Bigh3在制備角膜營養(yǎng)不良動物模型中的應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及BIGH3在制備角膜營養(yǎng)不良動物模型中的應用。建立了一種遺傳穩(wěn)定、表型穩(wěn)定的角膜營養(yǎng)不良模型，它通過將非人哺乳動物的Bigh3蛋白的第124位由Arg突變?yōu)镠is而實現(xiàn)。以本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動物為研究模型，可在基因水平探討防治角膜營養(yǎng)不良疾病的可行性，為開展顆粒狀角膜營養(yǎng)不良的基因診斷及治療提供了研究基礎。
【專利說明】BIGH3在制備角膜營養(yǎng)不良動物模型中的應用
【技術(shù)領域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領域】；更具體地，本發(fā)明涉及BIGH3在制備角膜營養(yǎng)不良動物模型中的應用。
【背景技術(shù)】
[0002]角膜營養(yǎng)不良(Corneal Dystrophy)是一組與基因遺傳相關(guān)的原發(fā)性、進行性、致盲性角膜病變，是角膜遺傳疾病中常見的類型，迄今為止，穿透性角膜移植術(shù)仍是治療這種疾病的主要手段。但研究表明，穿透性角膜移植手術(shù)后仍會有角膜營養(yǎng)不良病情的復發(fā)和惡化(Yoo SY, Kim T, Lee SY, et al.A simple DNA chip for diagnosis of mostcommon corneal dystrophies caused by beta igh3gene mutations.Proceedings of thefrontiers in the convergence of Bioscience and Information Technologies，2007，69-74)o
[0003]目前已確定的與角膜營養(yǎng)不良相關(guān)的染色體有:1、5、9、10、12、16、17、20、21以及X 染色體。致病基因主要有 BIGH3、CHST6、K3、K12、M1S1、GSN 等(Klintworth GK.Advancesin the molecular genetics of corneal dystrophies.Am J Ophthalmol,1999,128 (6): 747-754)。角膜營養(yǎng)不良大多為常染色體顯性遺傳，少數(shù)為常染色體隱性遺傳或X染色體連鎖遺傳。
[0004]研究表明多種類型的角膜營養(yǎng)不良都與BIGH3 (TGFBI)基因的突變有關(guān)，因此通常這些由BIGH3基因突變所產(chǎn)生的角膜營養(yǎng)不良被稱為BIGH3基因相關(guān)性角膜營養(yǎng)不良。BIGH3基因又被稱為TGFBI基因，定位于5q31 (人類5號染色體長臂3區(qū)I帶)，基因跨度 30kb (Skonier J, Bennett K, Rothwell V, et al.Beta~igh3: a transforming growthfactor-beta responsive gene encoding a secreted protein that inhibits cellattachment invitro and suppresses the growth of CHO cells in nude mice[J].DNACell Biol 1994，13(6):571-584)。
[0005]目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)BIGH3基因存在多個突變且與疾病發(fā)生相關(guān)，對BIGH3基因的多個突變點都有研究。但是，對于BIGH3基因突變僅停留在各突變位點產(chǎn)生的表型性狀觀察，而對于BIGH3基因突變導致的角膜營養(yǎng)不良的發(fā)病機制研究主要集中在研究其基因突變位點的檢測，至今未見文獻報道關(guān)于BIGH3基因突變是否能夠成功建立疾病動物模型，以及是否可以獲得穩(wěn)定傳代的疾病動物模型。
