有效。本發(fā)明的試劑盒擴(kuò)增待檢標(biāo)本由市售的熒光定量PCR儀自動(dòng)完成，操作簡單，耗時(shí)少，且最大限度地減少了污染的發(fā)生。檢測結(jié)果可用于流感病毒分型、輔助臨床診斷及常規(guī)監(jiān)測等多個(gè)領(lǐng)域研究。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比優(yōu)點(diǎn)為①對(duì)四種病毒核酸擴(kuò)增水平進(jìn)行檢測，可反映出樣本中登革病毒、黃熱病毒、西尼羅病毒、基孔肯雅病毒感染的狀態(tài)，可用于四種蟲媒傳播病原體的監(jiān)測和防治，有助于疾病的早期診斷和治療多重實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)針對(duì)多種病毒核酸特異性序列設(shè)計(jì)引物、探針，具有較高通量，操作簡便、相對(duì)降低成本的優(yōu)點(diǎn)，更適用于大多數(shù)患者檢測；③一份樣本一次檢測即可鑒別四種蟲媒傳播病原體的感染情況及感染的型別，相比一個(gè)樣本做4次檢測來說，大大減少了工作量，提高了檢測效率；④采用特殊LNA標(biāo)記探針，比常規(guī)探針序列短5-10bp左右也可達(dá)到較高的Tm值，而短序列可更保守地?cái)U(kuò)增目的片段，可大大提高檢測的準(zhǔn)確率，減少漏檢幾率出現(xiàn)。


圖I顯示PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件。圖2顯示試劑盒陰性質(zhì)控品的擴(kuò)增曲線。圖中沒有S型擴(kuò)增曲線，說明FAM、HEX、 Texas Red及CY5通道熒光信號(hào)均呈陰性。圖3顯示試劑盒陽性質(zhì)控品的擴(kuò)增曲線。圖中FAM通道的擴(kuò)增曲線為S型，說明該通道的熒光信號(hào)呈陽性。圖4顯示試劑盒陽性質(zhì)控品的擴(kuò)增曲線。圖中HEX通道的擴(kuò)增曲線為S型，說明該通道的熒光信號(hào)呈陽性。圖5顯示試劑盒陽性質(zhì)控品的擴(kuò)增曲線。圖中Texas Red通道的擴(kuò)增曲線為S型，說明該通道的熒光信號(hào)呈陽性。圖6顯示試劑盒陽性質(zhì)控品的擴(kuò)增曲線。圖中CY5通道的擴(kuò)增曲線為S型，說明該通道的熒光信號(hào)呈陽性。圖7顯示4例陽性血清樣本的擴(kuò)增曲線。圖中4例樣本的FAM通道的擴(kuò)增曲線為S型,說明該樣本有登革病毒核酸的擴(kuò)增,表不樣本中存在登革病毒。圖8顯示I例陽性血清樣本的擴(kuò)增曲線。圖中HEX通道的擴(kuò)增曲線為S型，說明該樣本有西尼羅病毒核酸的擴(kuò)增，表示樣本中存在西尼羅病毒。圖9顯示I例陽性血清樣本的擴(kuò)增曲線。圖中Texas Red通道擴(kuò)增曲線均為S型，說明該樣本有基孔肯雅病毒核酸的擴(kuò)增，表示樣本中存在基孔肯雅病毒。圖10顯示I例陽性血清樣本的擴(kuò)增曲線。圖中Cy5通道擴(kuò)增曲線均為S型，說明該樣本有黃熱病毒核酸的擴(kuò)增，表不樣本中存在黃熱病毒。圖11顯示乙型腦炎病毒、發(fā)熱伴血小板減少綜合征布尼亞病毒、漢灘病毒、漢城病毒樣本的擴(kuò)增曲線。圖中無擴(kuò)增曲線，說明該樣本中不含有登革病毒或西尼羅病毒或基孔肯雅病毒或黃熱病毒核酸。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例I登革病毒/黃熱病毒/西尼羅病毒/基孔肯雅病毒鑒別檢測試劑盒及其使用I、制備包括下列組成成分的試劑盒引物探針混合液(25iU/管)1管，RT-PCR反應(yīng)液(250 Ul/管)，RT-PCR反應(yīng)酶系(75 iil/管)I管，陽性質(zhì)控品(200 yl/管)I管，陰性質(zhì)控品(200iil/管)1 管，DEPC 40(2000111/管)1管。2、標(biāo)本的采集、保存和運(yùn)輸2. I標(biāo)本類型血清、蚊蟲樣本。2. 2標(biāo)本采集2. 2. I血清無菌采集發(fā)病后5天內(nèi)靜脈血3 5ml，室溫靜置30分鐘使其凝固，然后1500 2000rpm離心IOmin,去除纖維蛋白和血紅球,收集血清于2ml無菌螺口塑料管中。
