專利名稱：一種大腸桿菌胞外生產(chǎn)外源蛋白的集成化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及改造大腸桿菌染色體基因使之作為外源蛋白生產(chǎn)的細(xì)胞工廠，確切地說是一種大腸桿菌胞外生產(chǎn)外源蛋白的集成化方法。
背景技術(shù)：
重組蛋白藥物市場(chǎng)增長(zhǎng)迅猛，已成為一個(gè)巨大的高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)。其中重要的重組蛋白藥物有細(xì)胞因子，蛋白類激素，酶和抗體等。但因這些藥物生產(chǎn)成本高，找到高效低成本的生物系統(tǒng)與生產(chǎn)工藝尤為必要。重組蛋白的生產(chǎn)通常使用微生物系統(tǒng)。微生物系統(tǒng)具有生長(zhǎng)快與成本低的優(yōu)點(diǎn)。 大腸桿菌是使用最廣泛的微生物系統(tǒng)。在大腸桿菌系統(tǒng)中，根據(jù)重組蛋白表達(dá)后的空間定位，可分為胞內(nèi)表達(dá)與胞外表達(dá)。胞外表達(dá)正常情況下為可溶性產(chǎn)物。胞內(nèi)表達(dá)又可分為胞質(zhì)中表達(dá)與周質(zhì)空間表達(dá)，且常形成包涵體。胞外表達(dá)與周質(zhì)空間表達(dá)的蛋白較少受到蛋白酶的降解，有利于目標(biāo)產(chǎn)物的積累。大腸桿菌有多種轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)將蛋白分泌至周質(zhì)空間，最常用的是Sec系統(tǒng)。但大腸桿菌缺乏天然的胞外分泌機(jī)制，絕大多數(shù)外源蛋白無法分泌到胞外。胞內(nèi)重組蛋白藥物常規(guī)生產(chǎn)工藝包括菌株構(gòu)建、發(fā)酵、破壁、蛋白分離與精制。但因胞內(nèi)雜蛋白成分復(fù)雜、易形成無活性的包涵體，因而分離成本高、產(chǎn)率低。特別是胞內(nèi)表達(dá)需要破碎細(xì)胞，而導(dǎo)致產(chǎn)品中存在磷脂多醇與蛋白復(fù)合物等熱原成份，嚴(yán)重影響藥品生產(chǎn)。因此，一種通用、高產(chǎn)、簡(jiǎn)便和高效而穩(wěn)定的生產(chǎn)體系亟待建立。目前，僅少量文獻(xiàn)報(bào)道了大腸桿菌胞外生產(chǎn)重組蛋白的方法。且多為理化誘變的方法，可以篩選到胞外高產(chǎn)突變株，但該方法篩選過程復(fù)雜，機(jī)理不明，重復(fù)性差。理論上，遺傳性改造可使大腸桿菌和沙門氏菌等革蘭氏陰性菌的細(xì)胞外膜缺陷，導(dǎo)致周質(zhì)空間蛋白部分釋放到培養(yǎng)基中。使用滲漏菌株進(jìn)行胞外蛋白的生產(chǎn)鮮有報(bào)道。如大腸桿菌的T/7/7基因突變體可以將周質(zhì)空間蛋白滲漏至培養(yǎng)基中，但目標(biāo)蛋白的滲漏比率及其產(chǎn)量仍然有提聞的空間。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種大腸桿菌重組蛋白的發(fā)酵和胞外分泌同時(shí)進(jìn)行的重組蛋白生產(chǎn)方法，通過遺傳改造的方法得到細(xì)胞壁或膜的通透性增強(qiáng)的分泌型菌株，并將胞內(nèi)合成的目標(biāo)蛋白質(zhì)通過信號(hào)肽或融合蛋白(如硫氧還蛋白等)導(dǎo)入到細(xì)胞周質(zhì)空間，進(jìn)而選擇性地滲漏至培養(yǎng)基中，提高表達(dá)水平和降低分離成本成為本發(fā)明的目的。—種大腸桿菌胞外生產(chǎn)外源蛋白的集成化方法，其特征在于包括單基因突變的分泌型大腸桿菌的菌株構(gòu)建、外源蛋白表達(dá)的分泌型重組大腸桿菌的菌株構(gòu)建及分泌型重組大腸桿菌的目標(biāo)蛋白表達(dá)過程；
所述的單基因突變的分泌型大腸桿菌的菌株構(gòu)建方法為使用預(yù)先設(shè)計(jì)的細(xì)胞膜蛋白或細(xì)胞壁合成酶基因pal或mrcB, mrcA, mrdA, murC, rodA, rodZ中的一種單基因敲除引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到兩端為10 250 bp特定目標(biāo)基因同源序列及中間為氯霉素抗性標(biāo)記序列的濃度為 I 1000 ng/μ 的或mrcB,mrcA,mrdA,murC,rodA,rodZ 中飽一種基因打靶片段，并整合到宿主大腸桿菌染色體中，得到分泌型大腸桿菌菌株。