[0006]由于在人類先天性眼病的研究中存在著許多限制性因素，對于人類的先天性角膜疾病的發(fā)生機制及致病基因的克隆等研究難度較大，成功建立疾病動物模型將會對其發(fā)病機制的研究帶來很大的幫助。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的在于提供BIGH3在制備角膜營養(yǎng)不良動物模型中的應用。
[0008]本發(fā)明的另一目的在于提供一種制備角膜營養(yǎng)不良動物模型的方法。[0009]在本發(fā)明的第一方面，提供一種制備轉(zhuǎn)基因非人哺乳動物的方法，所述方法包括:
[0010](I)提供一表達構(gòu)建物，該表達構(gòu)建物由5’ 一 3’依次包含以下操作性連接的元件:PGK啟動子，人突變型Bigh3基因，IRES基因；其中，所述的突變型Bigh3基因編碼的人Bigh3蛋白的第124位由Arg突變?yōu)镠is ；
[0011](2)將(I)的表達構(gòu)建物注射入非人哺乳動物受精卵細胞的雄原核，注射后的受精卵移植到假孕的非人哺乳動物的輸卵管中，使其受孕生產(chǎn)，獲得轉(zhuǎn)基因非人哺乳動物。
[0012]在一個優(yōu)選例中，所述的非人哺乳動物是小鼠或大鼠。
[0013]在另一優(yōu)選例中，步驟(1)中，在IRES基因的3’端，還包括:EGFP基因。
[0014]在另一優(yōu)選例中，步驟(1)中，在IRES基因的3’端，還包括:終止子。
[0015]在另一優(yōu)選例中，所述的人突變型Bigh3基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0016]在本發(fā)明的另一方面，提供所述的方法獲得的轉(zhuǎn)基因非人哺乳動物的用途，用于作為角膜營養(yǎng)不良的動物模型；或用于篩選預防和/或治療角膜營養(yǎng)不良的藥物。
[0017]在一個優(yōu)選例中，所述的角膜營養(yǎng)不良是顆粒狀角膜營養(yǎng)不良。
[0018]在本發(fā)明的另一方面，提供一種表達構(gòu)建物，該表達構(gòu)建物由5’ 一 3’依次包含以下操作性連接的元件:PGK啟動子，人突變型Bigh3基因，IRES基因；其中，所述的突變型Bigh3基因編碼的Bigh3蛋白的第124位由Arg突變?yōu)镠is。
[0019]在另一優(yōu)選例中，在IRES基因的3’端，還包括:EGFP基因和/或終止子。
[0020]在另一優(yōu)選例中，所述的表達構(gòu)建物是表達載體。
[0021]在本發(fā)明的另一方面，提供所述的表達構(gòu)建物的用途，用于制備角膜營養(yǎng)不良的轉(zhuǎn)基因非人哺乳動物。
[0022]本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]圖1、PGK-BIGH3 (M) -1RES-EGFP 重組表達質(zhì)粒示意圖。
[0024]圖2、pPGK_Bigh3 (M)-1RES-EGFP質(zhì)粒線性化及電泳圖；其中，
[0025]泳道1:質(zhì)粒 DNA of pPGK_Bigh3 (M)-1RES-EGFP ；
[0026]泳道2:質(zhì)粒DNA of pPGK_Bigh3 (M) -1RES-EGFP經(jīng)XbaI酶切線性化用于顯微注射的片段；
[0027]泳道MW:MBI GeneRuler Ikb DNA Ladder (晶美生物，Cat#SM0311)。
[0028]圖3、RT-PCR鑒定轉(zhuǎn)基因陽性F。代小鼠的情況，以人BIGH3基因陽性作為轉(zhuǎn)基因陽性的標志。
[0029]圖4、野生型小鼠的透明角膜。
[0030]圖5、M53小鼠Fl代小鼠呈現(xiàn)出混濁的角膜。
[0031]圖6、野生型小鼠的角膜的OCT圖像。
[0032]圖7、M53小鼠Fl代小鼠角膜的OCT圖像。
【具體實施方式】[0033]本發(fā)明人經(jīng)過深入而廣泛的研究，建立了一種遺傳穩(wěn)定、表型穩(wěn)定的角膜營養(yǎng)不良模型，它通過將非人哺乳動物的Bigh3蛋白的第124位由Arg突變?yōu)镠is而實現(xiàn)。以本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動物為研究模型，可在基因水平探討防治角膜營養(yǎng)不良疾病的可行性，為開展顆粒狀角膜營養(yǎng)不良的基因診斷及治療提供了研究基礎。在此基礎上完成了本發(fā)明。
