專利名稱：加強(qiáng)促進(jìn)有機(jī)肥堆肥發(fā)酵菌劑的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
生物技術(shù)領(lǐng)域，本發(fā)明涉及一種加強(qiáng)促進(jìn)有機(jī)肥堆肥發(fā)酵過(guò)程的菌劑的制備方法。
背景技術(shù)：
在有機(jī)肥大量需要的今天，將雞糞、污泥和生活垃圾經(jīng)過(guò)堆肥化，轉(zhuǎn)化成腐熟的有機(jī)肥是發(fā)展趨勢(shì)。但是，在自然堆肥化過(guò)程中往往需要幾個(gè)月甚至幾年，不僅不能完全腐熟而且不斷散發(fā)出惡臭，污染周邊的環(huán)境，殘存有害病菌、蟲卵，直接施用，會(huì)造成土傳病害、蟲害。為了改變這種現(xiàn)狀，利用能降解含氨(胺)的菌群，把產(chǎn)生惡臭的物質(zhì)降解除去，同 時(shí)在堆肥化過(guò)程的各階段(室溫-中溫-高溫)，細(xì)菌與真菌配合促進(jìn)好氧發(fā)酵過(guò)程，即腐熟化的完成。在堆肥化過(guò)程完成后有效活菌數(shù)仍然有l(wèi)X108cfu/g。采用細(xì)菌-真菌配合加強(qiáng)促進(jìn)雞糞、污泥和垃圾堆肥化的菌劑及其高密度、高活性的生產(chǎn)エ藝還未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供ー種高密度、高活性的加強(qiáng)促進(jìn)堆肥化過(guò)程的菌劑的制備方法。本發(fā)明解決該技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是利用枯草芽孢桿菌CGMCC1.775 (Bacillus subtilis)、地衣芽孢桿菌CGMCC1. 91 (BaciIIusIicheniformis)、沼澤紅假單胞菌 CGMCC I. 2181 (Rhodopseudomonas palustris)、釀酒酵母 CGMCC2. I (Saccharomyces cerevisiae)和熱帶假絲酵母 CGMCC2. 563 (Candidatropicalis)，都是能產(chǎn)生氧化物酶、脫氫酶等和脂多糖類表面活性劑的菌，能夠在接近堆肥物料顆粒的同時(shí)逐步降解含氨(胺)組分，從而達(dá)到除臭、促進(jìn)堆肥化的目的；因?yàn)檫@五種菌都源于土壤，所以在進(jìn)入物料后能很快形成優(yōu)勢(shì)菌群，占據(jù)一定生態(tài)位。將五種菌經(jīng)優(yōu)化組合組成復(fù)合菌群，經(jīng)活化和三級(jí)液體擴(kuò)大培養(yǎng)并吸附、固定化于草炭上制備成固體菌齊U。其中各組分的質(zhì)量配比基本上是I :1:1:1:1.這五種菌都是農(nóng)業(yè)部允許使用的安全、無(wú)害的菌。五株菌種均購(gòu)于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)。加強(qiáng)促進(jìn)堆肥化的菌制劑的制備方法包括下述步驟I.將冰箱2-4°C保存的各斜面菌種活化，分別試管-搖瓶培養(yǎng)；枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和沼澤紅假單胞菌用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基培養(yǎng)(配方牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，蒸餾水lOOOmL，pH值7. 2-7. 4)。釀酒酵母和熱帶假絲酵母用馬鈴薯-蔗糖培養(yǎng)基培養(yǎng)(配方去皮、去殘馬鈴薯200g，切絲或切片，用約IOOOmL自來(lái)水，80-100°C煮30min，雙層紗布過(guò)濾，得到IOOOmL濾液(不足部分用自來(lái)水補(bǔ)充)，加入蔗糖20g，自然pH值)。培養(yǎng)基滅菌:0. lMpa，121°C，滅菌30min ;接種后，150_200r/min振搖，28 30°C培養(yǎng)24-48h ；2.將上述搖瓶培養(yǎng)的各種子菌液混合，ニ級(jí)液體擴(kuò)大培養(yǎng)(30L發(fā)酵罐)，以玉米面-豆柏培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)(配方玉米面30g，豆柏20g，硝酸鉀10g，硫酸鎂0. 5g，磷酸氫ニ鉀0. 5g，氯化鈉0. 5g，硫酸亞鐵0. OOlg,自來(lái)水lOOOmL，用氫氧化鈣調(diào)節(jié)pH值7. 