所述的一種大腸桿菌胞外生產(chǎn)外源蛋白的集成化方法，其特征在于所述的單基因突變的分泌型大腸桿菌的菌株含有的基因/^7編碼區(qū)發(fā)生了突變，或者基因的啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)生了突變，從而使/^7基因無法表達(dá)出相應(yīng)的Pal蛋白產(chǎn)物，或表達(dá)出降低了功能的Pal蛋白產(chǎn)物，進(jìn)而正常的細(xì)胞膜運(yùn)輸功能發(fā)生變化。所述的一種大腸桿菌胞外生產(chǎn)外源蛋白的集成化方法，其特征在于所述的外源蛋白表達(dá)的分泌型重組大腸桿菌菌株構(gòu)建方法為將外源目標(biāo)蛋白質(zhì)基因先重組到分泌型質(zhì)粒中，隨后克隆到該分泌型大腸桿菌中，進(jìn)而得到分泌型重組大腸桿菌菌株。所述的一種大腸桿菌胞外生產(chǎn)外源蛋白的集成化方法，其特征在于所述的外源蛋白表達(dá)的分泌型重組大腸桿菌菌株含有編碼外源蛋白的重組基因質(zhì)粒，該重組質(zhì)粒中外源蛋白基因與定位于周質(zhì)空間的信號(hào)肽編碼序列相連，從而使胞內(nèi)合成的外源蛋白通過信 號(hào)肽導(dǎo)入于周質(zhì)空間進(jìn)而滲漏到培養(yǎng)基中。所述的一種用于重組蛋白分泌型表達(dá)的大腸桿菌構(gòu)建方法，其特征在于所述的分泌型重組大腸桿菌的目標(biāo)蛋白表達(dá)過程指的是在發(fā)酵培養(yǎng)基中使用外源蛋白表達(dá)的分泌型重組大腸桿菌菌株生產(chǎn)外源蛋白。所述的一種用于重組蛋白分泌型表達(dá)的大腸桿菌構(gòu)建方法，其特征在于所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中含有0. I 2%胰蛋白胨，O. 2 10%酵母提取粉，O. 05 5%甘油，O. 02
O.5% KH2PO4,0. I 2% K2HPO4。本發(fā)明的原理為
本發(fā)明所說的大腸桿菌胞外生產(chǎn)重組蛋白的方法，主要包括構(gòu)建特定的細(xì)胞膜或細(xì)胞壁改變的分泌型重組大腸桿菌生產(chǎn)菌株和在發(fā)酵培養(yǎng)基中使用該特定生產(chǎn)菌株胞外生產(chǎn)外源蛋白。其特征在于，使用預(yù)先設(shè)計(jì)的/^7基因敲除引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到兩端為10 250 bp特定目標(biāo)基因同源序列及中間為氯霉素抗性標(biāo)記序列的高濃度(10 1000ng/H)pal基因打靶片段。并將其作為突變工具電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入到經(jīng)過誘導(dǎo)的含PKD46的待突變大腸桿菌出發(fā)菌株中，從而實(shí)現(xiàn)/^7基因的突變。其中所說的細(xì)胞膜或細(xì)胞壁改變的分泌型重組大腸桿菌生產(chǎn)菌株指'pal, mrCA,mrcB, mrdA, rodA, murC, rodZ等基因編碼區(qū)的核苷酸缺失或替換；或在基因的啟動(dòng)子區(qū)域的核苷酸缺失或替換的突變菌株。優(yōu)選和基因突變。集成化方法指的是將各技術(shù)整合在一起。本發(fā)明的有益效果
I、本發(fā)明提供了大腸桿菌滲漏發(fā)酵重組蛋白的一種新途徑，并提高了目標(biāo)蛋白的滲漏比率和產(chǎn)量。2、本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了重組蛋白發(fā)酵和胞外分泌同時(shí)進(jìn)行。在發(fā)酵過程中，重組目標(biāo)蛋白可以從胞內(nèi)滲漏且不顯著影響菌體的持續(xù)生長(zhǎng)，降低了目標(biāo)蛋白的胞內(nèi)降解，提高了重組蛋白表達(dá)；同時(shí)減少了重組蛋白的胞內(nèi)過度積累，而降低了包涵體形成；消除了細(xì)胞破壁工藝，減少了熱原污染；設(shè)計(jì)培養(yǎng)基組成，便于分離純化，進(jìn)而達(dá)到降低了生產(chǎn)成本，提高產(chǎn)品質(zhì)量的目的。滲漏不僅簡(jiǎn)化了純化重組蛋白的工藝，也提高了目標(biāo)產(chǎn)物的表達(dá)水平。經(jīng)檢測(cè)，超過40%的重組蛋白滲漏到培養(yǎng)基中，表達(dá)水平為10 30%。3、本發(fā)明采用大腸桿菌的或fflrcS等基因突變株為宿主和定位于周質(zhì)空間的重組蛋白質(zhì)粒，使得重組蛋白的發(fā)酵和胞外分泌同時(shí)進(jìn)行。從而實(shí)現(xiàn)降低目標(biāo)蛋白的胞內(nèi)降解，提高重組蛋白表達(dá)；同時(shí)減少重組蛋白的胞內(nèi)過度積累，而降低包涵體形成；消除細(xì)胞破壁工藝，減少熱原污染，方便分離純化；進(jìn)而達(dá)到降低生產(chǎn)成本，提高產(chǎn)品表達(dá)及質(zhì)量的目的。經(jīng)檢測(cè),超過40%的重組蛋白滲漏到培養(yǎng)基中，表達(dá)水平為10 30%。