[0034]本發(fā)明中，所述的非人哺乳動物可以選自:小鼠、大鼠、兔、狗、猿猴等；所述的非人哺乳動物在基因組的組成、個體的發(fā)育、代謝方式、器官解剖、疾病發(fā)病機制等方面和人類接近。優(yōu)選的，所述的非人哺乳動物是鼠；更優(yōu)選的是小鼠。
[0035]如本文所用，所述的“角膜營養(yǎng)不良”為一系列與家族遺傳有關(guān)的原發(fā)性進行性角膜病變的總稱。該病多數(shù)為常染色體顯性遺性；原發(fā)于角膜。
[0036]如本文所用，所述的“顆粒狀角膜營養(yǎng)不良”是角膜營養(yǎng)不良的一種，表現(xiàn)為角膜中央前彈力層下可見灰白色狀混濁，合并成大小不等、界限清楚的圓形或不規(guī)則團塊，形態(tài)各異，逐步向角膜實質(zhì)深層發(fā)展，晚期混濁塊之間出現(xiàn)彌漫性混濁，嚴重影響視力。
[0037]如本文所用，所述的“可操作地連接”或“操作性連接”是指兩個或多個核酸區(qū)域或核酸序列的功能性的空間排列。例如:啟動子區(qū)被置于相對于目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的轉(zhuǎn)錄受到該啟動子區(qū)域的引導，從而，啟動子區(qū)域被“可操作地連接”到該核酸序列上。
[0038]如本文所用，所述的“啟動子”或“啟動子區(qū)(域)”是指一種核酸序列，其通常存在于目的基因編碼序列的上游(5’端)，能夠引導核酸序列轉(zhuǎn)錄為mRNA。一般地，啟動子或啟動子區(qū)提供RNA聚合酶和正確起始轉(zhuǎn)錄所必需的其它因子的識別位點。在本文中，所述的啟動子或啟動子區(qū)包括啟動子的變體，其通過插入或刪除調(diào)控區(qū)域，進行隨機或定點突變等來獲得。
[0039]所述的轉(zhuǎn)基因非人哺乳動物的構(gòu)建方法包括:將一基因表達盒通過顯微注射的方法導入動物的受精卵中，培育所述受精卵從而獲得所述轉(zhuǎn)基因動物；其中，所述表達盒從5’到3’端依次具有以下元件:PGK啟動子，人突變型Bigh3基因，IRES基因；其中，所述的突變型Bigh3基因編碼的Bigh3蛋白的第124位由Arg突變?yōu)镠is。
[0040]所述的PGK啟動子為一種組成型啟動子，可在多個組織中廣泛表達，在轉(zhuǎn)基因模型的構(gòu)建中應用廣泛。
[0041]所述的Bigh3基因是一個與角膜營養(yǎng)不良密切相關(guān)的基因。然而，人們還沒有利用Bigh3基因突變來成功構(gòu)建角膜營養(yǎng)不良的動物模型。這是由于Bigh3基因上多個位點均可能與角膜營養(yǎng)不良相關(guān)，而哪個或哪些位點進行突變可以成功獲得性狀典型的動物模型是未知的。
[0042]本發(fā)明所述的突變型Bigh3基因具有SEQ ID NO:1所述的核苷酸序列，其編碼的Bigh3蛋白的第124位由Arg(R)突變?yōu)镠is。本發(fā)明還涉及所述“突變型Bigh3基因”的變異體，只要其編碼的Bigh3蛋白保留與野生型接近的氨基酸序列且第124位為His。此多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或非天然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個或多個核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實質(zhì)上改變其編碼的多肽(突變型Bigh3蛋白)的功能。
[0043]作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，在所述的表達盒中，還可設置報告基因。所述的報告基因例如可選自:熒光素酶編碼基因，綠色熒光蛋白編碼基因、或紅色熒光蛋白編碼基因。更優(yōu)選的，所述的報告基因是綠色熒光蛋白編碼基因。
[0044]所述的基因表達還包括終止子，適當終止子的選擇和構(gòu)建是本領域熟知的技術(shù)，本發(fā)明中可以采用本領域已知的終止子。