2. 2. 2蚊蟲根據(jù)實(shí)際工作需要采集蚊子標(biāo)本。將采集的蚊子直接放入_20°C冰箱凍死后，取出，分類編號(hào)，按30 50只一份，裝入2ml螺口塑料血清管內(nèi)。進(jìn)行核酸提取前，取出樣本于滅菌研缽中，加適量液氮進(jìn)行破碎處理后，再加入400 500 ill DEPC H20(4°C預(yù)冷)對(duì)破碎標(biāo)本快速進(jìn)行勻漿處理，取溶液立即進(jìn)行核酸提取操作。2. 3樣品保存和運(yùn)送血清標(biāo)本或分類分組后的蚊子標(biāo)本，裝入螺口塑料血清管，用耐低溫油性記號(hào)筆記上編號(hào)，于_70°C以下運(yùn)輸或保存待檢。亦可參照有關(guān)國家標(biāo)準(zhǔn)或有關(guān)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中推薦的方法。3、核酸提取可采用市售的RNA提取試劑盒，建議使用QIAamp Viral RNA Mini Kit提取試劑盒，并按照試劑盒的說明書進(jìn)行操作，最后收集到50 Ul RNA溶液，直接進(jìn)行檢測或保存于-20 °C。4、實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增及檢測4. I試劑準(zhǔn)備按比例取相應(yīng)量的引物探針混合液、RT-PCR反應(yīng)液、RT-PCR反應(yīng)酶系(引物探針混合液I U I/人份+RT-PCR反應(yīng)液5 iil/人份+RT-PCR酶系3 yl/人份+DEPCH2O Ilu I/人份)，充分混勻后按20 u I/管分裝成PCR反應(yīng)管，備用。4. 2加樣向PCR反應(yīng)管中，分別加入提取后的陰、陽性質(zhì)控品、樣本RNA溶液5 ，蓋緊管蓋，放入儀器樣品槽。4. 3 編輯(ABI Prism7500 熒光定量 PCR 儀)打開Setup窗口，按對(duì)應(yīng)順序設(shè)置陰、陽性質(zhì)控品和待測標(biāo)本，并在Name欄中設(shè)置樣品名稱。選中所有設(shè)置樣品孔，雙擊，選擇Add Detector,選擇Reporter為FAM和Quencher 為 none,再選擇 Reporter 為 HEX 和 Quencher 為 none ;再選擇 Reporter 為 TexasRed和Quencher為none ;然后選擇Reporter為Cy5和Quencher為none后關(guān)閉窗口。在Passive Reference中選擇(none)。打開instrument窗口設(shè)置循環(huán)條件50°C 15分鐘，950C 15分鐘；94°C 15秒，55°C 45秒，40個(gè)循環(huán)(見附圖I)。所有設(shè)置完成后保存文件，運(yùn)行。4. 4結(jié)果分析反應(yīng)結(jié)束后保存檢測數(shù)據(jù)文件。在Results下打開Amp plot窗口。選擇分析的目的樣品所在位置。將Base line數(shù)值改為start :3, stop :10,并打開manual設(shè)定Threshold