圖I為單基因敲除突變株目標(biāo)蛋白表達(dá)SDS-PAGE結(jié)果，其目標(biāo)蛋白重組硫氧還人甲狀旁腺激素融合蛋白；泳道1-7為胞外蛋白，泳道8-14為胞內(nèi)蛋白，M為標(biāo)準(zhǔn)蛋白)。泳道I為陽(yáng)性對(duì)照；泳道2為pal基因突變株(實(shí)施例I);泳道3-5為基因突變株(實(shí)施例2);泳道6-7為陰性對(duì)照；泳道8為陽(yáng)性對(duì)照；泳道9為pal基因突變株(實(shí)施例I)；泳道10-12為《TM基因突變株(實(shí)施例2);泳道13-14為陰性對(duì)照。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明所說的大腸桿菌胞外生產(chǎn)重組蛋白的方法，包括以下步驟
A、大腸桿菌基因突變的分泌型菌株構(gòu)建
(1)使用預(yù)先設(shè)計(jì)的特定基因敲除引物，以抗性標(biāo)記基因質(zhì)粒pKD3為模板，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)合成特定的PCR產(chǎn)物，稱為pa/基因打靶片段。打靶片段兩端為10 250 bp(優(yōu)選30 100 bp)的/^7基因同源序列，中間為氯霉素抗性標(biāo)記序列。將其使用PCR產(chǎn)物純化試劑盒得到高濃度10 1000 ng/μ (優(yōu)選100 500 ng/H)pal基因打靶片段；
(2)利用I 100mmol/L (優(yōu)選5 20 mmol/L)的L-阿拉伯糖誘導(dǎo)含敲除輔助質(zhì)粒PKD46的大腸桿菌出發(fā)菌株O. 2 10 h (優(yōu)選I 3 h)，再將誘導(dǎo)后的菌液制備電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞；
(3)將純化后的高濃度/^7基因打靶片段電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入所得的誘導(dǎo)后的大腸桿菌出發(fā)菌株的電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞之中，在含O. 5 50 mmol/L (優(yōu)選2 25 mmol/L)的L-阿拉伯糖的SOC培養(yǎng)基恢復(fù)O. 2 20 h，使用抗性LB固體培養(yǎng)基篩選發(fā)生同源重組的突變菌株，并使用PCR法和測(cè)序法確定/7^7基因區(qū)域發(fā)生正確的替換突變后，即得基因突變菌株。具體步驟請(qǐng)參考文獻(xiàn)(Datsenko and Wanner 2000 )。B、產(chǎn)人甲狀旁腺激素的分泌型重組菌株構(gòu)建
將合成的人甲狀旁腺激素hPTH的基因片斷，測(cè)序正確后將其克隆到分泌型表達(dá)質(zhì)粒pET32a (+)中，得到重組質(zhì)粒m^-pthH,轉(zhuǎn)化到基因突變菌株得到分泌型重組菌株，即產(chǎn)人甲狀旁腺激素的分泌型重組菌株。C、重組蛋白發(fā)酵
將得到的外源蛋白表達(dá)的分泌型重組菌株先使用含5 500 μδ/πι1 (優(yōu)選25 100Kg/ml)的Amp的LB固體培養(yǎng)基活化該工程菌株，3 72 h (優(yōu)選12 36 h)后挑單菌落接種到帶有3 300 ml (優(yōu)選10 50 ml)的含5 500 μδ/πι1 (優(yōu)選10 200 Pg/ml)的Amp的LB種子培養(yǎng)基的250 ml搖瓶中，在溫度20 45°C (優(yōu)選30 42°C )，轉(zhuǎn)速50 500 rpm (優(yōu)選150 300 rpm)的條件下培養(yǎng)3 72 h (優(yōu)選12 36 h)，再將O. I 10ml(優(yōu)選0. 5 5 ml)的該菌液接種到帶有3 300 ml (優(yōu)選10 50 ml)含5 500 μδ/ml (優(yōu)選10 200 μδ/πι1)的Amp的TB液體發(fā)酵培養(yǎng)基的250 ml搖瓶中，當(dāng)培養(yǎng)基中菌體濃度達(dá)到在OD600為O. 05 I. 8 (優(yōu)選O. 2 O. 8)時(shí)加入終濃度為O. 05 5 mmol (優(yōu)選O. 2 O. 8 mmol)的IPTG，誘導(dǎo)發(fā)酵I 24 h (優(yōu)選2 12 h)后終止發(fā)酵。得到發(fā)酵液于常溫下離心分離，收集上清液即得重組蛋白粗提物。其中所說的種子培養(yǎng)基為0. I 5%胰蛋白胨、O. 05 5%酵母提取粉以及O. 05 5%NaCl ；