4-7. 8)。培養(yǎng)基滅菌0. IMpa, 121 °C，滅菌30min ;接種量按質(zhì)量百分比5 % 10 %，300r/min攪拌，6-8L/min通氣量，28 30°C培養(yǎng)20 24h ;用顯微計(jì)數(shù)法(稀釋100倍，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù))和分光光度法測(cè)定發(fā)酵液的吸光值(稀釋100倍，在660nm波長(zhǎng)下，測(cè)定吸光值)，以檢測(cè)菌群生長(zhǎng)情況。達(dá)到吸光值最大或菌群數(shù)最多，停止培養(yǎng)，轉(zhuǎn)入下ー級(jí)培養(yǎng)。3.培養(yǎng)基同上，再經(jīng)三級(jí)液體擴(kuò)大培養(yǎng)(300L發(fā)酵罐)，接種量按質(zhì)量百分比5% 10%，200r/min攪拌，10_15L/min通氣量，28 30°C培養(yǎng)20 24h ;用顯微計(jì)數(shù)法和分光光度法測(cè)定發(fā)酵液的吸光值和菌群數(shù)，以檢測(cè)菌群生長(zhǎng)情況。達(dá)到吸光值最大，菌液達(dá)到 1-5X 10lclcfu/mL，停止培養(yǎng)。4.以草炭粉末為載體將混合菌群均勻吸附、固定化于4 5倍草炭上，做成固體菌齊U。 5.菌劑密封于內(nèi)襯聚こ烯的包裝袋內(nèi)，室溫保存，避暴曬、避高溫、高濕。6 保質(zhì)期I年。本發(fā)明的有益效果I)將復(fù)合菌固定化于草炭上，使每克菌劑的有效菌菌落數(shù)(Cfu)可高達(dá)10個(gè)億以上(即I 5X 109cfu/g)，幾乎達(dá)到了最大可能數(shù)，至今還未見如此高含菌量菌制劑的報(bào)道.草炭不僅能為所擴(kuò)大培養(yǎng)菌提供一些營(yíng)養(yǎng)成分，還由于其網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，具有較大的比表面積，所以能在単位體積內(nèi)附著、吸附固定化較多的菌體。因此，一定量的有效菌菌劑一旦均勻加入堆肥物料中就可以很快形成優(yōu)勢(shì)菌群，發(fā)揮除臭、促進(jìn)堆肥化過(guò)程的作用。2)因?yàn)槎逊饰锪现械膼撼艚M分成分復(fù)雜，單ー的菌或少量的菌是難以完全轉(zhuǎn)化、降解的。惡臭組分的完全降解必須由多種微生物產(chǎn)生多種酶才能最終降解、轉(zhuǎn)化為水和ニ氧化碳。3)惡臭的測(cè)定方法文字描述法(《水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法》，中國(guó)環(huán)境科學(xué)出版社，2002，第四版)。
具體實(shí)施方案實(shí)施例I按下列步驟進(jìn)行I)將4°C保存的五支菌種斜面活化，分別試管-搖瓶培養(yǎng)?？莶菅挎邨U菌、地衣芽孢桿菌和沼澤紅假單胞菌三支細(xì)菌用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基培養(yǎng)(配方牛肉膏5g，蛋白胨IOg,氯化鈉5g,蒸懼水lOOOmL, pH值7. 2-7. 4)。釀酒酵母和熱帶假絲酵母ニ支真菌用馬鈴薯-蔗糖培養(yǎng)基培養(yǎng)[配方去皮、去殘馬鈴薯200g，切絲或切片，用約IOOOmL自來(lái)水，80-100°C煮30min，雙層紗布過(guò)濾，得到IOOOmL濾液(不足部分用自來(lái)水補(bǔ)充)，加入蔗糖20g,自然pH值]。培養(yǎng)基滅菌0. IMpa, 121°C,滅菌30min ；接種后，200r/minz振搖，28 V 培養(yǎng) 24h。2) ニ級(jí)液體擴(kuò)大培養(yǎng)(30L)，以玉米面-豆柏培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)(配方玉米面30g，豆柏20g，硝酸鉀10g，硫酸鎂0. 5g，磷酸氫ニ鉀0. 5g，氯化鈉0. 5g，硫酸亞鐵0. OOlg,自來(lái)水IOOOmL,用氫氧化鈣調(diào)節(jié)pH值7. 4-7. 8)。培養(yǎng)基滅菌0. IMpa，121°C，滅菌30min ;接種量5% 10%，300r/min攪拌，6-8L/min通氣量，28 30°C培養(yǎng)20 24h ;用顯微計(jì)數(shù)法(稀釋100倍，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù))和分光光度法測(cè)定發(fā)酵液的吸光值(稀釋100倍，在660nm波長(zhǎng)下，測(cè)定吸光值)，以檢測(cè)菌群生長(zhǎng)情況。