[0045]所述的基因表達盒被導入動物的受精卵中，通過培育所述受精卵從而獲得所述轉(zhuǎn)基因動物。培育受精卵使之生長發(fā)育通常需要將受精卵重新移植到母體的子宮內(nèi)進行，成熟后由母體分娩，從而獲得可遺傳的轉(zhuǎn)基因的動物品系。所述的轉(zhuǎn)基因動物還可通過交配，從而獲得后代動物，可從后代動物中找出基因組中攜帶所述表達盒的動物。
[0046]本發(fā)明還提供了所述轉(zhuǎn)基因動物的用途，所述的轉(zhuǎn)基因動物用于篩選預防或治療角膜營養(yǎng)不良的藥物。
[0047]此外，本發(fā)明還提供了一種來源于所述轉(zhuǎn)基因非人哺乳動物的細胞，所述的細胞的基因組中含有一基因表達盒，所述表達盒從5’到3’端依次具有以下元件:PGK啟動子，人突變型Bigh3基因，IRES基因；其中，所述的人突變型Bigh3基因編碼的Bigh3蛋白的第124位由Arg(R)突變?yōu)镠is。優(yōu)選地，所述的細胞為體細胞。
[0048]作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，以小鼠作為模式生物，和人類相比，它無論在基因組的組成、個體的發(fā)育、代謝方式、器官解剖、疾病發(fā)病機制等都和人類非常接近，因此可良好地應用于人類疾病發(fā)病機制、藥物藥理學研究等方面。
[0049]篩選方法
[0050]本發(fā)明利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，獲得含有突變型Bigh3基因的轉(zhuǎn)基因動物，可應用這種動物進行角膜營養(yǎng)不良疾病的研究以及防治藥物的篩選。利用本發(fā)明構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因動物模型篩選藥物，既有分子或者細胞篩選模型在機制研究方面的便利，又有動物模型在疾病模擬和藥物整體作用方面的優(yōu)勢，是藥物篩選和評價的良好模型，并且對于研究和篩選復合藥物，例如中藥及其復方的藥物篩選和研`究具有重要意義。
[0051]作為本發(fā)明的一個方面，提供了一種篩選具有防治角膜營養(yǎng)不良的潛在物質(zhì)(如化合物)的方法，所述方法包括步驟:(I)提供角膜營養(yǎng)不良的轉(zhuǎn)基因動物，所述的轉(zhuǎn)基因動物的基因組中含有一基因表達盒，所述表達盒從5’到3’端依次具有以下元件:PGK啟動子，人突變型Bigh3基因，IRES基因；其中，所述的突變型Bigh3基因編碼的Bigh3蛋白的第124位由Arg(R)突變?yōu)镠is ;⑵將候選物質(zhì)給予步驟(1)的轉(zhuǎn)基因動物；和(3)檢測動物的角膜狀況，若所述候選物質(zhì)的角膜狀況有顯著改善，則表明該候選物質(zhì)是防治角膜營養(yǎng)不良疾病的潛在物質(zhì)。
[0052]上述篩選出的潛在物質(zhì)可構(gòu)成一個篩選庫，可對這些物質(zhì)進行進一步的細胞實驗、動物試驗、和/或臨床試驗，以進一步確證所述潛在物質(zhì)的防治角膜營養(yǎng)不良的作用。
[0053]與利用傳統(tǒng)的動物模型進行藥物篩選相比較，利用本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因動物模型進行篩選能夠?qū)崿F(xiàn)成體通量地評價有關(guān)候選物質(zhì)。
[0054]本發(fā)明的主要優(yōu)點在于:
[0055](a)本發(fā)明獲得的角膜營養(yǎng)不良動物模型的遺傳穩(wěn)定、表型穩(wěn)定。
[0056](b)用本發(fā)明方法獲得的動物模型是可育的，發(fā)育正常；Bigh3 (R124H)突變基因的表達改變可以孟德爾規(guī)律遺傳給后代小鼠。
[0057]下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實驗指南，科學出版社中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。
[0058]除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。