發(fā)酵培養(yǎng)基為0. I 2%胰蛋白胨，O. 2 10%酵母提取粉，O. 05 5%甘油，O. 02
O.5% KH2PO4,0. I 2% K2HPO4 ；
固體培養(yǎng)基為0. 5 5%的瓊脂，O. I 5%胰蛋白胨、O. 05 5%酵母提取粉以及
0.05 5%NaCl。
本發(fā)明采用/^7基因突變的大腸桿菌作為外源蛋白質(zhì)宿主菌株，定位于周質(zhì)空間的載體作為重組目標(biāo)蛋白表達(dá)質(zhì)粒。所用原料均為市售品。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了重組蛋白發(fā)酵和胞外分泌同時(shí)進(jìn)行。在發(fā)酵過程中，重組目標(biāo)蛋白可以從胞內(nèi)滲漏且不顯著影響菌體的持續(xù)生長(zhǎng)，降低了目標(biāo)蛋白的胞內(nèi)降解，提高了重組蛋白表達(dá)；同時(shí)減少了重組蛋白的胞內(nèi)過度積累，而降低了包涵體形成；消除了細(xì)胞破壁工藝，減少了熱原污染；設(shè)計(jì)培養(yǎng)基組成，便于分離純化，進(jìn)而達(dá)到降低了生產(chǎn)成本，提高產(chǎn)品質(zhì)量的目的。滲漏不僅簡(jiǎn)化了純化重組蛋白的工藝，也提高了目標(biāo)產(chǎn)物的表達(dá)水平。經(jīng)檢測(cè)，超過40%的重組蛋白滲漏到培養(yǎng)基中，表達(dá)水平為10 30%。下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步闡述，其目的是更好理解本發(fā)明內(nèi)容。因此，所舉之例并不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。此外，在所列實(shí)施例中如無特別說明勻采用如下材料
I)菌種
宿主為Escherichia coli JM109 (DE3),敲除輔助質(zhì)粒pKD46,抗性標(biāo)記基因質(zhì)粒pKD3和pKD4，抗性標(biāo)記基因剔除質(zhì)粒pCP20。pal基因敲除引物palH+PF和palH+PR，pal基因鑒定引物PalTl和palT2。2)培養(yǎng)基
種子培養(yǎng)基1%胰蛋白胨，O. 5%酵母提取粉以及O. 5%NaCl ；
發(fā)酵培養(yǎng)基1. 2%胰蛋白胨，2. 4%酵母提取粉，O. 5%甘油，O. 231%KH2P04，
1.254%K2HP04 ；
固體培養(yǎng)基1. 5%的瓊脂，1%胰蛋白胨，O. 5%酵母提取粉以及O. 5%NaCl ；
SOC 培養(yǎng)基2% 胰蛋白胨，O. 5% 酵母提取粉，O. 05%NaCl，2. 5 mM KCl 10 mM MgCl2, 20
mM葡萄糖。所用試劑均為市售品。
實(shí)施例I
一種大腸桿菌滲漏發(fā)酵重組蛋白的方法，包括以下步驟
A、單基因突變的分泌型大腸桿菌的菌株構(gòu)建，即大腸桿菌基因突變的分泌型菌株構(gòu)建包括以下步驟
(I)使用預(yù)先設(shè)計(jì)的/基因敲除引物palH+PF和palH+PR，以抗性標(biāo)記基因質(zhì)粒pKD3為模板，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)合成特定的PCR產(chǎn)物，得到/^7基因打靶片段，打靶片段的兩端為50 bp的基因同源序列，中間是氯霉素抗性標(biāo)記序列，將所得的PCR產(chǎn)物使用PCR產(chǎn)物純化試劑盒得到20 ng/μ 的純化后的高濃度打靶片段；
(2)利用10mmol/L的L-阿拉伯糖誘導(dǎo)含有敲除輔助質(zhì)粒pKD46的大腸桿菌出發(fā)菌種JM109 (DE3) 2 h，再將所得的誘導(dǎo)后的菌液制備電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞；
(3)將步驟(I)所得純化后的高濃度的基因打靶片段導(dǎo)入步驟(2)所得的誘導(dǎo)后的菌液的電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞之中后，在含5 mmol/L的L-阿拉伯糖的SOC培養(yǎng)基恢復(fù)2 h后，使用抗性平板篩選發(fā)生同源重組的突變菌株，并使用鑒定引物PalTl和palT2進(jìn)行PCR法和測(cè)序法確定基因區(qū)域發(fā)生替換突變后，即得基因突變的分泌型菌株；
B、產(chǎn)人甲狀旁腺激素的分泌型重組菌株構(gòu)建