達(dá)到吸光值最大或菌群數(shù)最多，停止培養(yǎng)，轉(zhuǎn)入下ー級(jí)培養(yǎng)。3)培養(yǎng)基同上，再經(jīng)三級(jí)液體擴(kuò)大培養(yǎng)(300L)，接種量5% 10%，200r/min攪拌，10L/min通氣量，28 30°C培養(yǎng)20 24h ;用顯微計(jì)數(shù)法和分光光度法測(cè)定發(fā)酵液的吸光值和菌群數(shù)，以檢測(cè)菌群生長(zhǎng)情況。達(dá)到吸光值最大，菌液達(dá)到l-5X101(lCfu/mL，停止培養(yǎng)。4)以草炭粉末為載體將混合菌群均勻吸附、固定化于4 5倍草炭上，做成固體菌齊U。有效菌菌群數(shù)達(dá)3*108cfu/g.5)菌劑密封于內(nèi)襯聚こ烯的包裝袋內(nèi)，室溫保存，避暴曬、避高溫、潮濕。實(shí)施例2按下列步驟進(jìn)行I)將4°C保存的五種菌種斜面活化，分別試管-搖瓶培養(yǎng)?？莶菅挎邨U菌、地衣芽孢桿菌和沼澤紅假單胞菌三支細(xì)菌用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基培養(yǎng)(配方牛肉膏5g，蛋白胨IOg,氯化鈉5g,蒸懼水lOOOmL, pH值7. 2-7. 4)。釀酒酵母和熱帶假絲酵母ニ支真菌用馬鈴薯-蔗糖培養(yǎng)基培養(yǎng)[配方去皮、去殘馬鈴薯200g，切絲或切片，用約IOOOmL自來(lái)水，80-100°C煮30min，雙層紗布過(guò)濾，得到IOOOmL濾液(不足部分用自來(lái)水補(bǔ)充)，加入蔗糖20g,自然pH值]。培養(yǎng)基滅菌0. IMpa, 121°C,滅菌30min ；接種后，200r/minz振搖，28 V 培養(yǎng) 24h。2) ニ級(jí)液體擴(kuò)大培養(yǎng)(50L發(fā)酵罐)，以玉米面-豆柏培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)(配方玉米面30g,豆柏20g,硝酸鉀IOg,硫酸鎂0. 5g,磷酸氫ニ鉀0. 5g,氯化鈉0. 5g,硫酸亞鐵0. OOlg,自來(lái)水lOOOmL，用氫氧化鈣調(diào)節(jié)pH值7. 4-7.8)。培養(yǎng)基滅菌:0. IMpa，121°C，滅菌30min ;接種量5%，300r/min攪拌，8L/min通氣量，28 30°C培養(yǎng)20h ;用顯微計(jì)數(shù)法(稀釋100倍，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù))和分光光度法測(cè)定發(fā)酵液的吸光值(稀釋100倍，在660nm波長(zhǎng)下，測(cè)定吸光值)，以檢測(cè)菌群生長(zhǎng)情況。達(dá)到吸光值最大或菌群數(shù)最多，停止培養(yǎng)，轉(zhuǎn)入下ー級(jí)培養(yǎng)。3)培養(yǎng)基同上，再經(jīng)三級(jí)液體擴(kuò)大培養(yǎng)(500L發(fā)酵罐)，接種量10%，200r/min攪拌，14L/min通氣量，28 30°C培養(yǎng)23h ;用顯微計(jì)數(shù)法和分光光度法測(cè)定發(fā)酵液的吸光值和菌群數(shù)，以檢測(cè)菌群生長(zhǎng)情況。達(dá)到吸光值最大，菌液達(dá)到l-5X101(lCfu/mL，停止培養(yǎng)。4)以草炭粉末為載體將混合菌群均勻吸附、固定化于4 5倍草炭上，做成固體菌齊U。有效菌菌群數(shù)達(dá)5*108cfu/g.5)菌劑密封于內(nèi)襯聚こ烯的包裝袋內(nèi)，室溫保存，避暴曬、避高溫、潮濕。實(shí)施例3按下列步驟進(jìn)行I)將4°C保存的五支菌種斜面活化，分別試管-搖瓶培養(yǎng)?？莶菅挎邨U菌、地衣芽孢桿菌和沼澤紅假單胞菌三支細(xì)菌用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基培養(yǎng)(配方牛肉膏5g，蛋白胨IOg,氯化鈉5g,蒸懼水lOOOmL, pH值7. 2-7. 4)。釀酒酵母和熱帶假絲酵母ニ支真菌用馬鈴薯-蔗糖培養(yǎng)基培養(yǎng)[配方去皮、去殘馬鈴薯200g，切絲或切片，用約IOOOmL自來(lái)水，80-100°C煮30min，雙層紗布過(guò)濾，得到IOOOmL濾液(不足部分用自來(lái)水補(bǔ)充)，加入蔗糖20g,自然pH值]。