I.5 ±100000。雙擊 Rn 坐標(biāo)上數(shù)值打開 Graph settings 窗口，將 Post Run Settings 中Log 改為 Linear, OK 后打開 Analysis preferences 窗口，在 Analysis 菜單下選擇 Analyze自動(dòng)分析結(jié)果。實(shí)施例2應(yīng)用登革病毒/黃熱病毒/西尼羅病毒/基孔肯雅病毒鑒別檢測試劑盒檢測臨床樣品選取經(jīng)過病毒培養(yǎng)方法分別鑒定為登革病毒I型、登革病毒II型、登革病毒III型、登革病毒IV型、黃熱病毒、西尼羅病毒、基孔肯雅病毒陽性血清標(biāo)本各I例，以及經(jīng)病毒培養(yǎng)方法鑒定為乙型腦炎病毒、發(fā)熱伴血小板減少綜合征布尼亞病毒、漢灘病毒、漢城病毒陽性的血清樣本各I例作為特異性樣本，對(duì)所有樣本進(jìn)行核酸提取，PCR擴(kuò)增及結(jié)果分析步驟參照實(shí)施例I進(jìn)行，同時(shí)進(jìn)行陰，陽性質(zhì)控品的檢測。檢測結(jié)果陰性質(zhì)控品的擴(kuò)增曲線不呈S型(見附圖2)，陽性質(zhì)控品的擴(kuò)增曲線為明顯S型曲線(見附圖3，4，5，6)，陰、陽性質(zhì)控品均符合試劑盒的質(zhì)控要求，因此待檢標(biāo)本的檢測結(jié)果是有效的。由待檢標(biāo)本的檢測結(jié)果可知本試劑盒均檢測到相應(yīng)的登革病毒四種亞型、黃熱病毒、西尼羅病毒、基孔肯雅病毒核酸的擴(kuò)增(見附圖7，8，9，10);對(duì)乙型腦 炎病毒、發(fā)熱伴血小板減少綜合征布尼亞病毒、漢灘病毒、漢城病毒無非特異擴(kuò)增(見附圖11)。本次試驗(yàn)中11例標(biāo)本的檢測結(jié)果與病毒培養(yǎng)鑒定結(jié)果完全吻合，說明利用本試劑盒檢測及區(qū)分登革病毒、黃熱病毒、西尼羅病毒、基孔肯雅病毒是可行的。本試劑盒操作簡便，檢測時(shí)間短，可實(shí)現(xiàn)高通量檢測，加之其價(jià)格低廉，有望應(yīng)用于四種蟲媒傳播病原體的臨床檢測、檢驗(yàn)檢疫以及疫情監(jiān)測。
權(quán)利要求
1.一種登革病毒/黃熱病毒/西尼羅病毒/基孔肯雅病毒鑒別檢測試劑盒，包括1)RT-PCR反應(yīng)液、引物探針混合液、RT-PCR反應(yīng)酶系、DEPC H2O,陰性質(zhì)控品、陽性質(zhì)控品和2)分隔并集中包裝這些試劑瓶或管的包裝盒，其中引物探針混合液由一對(duì)登革病毒特異性的正、反向引物，一對(duì)黃熱病毒特異性的正、反向引物，一對(duì)西尼羅病毒特異性的正、反向引物，一對(duì)基孔肯雅病毒特異性的正、反向引物，一條登革病毒特異性的探針，一條黃熱病毒特異性的探針，一條西尼羅病毒特異性的探針，一條基孔肯雅病毒特異性的探針組成，其特征在于 登革病毒特異性的正向和反向引物的序列分別是5’ -GATTCTCAAAAGGATTGCTCTC-3’和5’ -ITGTTAGGAATGCTATGAAGGC-3’，登革病毒特異性的探針的序列是 5’ -catca+Cca+Att+Tca+Tgg+Gtc-3’ (堿基前含“ + ”表示該堿基為LNA修飾)，探針的兩端分別結(jié)合有熒光發(fā)生基團(tuán)FAM和熒光淬滅基團(tuán)BHQl ;該對(duì)引物探針可檢測登革病毒所有亞型，包括I型、II型、III型及IV型； 黃熱病毒特異性的正向和反向引物的序列分別是5’-AAACAAAACAAATTGGAAACAG-3’，和5’ -TITTCCAGTCAAAATGITGAAC-3’ 黃熱病毒特異性的探針的序列是 5’ -cttg+Aac+Acc+Tct+tgA+agG+Tcc-3’ (堿基前含“ + ”表示該堿基為LNA修飾)，探針的兩端分別結(jié)合有熒光發(fā)生基團(tuán)Cy5和熒光淬滅基團(tuán)Eclipse ； 西尼羅病毒特異性的正向和反向引物的序列分別是5 ’ -CCGCCACCGGAAGTTGA-3 ’和5’ -CGAGACGGTTCTGAGGGCT-3’，西尼羅病毒特異性的探針的序列是5’ -caa+Cccc+Agga+Ggact-3’ (堿基前含“ + ”表示該堿基為LNA修飾)，探針的兩端分別結(jié)合有熒光發(fā)生基團(tuán)ffiX和熒光淬滅基團(tuán)Eclipse。 