將合成的人甲狀旁腺激素hPTH的基因片斷，測(cè)序正確后將其克隆到分泌型表達(dá)質(zhì)粒pET32a(+)中，得到重組質(zhì)粒pET32a-A/7iA，轉(zhuǎn)化到基因突變菌株中得到分泌型重組菌 株，即產(chǎn)人甲狀旁腺激素的分泌型重組菌株。C、重組蛋白發(fā)酵
將得到的外源蛋白表達(dá)的分泌型重組菌株使用含50μ8/πι1的氨芐青霉素的LB平板活化該工程菌株，20 h后挑單菌落接種到帶有30ml的含5(^g/ml的Amp的LB液體培養(yǎng)基的250ml搖瓶中，370C的200轉(zhuǎn)搖床培養(yǎng)18 h，再將該菌液接種到帶有30ml含5(^g/ml的Amp的TB液體發(fā)酵培養(yǎng)基的250ml搖瓶中，使培養(yǎng)基菌體濃度保持在0D600為O. I左右，200轉(zhuǎn)搖床培養(yǎng)8 h后加入終濃度為O. 5mmol的IPTG，誘導(dǎo)發(fā)酵4 h后終止發(fā)酵，取Iml發(fā)酵液作為樣品，用于后續(xù)分析。結(jié)果將發(fā)酵液于4°C條件下以6000 rpm的速度離心lOmin，收集上清液即得重組蛋白粗提物。經(jīng)檢測(cè)，超過40%的重組蛋白滲漏到培養(yǎng)基中，表達(dá)水平為10 30%ο實(shí)施例2
一種大腸桿菌滲漏發(fā)酵重組蛋白的方法，包括以下步驟
A、大腸桿菌基因突變的分泌型菌株構(gòu)建包括以下步驟
Cl)使用預(yù)先設(shè)計(jì)的基因敲除引物mrcBH+PF和mrcBH+PR，以抗性標(biāo)記基因質(zhì)粒PKD3為模板，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)合成特定的PCR產(chǎn)物，得到基因打靶片段，打靶片段的兩端為50bp ^nwcB基因同源序列，中間是氯霉素抗性標(biāo)記序列，將所得的PCR產(chǎn)物使用PCR產(chǎn)物純化試劑盒得到20ng/^l的純化后的高濃度打靶片段；
(2)利用lOmmol/L的L-阿拉伯糖誘導(dǎo)含有敲除輔助質(zhì)粒pKD46的大腸桿菌出發(fā)菌種JM109 (DE3) 2 h，再將所得的誘導(dǎo)后的菌液制備電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞；
(3)將步驟(I)所得純化后的高濃度的基因打靶片段導(dǎo)入步驟(2)所得的誘導(dǎo)后的菌液的電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞之中后，在含5 mmol/L的L-阿拉伯糖的SOC培養(yǎng)基恢復(fù)2h后，使用抗性平板篩選發(fā)生同源重組的突變菌株，并使用鑒定引物mrcBTl和mrcBT2進(jìn)行PCR法和測(cè)序法確定基因區(qū)域發(fā)生替換突變后，即得基因突變的分泌型菌株；
B、外源蛋白表達(dá)的分泌型重組大腸桿菌的菌株構(gòu)建(產(chǎn)人甲狀旁腺激素的分泌型重組菌株構(gòu)建)
將合成的人甲狀旁腺激素hPTH的基因片斷，測(cè)序正確后將其克隆到分泌型表達(dá)質(zhì)粒pET32a (+)中，得到重組質(zhì)粒pET32a-A/7iA，轉(zhuǎn)化到fflrM基因突變菌株中得到分泌型重組菌株，即產(chǎn)人甲狀旁腺激素的分泌型重組菌株。C、重組蛋白發(fā)酵
將得到的外源蛋白表達(dá)的分泌型重組菌株使用含50μ8/πι1的氨芐青霉素的LB平板活化該工程菌株，20 h后挑單菌落接種到帶有30ml的含5(^g/ml的Amp的LB液體培養(yǎng)基的250ml搖瓶中，370C的200轉(zhuǎn)搖床培養(yǎng)18 h，再將該菌液接種到帶有30ml含5(^g/ml的Amp的TB液體發(fā)酵培養(yǎng)基的250ml搖瓶中，使培養(yǎng)基菌體濃度保持在0D600為O. I左右，200轉(zhuǎn)搖床培養(yǎng)8 h后加入終濃度為O. 5mmol的IPTG，誘導(dǎo)發(fā)酵4 h后終止發(fā)酵，取Iml發(fā)酵液作為樣品，用于后續(xù)分析。結(jié)果將發(fā)酵液于4°C條件下以6000 rpm的速度離心lOmin，收集上清液即得重組蛋白粗提物。經(jīng)檢測(cè)，超過40%的重組蛋白滲漏到培養(yǎng)基中，表達(dá)水平為10 30%ο實(shí)施例3
一種大腸桿菌滲漏發(fā)酵重組蛋白的方法，包括以下步驟
A、單基因突變菌株的構(gòu)建包括以下步驟