培養(yǎng)基滅菌0. IMpa, 121°C,滅菌30min ；接種后，200r/minz振搖，28 V 培養(yǎng) 24h。2) ニ級(jí)液體擴(kuò)大培養(yǎng)(20L)，以玉米面-豆柏培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)(配方玉米面30g，豆柏20g，硝酸鉀10g，硫酸鎂0. 5g，磷酸氫ニ鉀0. 5g，氯化鈉0. 5g，硫酸亞鐵0. OOlg,自來(lái)水IOOOmL,用氫氧化鈣調(diào)節(jié)pH值7. 4-7. 8)。培養(yǎng)基滅菌0. IMpa，121°C，滅菌30min ;接種量5%，300r/min攪拌，8L/min通氣量，28 30°C培養(yǎng)24h ;用顯微計(jì)數(shù)法(稀釋100倍，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù))和分光光度法測(cè)定發(fā)酵液的吸光值(稀釋100倍，在660nm波長(zhǎng)下，測(cè)定吸光值)，以檢測(cè)菌群生長(zhǎng)情況。達(dá)到吸光值最大或菌群數(shù)最多，停止培養(yǎng)，轉(zhuǎn)入下ー級(jí)培養(yǎng)。3)培養(yǎng)基同上，再經(jīng)三級(jí)液體擴(kuò)大培養(yǎng)(200L)，接種量10%，200r/min攪拌，15L/min通氣量，28 30°C培養(yǎng)22h ;用顯微計(jì)數(shù)法和分光光度法測(cè)定發(fā)酵液的吸光值和菌群數(shù)，以檢測(cè)菌群生長(zhǎng)情況。達(dá)到吸光值最大，菌液達(dá)到l-5X101(lCfu/mL，停止培養(yǎng)。 4)以草炭粉末為載體將混合菌群均勻吸附、固定化于4 5倍草炭上，做成固體菌齊U。有效菌菌群數(shù)達(dá)5*108cfu/g.5)菌劑密封于內(nèi)襯聚こ烯的包裝袋內(nèi)，室溫保存，避暴曬、避高溫、潮濕。實(shí)驗(yàn)效果以雞糞堆肥化為例。實(shí)驗(yàn)時(shí)間、地點(diǎn)2011年7-8月，新疆喀什葉城縣金秋實(shí)業(yè)生物肥有限公司實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)將10噸鮮雞糞，加入適量草炭，調(diào)節(jié)雞糞含水率至60% (經(jīng)驗(yàn)法用手攥手指縫之間無(wú)液體滴出，松手后雞糞團(tuán)落地能自然散開)，用鏟車堆積成條垛狀，加入IOOkg促進(jìn)堆肥發(fā)酵的固體菌劑(約1% )，再用翻拋機(jī)翻倒I次，使菌劑與雞糞混合均勻。室溫放置。同時(shí)，另將10噸鮮雞糞只加入草炭調(diào)節(jié)含水率至60%，井比實(shí)驗(yàn)組多加IOOkg草炭，同樣用翻拋機(jī)翻倒I次，與實(shí)驗(yàn)組在完全相同的場(chǎng)地，室溫放置，作為對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)組堆肥第二天溫度升至70°C，第三天升至75°C，臭味全無(wú)(多人嗅聞，文字描述法)。為減少氮損失，從第三天開始，每天用翻拋機(jī)翻倒I次，至第七天溫度才開始下降，完成堆肥過(guò)程。發(fā)酵后的雞糞有機(jī)肥養(yǎng)分含量和衛(wèi)生條件都符合農(nóng)業(yè)部有機(jī)肥標(biāo)準(zhǔn)NY525-2011 標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)照組堆肥的第五天溫度才升至65°C，翻倒后溫度很快降低，臭味仍然很濃(方法同，多人嗅聞)。堆肥發(fā)酵七天后檢驗(yàn)，衛(wèi)生條件仍然達(dá)不到NY525-2011標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)菌劑確有除臭、促進(jìn)堆肥發(fā)酵過(guò)程的作用。
權(quán)利要求
1.一種加強(qiáng)促進(jìn)有機(jī)肥堆肥發(fā)酵過(guò)程的菌劑，其特征在于該菌劑由枯草芽孢桿菌 CGMCC1. 775(Bacillus subtilis)、地衣芽孢桿菌 CGMCC1. 91(Bacilluslicheniformis)、沼澤紅假單胞菌 CGMCC1. 2181 (Rhodopseudomonas palustris)、釀酒酵母 CGMCC2. I(Saccharomyces cerevisiae)和熱帶假絲酵母 CGMCC2. 563(Candidatropicalis)組合而成的復(fù)合菌群,其中各菌組分的質(zhì)量比是I : I : I : I : I。