[0059]實施例1、PGK-BIGH3 (M) -1RES-EGFP重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建
[0060]以PGK-Up和PGK-Down為引物，以PL451質(zhì)粒(獲自上海南方模式生物科技發(fā)展有限公司)DNA為模板，運用TaKaRa Ex Taq進行PCR，瓊脂糖凝膠電泳回收PCR擴增片段，得到兩側(cè)分別具有XhoI和SalI酶切位點的0.5kb的PGK啟動子片段。
[0061]PGK啟動子(Promoter)構(gòu)建引物序列:
[0062]PGK-Up:CGACTCGAGACCGGGTAGGGGAGGCGCTTT(SEQ ID NO:2)；
[0063]PGK-Down:GGCGTCGACTCGAAAGGCCCGGAGATGAGG(SEQ ID NO:3)。
[0064]將前述回收獲得的PGK啟動子片段與質(zhì)粒pCAG-1RES-EGFP (獲自上海南方模式生物科技發(fā)展有限公司)進行連接，經(jīng)XhoI和SalI雙酶切、連接、轉(zhuǎn)化，獲得pPGK-CAG-1RES-EGFP 重組質(zhì)粒。
[0065]質(zhì)粒pPGK-CAG-1RES-EGFP經(jīng)PhBI酶切，瓊脂糖凝膠電泳分離去除其中的CAG-啟動子片段，并膠回收載體片段，載體片段經(jīng)T4連接酶連接反應，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌以獲得pPGK-1RES-EGFP重組質(zhì)粒。
[0066]人Bigh3 cDNA,與pMD_T18 (獲自上海捷瑞生物技術(shù)有限公司)連接得到pMD-T18-Bigh3-Mutation質(zhì)粒(上海捷瑞生物技術(shù)有限公司制備)，DNA序列測定證實內(nèi)含的Bigh3 cDNA片段具有預期的140G — A的突變，該Bigh3Mutation cDNA片段經(jīng)SalI和SacII雙酶切pMD-T18-Bigh3-Mutation和電泳純化獲得，并與SalI和SacII雙酶切的pPGK-1RES-EGFP載體片段連接、轉(zhuǎn)化，獲得的重組質(zhì)粒載體命名為pPGK-Bigh3 (M) -1RES-EGFP。該質(zhì)粒載體結(jié)構(gòu)經(jīng)DNA序列測定證實構(gòu)建正確。
[0067]人突變型Bigh3的cDNA序列(SEQ ID NO:1)如下:
[0068]TTAGTCGACGCCACCATGGCGCTCTTCGTGCGGCTGCTGGCTCTCGCCCTGGCTCTGGCCCTGGGCCCCGCCGCGACCCTGGCGGGTCCCGCCAAGT |CAC| CCTACCAGCTGGTGCTGCAGCACAGCAGGCTCCGGGGCCGCCAGCACGGCCCCAACGTGTGTGCTGTGCAGAAGGTTATTGGCACTAATAGGAAGTACTTCACCAACTGCAAGCAGTGGTACCAAAGGAAAATCTGTGGCAAATCAACAGTCATCAGCTACGAGTGCTGTCCTGGATATGAAAAGGTCCCTGGGGAGAAGGGCTGTCCAGCAGCCCTACCACTCTCAAACCTTTACGAGACCCTGGGAGTCGTTGGATCCACCACCACTCAGCTGTACACGGACCGCACGGAGAAGCTGAGGCCTGAGATGGAGGGGCCCGGCAGCTTCACCATCTTCGCCCCTAGCAACGAGGCCTGGGCCTCCTTGCCAGCTGAAGTGCTGGACTCCCTGGTCAGCAATGTCAACATTGAGCTGCTCAATGCCCTCCGCTACCATATGGTGGGCAGGCGAGTCCTGACTGATGAGCTGAAACACGGCATGACCCTCACCTCTATGTACCAGAATTCCAACATCCAGATCCACCACTATCCTAATGGGATTGTAACTGTGAACTGTGCCCGGCTGCTGAAAGCCGACCACCATGCAACCAACGGGGTGGTGCACCTCATCGATAAGGTCATCTCCACCATCACCAACAACATCCAGCAGATCATTGAGATCGAGGACACCTTTGAGACCCTTCGGGCTGCTGTGGCTGCATCAGGGCTCAACACGATGCTTGAAGGTAACGGCCAGTACACGCTTTTGGCCCCGACCAATGAGGCCTTCGAGAAGATCCCTAGTGAGACTTTGAACCGTATCCTGGGCGACCCAGAAGCCCTGAGAGACCTGCTGAACAACCACATCTTGAAGTCAGCTATGTGTGCTGAAGCCATCGTTGCGGGGCTGTCTGTAGAGACCCTGGAGGGCACGACACTGGAGGTGGGCTGCAGCGGGGACATGCTCACTATCAACGGGAAGGCGAT
CATCTCCAATAAAGACATCCTAGCCACCAACGGGGTGATCCACTACATTGATGAGCTACTCATCCCAGACTCAGCCA
AGACACTATTTGAATTGGCTGCAGAGTCTGATGTGTCCACAGCCATTGACCTTTTCAGACAAGCCGGCCTCGGCAAT
CATCTCTCTGGAAGTGAGCGGTTGACCCTCCTGGCTCCCCTGAATTCTGTATTCAAAGATGGAACCCCTCCAATTGA
TGCCCATACAAGGAATTTGCTTCGGAACCACATAATTAAAGACCAGCTGGCCTCTAAGTATCTGTACCATGGACAGA
CCCTGGAAACTCTGGGCGGCAAAAAACTGAGAGTTTTTGTTTATCGTAATAGCCTCTGCATTGAGAACAGCTGCATC
GCGGCCCACGACAAGAGGGGGAGGTACGGGACCCTGTTCACGATGGACCGGGTGCTGACCCCCCCAATGGGGACTGT
CATGGATGTCCTGAAGGGAGACAATCGCTTTAGCATGCTGGTAGCTGCCATCCAGTCTGCAGGACTGACGGAGACCC
TCAACCGGGAAGGAGTCTACACAGTCTTTGCTCCCACAAATGAAGCCTTCCGAGCCCTGCCACCAAGAGAACGGAGC
AGACTCTTGGGAGATGCCAAGGAACTTGCCAACATCCTGAAATACCACATTGGTGATGAAATCCTGGTTAGCGGAGG
CATCGGGGCCCTGGTGCGGCTAAAGTCTCTCCAAGGTGACAAGCTGGAAGTCAGCTTGAAAAACAATGTGGTGAGTG
TCAACAAGGAGCCTGTTGCCGAGCCTGACATCATGGCCACAAATGGCGTGGTCCATGTCATCACCAATGTTCTGCAG
CCTCCAGCCAACAGACCTCAGGAAAGAGGGGATGAACTTGCAGACTCTGCGCTTGAGATCTTCAAACAAGCATCAGC
GTTTTCCAGGGCTTCCCAGAGGTCTGTGCGACTAGCCCCTGTCTATCAAAAGTTATTAGAGAGGATGAAGCATTAGT
AACCGCGGGCG
[0069]注:在野生型基礎上第突變點--第139-141位:C￡C CAC
[0070]pPGK-Bigh3 (M) -1RES-EGFP質(zhì)粒DNA，經(jīng)XbaI酶切、酚和氯仿分離純化后，用于顯微注射制備轉(zhuǎn)基因小鼠。pPGK-Bigh3 (M)-1RES-EGFP質(zhì)粒電泳結(jié)果如圖2。
[0071]實施例2、制備轉(zhuǎn)基因小鼠
[0072]選擇小鼠品系C57BL/6J (上海南方模式生物研究中心)，采用4~5周齡的雜交一代SPF級清潔小鼠(Fl)，采用雄原核注射方法，將上述構(gòu)建的表達質(zhì)粒線性化后注射到雄原核中；注射后的受精卵在體外培養(yǎng)I天后，選取分裂正常的受精卵移植到假孕小鼠的輸卵管中，使其受孕并等待出生。突變小鼠出生后，取少量尾端組織提取DNA，用PCR方法驗證是否有轉(zhuǎn)基因的導入，取PCR陽性的小鼠為首建者小鼠，分別和野生型C57BL/6J小鼠配種，建立穩(wěn)定的背景一致的轉(zhuǎn)基因小鼠品系。