(1)使用預(yù)先設(shè)計(jì)的/^7基因敲除引物palH+PF和palH+PR，以抗性標(biāo)記基因質(zhì)粒pKD3為模板，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)合成特定的PCR產(chǎn)物，得到/^7基因打靶片段，打靶片段的兩端為50bp的基因同源序列，中間是氯霉素抗性標(biāo)記序列，將所得的PCR產(chǎn)物使用PCR產(chǎn)物純化試劑盒得到20ng/^l的純化后的高濃度打靶片段；
(2)利用lOmmol/L的L-阿拉伯糖誘導(dǎo)含有敲除輔助質(zhì)粒pKD46的大腸桿菌出發(fā)菌種JM109 (DE3) 2 h，再將所得的誘導(dǎo)后的菌液制備電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞；
(3)將步驟(I)所得純化后的高濃度的基因打靶片段導(dǎo)入步驟(2)所得的誘導(dǎo)后的菌液的電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞之中后，在含5 mmol/L的L-阿拉伯糖的SOC培養(yǎng)基恢復(fù)2 h后，使用抗性平板篩選發(fā)生同源重組的突變菌株，并使用鑒定引物PalTl和palT2進(jìn)行PCR法和測(cè)序法確定基因區(qū)域發(fā)生替換突變后，即得基因突變菌株；
B、產(chǎn)B淋巴細(xì)胞刺激因子的分泌型重組菌株構(gòu)建
將合成的B淋巴細(xì)胞刺激因子BLyS的基因片斷，測(cè)序正確后將其克隆到分泌型表達(dá)質(zhì)粒pET32a (+)中，得到重組質(zhì)粒pET32a-67_^s，轉(zhuǎn)化到pal基因突變菌株中得到分泌型重組菌株，即產(chǎn)B淋巴細(xì)胞刺激因子的分泌型重組菌株。C、重組蛋白發(fā)酵
將得到的外源蛋白表達(dá)的分泌型重組菌株使用含50μ8/πι1的氨芐青霉素的LB平板活化該工程菌株，20 h后挑單菌落接種到帶有30ml的含5(^g/ml的Amp的LB液體培養(yǎng)基的250ml搖瓶中，370C的200轉(zhuǎn)搖床培養(yǎng)18 h，再將該菌液接種到帶有30ml含5(^g/ml的Amp的TB液體發(fā)酵培養(yǎng)基的250ml搖瓶中，使培養(yǎng)基菌體濃度保持在0D600為O. I左右，200轉(zhuǎn)搖床培養(yǎng)8 h后加入終濃度為O. 5mmol的IPTG，誘導(dǎo)發(fā)酵4 h后終止發(fā)酵，取Iml發(fā)酵液作為樣品，用于后續(xù)分析。結(jié)果將發(fā)酵液于4°C條件下以6000 rpm的速度離心lOmin，收集上清液即得重組蛋白粗提物。經(jīng)檢測(cè)，超過40%的重組蛋白滲漏到培養(yǎng)基中，表達(dá)水平為10 30%ο實(shí)施例4
一種大腸桿菌滲漏發(fā)酵重組蛋白的方法，包括以下步驟
A、大腸桿菌基因突變的分泌型菌株構(gòu)建包括以下步驟(1)使用預(yù)先設(shè)計(jì)的fflrM基因敲除引物mrcBH+PF和mrcBH+PR，以抗性標(biāo)記基因質(zhì)粒PKD3為模板，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)合成特定的PCR產(chǎn)物，得到基因打靶片段，打靶片段的兩端為50bp ^nwcB基因同源序列，中間是氯霉素抗性標(biāo)記序列，將所得的PCR產(chǎn)物使用PCR產(chǎn)物純化試劑盒得到20ng/^l的純化后的高濃度打靶片段；
(2)利用lOmmol/L的L-阿拉伯糖誘導(dǎo)含有敲除輔助質(zhì)粒pKD46的大腸桿菌出發(fā)菌種JM109 (DE3) 2 h，再將所得的誘導(dǎo)后的菌液制備電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞；
(3)將步驟(I)所得純化后的高濃度的基因打靶片段導(dǎo)入步驟(2)所得的誘導(dǎo)后的菌液的電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞之中后，在含5 mmol/L的L-阿拉伯糖的SOC培養(yǎng)基恢復(fù)2h后，使用抗性平板篩選發(fā)生同源重組的突變菌株，并 使用鑒定引物mrcBTl和mrcBT2進(jìn)行PCR法和測(cè)序法確定基因區(qū)域發(fā)生替換突變后，即得基因突變的分泌型菌株；
B、產(chǎn)B淋巴細(xì)胞刺激因子的分泌型重組菌株構(gòu)建
將合成的B淋巴細(xì)胞刺激因子BLyS的基因片斷，測(cè)序正確后將其克隆到分泌型表達(dá)質(zhì)粒pET32a (+)中，得到重組質(zhì)粒pET32a-67_^s，轉(zhuǎn)化到fflrM基因突變菌株中得到分泌型重組菌株，即產(chǎn)B淋巴細(xì)胞刺激因子的分泌型重組菌株。C、分泌型重組大腸桿菌的目標(biāo)蛋白表達(dá)過程(重組蛋白發(fā)酵)