2.如權(quán)利要求I所述的能夠加強(qiáng)促進(jìn)有機(jī)肥堆肥發(fā)酵過(guò)程的菌制劑的制備方法，其特征在于它包括下述步驟 1)將冰箱2-4°C保存的各斜面菌種活化，分別進(jìn)行試管-搖瓶培養(yǎng)；枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和沼澤紅假單胞菌用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基培養(yǎng)，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基配方為牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，蒸餾水lOOOmL，pH值7. 2-7. 4 ;釀酒酵母和熱帶假絲酵母用馬鈴薯-蔗糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，馬鈴薯-蔗糖培養(yǎng)基配方為去皮去殘馬鈴薯200g，切絲或切片，用IOOOmL自來(lái)水，80-100°C煮30min，雙層紗布過(guò)濾，得到IOOOmL濾液，不足部分用自來(lái)水補(bǔ)充，加入蔗糖20g，自然pH值；培養(yǎng)基滅菌:0. lMpa，121°C，滅菌30min ;接種后，150-200r/min 振搖，28 30°C培養(yǎng) 24_48h ； 2)將上述搖瓶培養(yǎng)的各菌種子液混合，二級(jí)液體擴(kuò)大培養(yǎng)，用30L發(fā)酵罐，以玉米面-豆柏培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)，玉米面-豆柏培養(yǎng)基配方為玉米面30g，豆柏20g，硝酸鉀10g，硫酸鎂0. 5g,磷酸氫二鉀0. 5g,氯化鈉0. 5g,硫酸亞鐵0. OOlg,自來(lái)水IOOOmL,用氫氧化隹丐調(diào)節(jié)pH值7. 4-7. 8 ;培養(yǎng)基滅菌0. lMpa，121°C，滅菌30min ;接種量按質(zhì)量百分比5% 10%,300r/min 攪拌，6_8L/min 通氣量，28 30°C培養(yǎng) 20 24h ； 3)再經(jīng)三級(jí)液體擴(kuò)大培養(yǎng)，用300L發(fā)酵罐，擴(kuò)大培養(yǎng)基同上，接種量按質(zhì)量百分比為5% 10%，200r/min 攪拌，10_15L/min 通氣量，28 30°C培養(yǎng) 20 24h ； 4)以草炭為載體將三級(jí)液體擴(kuò)大培養(yǎng)的混合菌液均勻吸附、固定化于4-5倍的草炭上； 5)密封于內(nèi)襯聚乙烯的包裝袋內(nèi)，室溫保存，避暴曬、避高溫、避潮濕，保質(zhì)期I年。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種加強(qiáng)促進(jìn)有機(jī)肥堆肥發(fā)酵菌劑的制備方法。具有對(duì)雞糞、污泥以及垃圾堆肥化促進(jìn)作用的菌劑是由枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、沼澤紅假單胞菌、釀酒酵母和熱帶假絲酵母組成的復(fù)合菌群，其中各組分的質(zhì)量配比基本上為1∶1∶1∶1∶1。本發(fā)明的積極效果在于加入0.5-1％的菌劑于堆肥物料(雞糞、污泥或生活垃圾)后能很快形成微生態(tài)優(yōu)勢(shì)菌群。對(duì)于含水率50％-60％的堆肥物料，常溫條件下，第二天就消除臭味(文字描述法測(cè)定)，堆肥化過(guò)程5-7天就完成。菌劑的有效活菌數(shù)高，適應(yīng)性強(qiáng)，對(duì)消除臭味、促進(jìn)堆肥化過(guò)程具有明顯的作用。
文檔編號(hào)C12R1/01GK102796668SQ201210286818
公開日2012年11月28日 申請(qǐng)日期2012年8月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月14日
發(fā)明者張清敏, 劉志軍, 李明, 張彥峰 申請(qǐng)人:葉城縣金秋實(shí)業(yè)生物肥有限公司