基孔肯雅病毒特異性的正向和反向引物的序列分別是5，-GTGGGAGTACCGTATAAGACTC-3’和 5’ -CAGACAGAAGCTCCATCTCC-3，，基孔肯雅病毒特異性的探針的序列是5’ -cta+Cag+Ccc+Cat+Ggt+Act-3’ (喊基如含“ + ”表不該喊基為LNA修飾),探針的兩端分別結(jié)合有熒光發(fā)生基團(tuán)Texas Red和熒光淬滅基團(tuán)Eclipse。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征還在于所用探針采用特殊LNA標(biāo)記。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征還在于引物探針混合液中引物濃度均為0.2mmol/L,探針濃度均為 0. Immol /L
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征還在于RT-PCR反應(yīng)液由pH值為8.0的50mmol/LTris-HCl>8mmol/L MgCl2、250mmol/L KCl 組成。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其中RT-PCR反應(yīng)酶系由熱啟動(dòng)Taq酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、dNTPs組成，特征在于每人份RT-PCR反應(yīng)酶系中熱啟動(dòng)Taq酶的用量為5U，逆轉(zhuǎn)錄酶用量為 5U，dNTPs 為 IOmmol。
6.根據(jù)權(quán)利要求I的試劑盒，其特征還在于PCR擴(kuò)增的條件為50°C15分鐘，95°C 15分鐘；94°C 15 秒，55°C 45 秒，40 個(gè)循環(huán)；40°C 10 秒。
7.根據(jù)權(quán)利要求I的試劑盒，還提供了陰性質(zhì)控品和陽性質(zhì)控品，其特征在于陰性質(zhì)控品為生理鹽水，陽性質(zhì)控品為含有登革、黃熱、西尼羅、基孔肯雅這四種病毒核酸的DEPCH2O溶液，由四種病毒陽性核酸按照濃度為I. OX 105COpieS/mL濃度等體積比混合而成。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種四種蟲媒性傳播病原體鑒別檢測的試劑盒，特別是涉及一種利用多重實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)檢測登革病毒、黃熱病毒、西尼羅病毒、基孔肯雅病毒的試劑盒。本試劑盒主要包括RT-PCR反應(yīng)液、引物探針混合液、RT-PCR反應(yīng)酶系、DEPC H2O，以及分隔并集中包裝這些試劑瓶或管的包裝盒。由于本試劑盒能準(zhǔn)確區(qū)分登革病毒、黃熱病毒、西尼羅病毒以及基孔肯雅病毒，可廣泛應(yīng)用于由上述蟲媒傳播病毒所引起的鑒別診斷、檢驗(yàn)檢疫、疫情防控等多個(gè)領(lǐng)域。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102776297SQ20121028219
公開日2012年11月14日 申請(qǐng)日期2012年8月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月9日
發(fā)明者丁國允, 師永霞, 李小波, 李明, 鄭夔, 陳華云, 高秀潔, 黃吉城 申請(qǐng)人:中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司, 廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心