將得到的外源蛋白表達(dá)的分泌型重組菌株使用含50μ8/πι1的氨芐青霉素的LB平板活化該工程菌株，20 h后挑單菌落接種到帶有30ml的含5(^g/ml的Amp的LB液體培養(yǎng)基的250ml搖瓶中，370C的200轉(zhuǎn)搖床培養(yǎng)18 h，再將該菌液接種到帶有30ml含5(^g/ml的Amp的TB液體發(fā)酵培養(yǎng)基的250ml搖瓶中，使培養(yǎng)基菌體濃度保持在0D600為O. I左右，200轉(zhuǎn)搖床培養(yǎng)8 h后加入終濃度為O. 5mmol的IPTG，誘導(dǎo)發(fā)酵4 h后終止發(fā)酵，取Iml發(fā)酵液作為樣品，用于后續(xù)分析。結(jié)果將發(fā)酵液于4°C條件下以6000 rpm的速度離心lOmin，收集上清液即得重組蛋白粗提物。經(jīng)檢測(cè)，超過40%的重組蛋白滲漏到培養(yǎng)基中，表達(dá)水平為10 30%ο實(shí)施例5
一種大腸桿菌滲漏發(fā)酵重組蛋白的方法，包括以下步驟
A、單基因突變菌株的構(gòu)建包括以下步驟
(1)使用預(yù)先設(shè)計(jì)的/^7基因敲除引物palH+PF和palH+PR，以抗性標(biāo)記基因質(zhì)粒pKD3為模板，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)合成特定的PCR產(chǎn)物，得到/^7基因打靶片段，打靶片段的兩端為50bp的基因同源序列，中間是氯霉素抗性標(biāo)記序列，將所得的PCR產(chǎn)物使用PCR產(chǎn)物純化試劑盒得到20ng/^l的純化后的高濃度打靶片段；
(2)利用lOmmol/L的L-阿拉伯糖誘導(dǎo)含有敲除輔助質(zhì)粒pKD46的大腸桿菌出發(fā)菌種JM109 (DE3) 2 h，再將所得的誘導(dǎo)后的菌液制備電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞；
(3)將步驟(I)所得純化后的高濃度的基因打靶片段導(dǎo)入步驟(2)所得的誘導(dǎo)后的菌液的電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞之中后，在含5 mmol/L的L-阿拉伯糖的SOC培養(yǎng)基恢復(fù)2 h后，使用抗性平板篩選發(fā)生同源重組的突變菌株，并使用鑒定引物PalTl和palT2進(jìn)行PCR法和測(cè)序法確定基因區(qū)域發(fā)生替換突變后，即得基因突變菌株；
B、產(chǎn)咖啡酰輔酶A-O-甲基轉(zhuǎn)移酶的分泌型重組菌株構(gòu)建
將合成的咖啡酰輔酶A-O-甲基轉(zhuǎn)移酶SvOM的基因片斷，測(cè)序正確后將其克隆到分泌型表達(dá)質(zhì)粒pET32a (+)中，得到重組質(zhì)粒pETSZa-sra ，轉(zhuǎn)化到pal基因突變菌株中得到分泌型重組菌株，即產(chǎn)咖啡酰輔酶A-O-甲基轉(zhuǎn)移酶的分泌型重組菌株。C、重組蛋白發(fā)酵
將得到的外源蛋白表達(dá)的分泌型重組菌株使用含50μ8/πι1的氨芐青霉素的LB平板活化該工程菌株，20 h后挑單菌落接種到帶有30ml的含5(^g/ml的Amp的LB液體培養(yǎng)基的250ml搖瓶中，370C的200轉(zhuǎn)搖床培養(yǎng)18 h，再將該菌液接種到帶有30ml含5(^g/ml的Amp的TB液體發(fā)酵培養(yǎng)基的250ml搖瓶中，使培養(yǎng)基菌體濃度保持在0D600為O. I左右，200轉(zhuǎn)搖床培養(yǎng)8 h后加入終濃度為O. 5mmol的IPTG，誘導(dǎo)發(fā)酵4 h后終止發(fā)酵，取Iml發(fā)酵液作為樣品，用于后續(xù)分析。結(jié)果將發(fā)酵液于4°C條件下以6000 rpm的速度離心lOmin，收集上清液即得重組蛋白粗提物。經(jīng)檢測(cè)，超過40%的重組蛋白滲漏到培養(yǎng)基中，表達(dá)水平為10 30%ο實(shí)施例6 一種大腸桿菌滲漏發(fā)酵重組蛋白的方法，包括以下步驟
A、大腸桿菌基因突變的分泌型菌株構(gòu)建包括以下步驟
Cl)使用預(yù)先設(shè)計(jì)的基因敲除引物mrcBH+PF和mrcBH+PR，以抗性標(biāo)記基因質(zhì)粒PKD3為模板，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)合成特定的PCR產(chǎn)物，得到基因打靶片段，打靶片段的兩端為50bp ^nwcB基因同源序列，中間是氯霉素抗性標(biāo)記序列，將所得的PCR產(chǎn)物使用PCR產(chǎn)物純化試劑盒得到20ng/^l的純化后的高濃度打靶片段；