[0073]結(jié)果，顯微注射出生81只R)代小鼠，于2-3周齡剪尾抽提基因組DNA，經(jīng)PCR篩選，得到5只轉(zhuǎn)基因陽性小鼠。陽性小鼠和3只野生型小鼠(Neg)再次剪尾抽提基因組DNA，雙盲法再次進行PCR檢測，確認該5只為轉(zhuǎn)基因陽性小鼠(M25、M28、M32、M53、M81)，其中雄性2只，雌性3只。轉(zhuǎn)基因小鼠的PCR鑒定結(jié)果的電泳圖如圖3。
[0074]轉(zhuǎn)基因小鼠鑒定引物序列(人R124H突變bigh3基因):
[0075]bigh3-Up:GACTAGCCCCTGTCTATCAAAAGTT(SEQ ID NO:4)；
[0076]bigh3-Down:AACCTCGACTAAACACATGTAAAGC(SEQ ID NO:5)。
[0077]目前R)代小鼠與野生型C57BL/6J雜交，PCR鑒定轉(zhuǎn)基因陽性小鼠共40只，肉眼可及角膜有白斑共10只，角膜及前節(jié)OCT表現(xiàn)如圖5和圖7，呈現(xiàn)角膜全層增厚，中央基質(zhì)層內(nèi)出現(xiàn)邊界清晰的灰白色混濁塊的表型。作為參照，野生型小鼠角膜如圖4和圖6所示。
[0078]綜上，本發(fā)明人成功建立BIGH3基因突變的顆粒狀角膜營養(yǎng)不良的小鼠模型，小鼠角膜上有明顯的白斑病變，其為典型的角膜營養(yǎng)不良癥狀。并且，這種病變能穩(wěn)定遺傳。
[0079]在本發(fā)明提 及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范 圍。
【權(quán)利要求】
1.一種制備轉(zhuǎn)基因非人哺乳動物的方法，其特征在于，所述方法包括: (1)提供一表達構(gòu)建物，該表達構(gòu)建物由5’一3’依次包含以下操作性連接的元件:PGK啟動子，人突變型Bigh3基因，IRES基因；其中，所述的突變型Bigh3基因編碼的人Bigh3蛋白的第124位由Arg突變?yōu)镠is ； (2)將(I)的表達構(gòu)建物注射入非人哺乳動物受精卵細胞的雄原核，注射后的受精卵移植到假孕的非人哺乳動物的輸卵管中，使其受孕生產(chǎn)，獲得轉(zhuǎn)基因非人哺乳動物。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的非人哺乳動物是小鼠或大鼠。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)中，在IRES基因的3’端，還包括:EGFP基因。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)中，在IRES基因的3’端，還包括:終止子。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的人突變型Bigh3基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1 所示。
6.權(quán)利要求1所述的方法獲得的轉(zhuǎn)基因非人哺乳動物的用途，用于作為角膜營養(yǎng)不良的動物模型；或用于篩選預防和/或治療角膜營養(yǎng)不良的藥物。
7.一種表達構(gòu)建物，其特征在于，該表達構(gòu)建物由5’一 3’依次包含以下操作性連接的元件:PGK啟動子，人突變型Bigh3基因，IRES基因；其中，所述的突變型Bigh3基因編碼的Bigh3蛋白的第124位由Arg突變?yōu)镠is。
8.如權(quán)利要求7所述的表達構(gòu)建物，其特征在于，在IRES基因的3’端，還包括:EGFP基因和/或終止子。
9.如權(quán)利要求7所述的表達構(gòu)建物，其特征在于，所述的表達構(gòu)建物是表達載體。
10.權(quán)利要求7-9任一所述的表達構(gòu)建物的用途,用于制備角膜營養(yǎng)不良的轉(zhuǎn)基因非人哺乳動物。
【文檔編號】C12N15/89GK103571874SQ201210282649
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2012年8月9日 優(yōu)先權(quán)日:2012年8月9日
【發(fā)明者】王方, 廖昕, 崔紅平 申請人:上海市第十人民醫(yī)院