(2)利用lOmmol/L的L-阿拉伯糖誘導(dǎo)含有敲除輔助質(zhì)粒pKD46的大腸桿菌出發(fā)菌種JM109 (DE3) 2 h，再將所得的誘導(dǎo)后的菌液制備電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞；
(3)將步驟(I)所得純化后的高濃度的基因打靶片段導(dǎo)入步驟(2)所得的誘導(dǎo)后的菌液的電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞之中后，在含5 mmol/L的L-阿拉伯糖的SOC培養(yǎng)基恢復(fù)2h后，使用抗性平板篩選發(fā)生同源重組的突變菌株，并使用鑒定引物mrcBTl和mrcBT2進(jìn)行PCR法和測(cè)序法確定基因區(qū)域發(fā)生替換突變后，即得基因突變的分泌型菌株；
B、產(chǎn)咖啡酰輔酶A-O-甲基轉(zhuǎn)移酶的分泌型重組菌株構(gòu)建
將合成的咖啡酰輔酶A-O-甲基轉(zhuǎn)移酶SvOM的基因片斷，測(cè)序正確后將其克隆到分泌型表達(dá)質(zhì)粒pET32a(+)中，得到重組質(zhì)粒ρΕΤ32α-5·ι· ,轉(zhuǎn)化到基因突變菌株中得到分泌型重組菌株，即產(chǎn)咖啡酰輔酶A-O-甲基轉(zhuǎn)移酶的分泌型重組菌株。C、重組蛋白發(fā)酵
將得到的外源蛋白表達(dá)的分泌型重組菌株使用含50μ8/πι1的氨芐青霉素的LB平板活化該工程菌株，20 h后挑單菌落接種到帶有30ml的含5(^g/ml的Amp的LB液體培養(yǎng)基的250ml搖瓶中，370C的200轉(zhuǎn)搖床培養(yǎng)18 h，再將該菌液接種到帶有30ml含5(^g/ml的Amp的TB液體發(fā)酵培養(yǎng)基的250ml搖瓶中，使培養(yǎng)基菌體濃度保持在0D600為O. I左右，200轉(zhuǎn)搖床培養(yǎng)8 h后加入終濃度為O. 5mmol的IPTG，誘導(dǎo)發(fā)酵4 h后終止發(fā)酵，取Iml發(fā)酵液作為樣品，用于后續(xù)分析。結(jié)果將發(fā)酵液于4°C條件下以6000 rpm的速度離心lOmin，收集上清液即得重組蛋白粗提物。經(jīng)檢測(cè)，超過40%的重組蛋白滲漏到培養(yǎng)基中，表達(dá)水平為10 30%ο序列表
mrcB ,pal基因敲除引物
權(quán)利要求
1.一種大腸桿菌胞外生產(chǎn)外源蛋白的集成化方法，其特征在于包括單基因突變的分泌型大腸桿菌的菌株構(gòu)建、外源蛋白表達(dá)的分泌型重組大腸桿菌的菌株構(gòu)建及分泌型重組大腸桿菌的目標(biāo)蛋白表達(dá)過程； 所述的單基因突變的分泌型大腸桿菌的菌株構(gòu)建方法為使用預(yù)先設(shè)計(jì)的細(xì)胞膜蛋白或細(xì)胞壁合成酶基因pal或mrcB, mrcA, mrdA, murC, rodA, rodZ中的一種單基因敲除引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到兩端為10 250 bp特定目標(biāo)基因同源序列及中間為氯霉素抗性標(biāo)記序列的濃度為 I 1000 ng/μ 的或mrcB,mrcA,mrdA,murC,rodA,rodZ 中飽一種基因打靶片段，并整合到宿主大腸桿菌染色體中，得到分泌型大腸桿菌菌株。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種大腸桿菌胞外生產(chǎn)外源蛋白的集成化方法，其特征在于所述的單基因突變的分泌型大腸桿菌的菌株含有的基因/^7編碼區(qū)發(fā)生了突變，或者基因的啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)生了突變，從而使/^7基因無法表達(dá)出相應(yīng)的Pal蛋白產(chǎn)物，或表達(dá)出降低了功能的Pal蛋白產(chǎn)物，進(jìn)而正常的細(xì)胞膜運(yùn)輸功能發(fā)生變化。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種大腸桿菌胞外生產(chǎn)外源蛋白的集成化方法，其特征在于所述的外源蛋白表達(dá)的分泌型重組大腸桿菌菌株構(gòu)建方法為將外源目標(biāo)蛋白質(zhì)基因先重組到分泌型質(zhì)粒中，隨后克隆到該分泌型大腸桿菌中，進(jìn)而得到分泌型重組大腸桿菌菌株。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種大腸桿菌胞外生產(chǎn)外源蛋白的集成化方法，其特征在于所述的外源蛋白表達(dá)的分泌型重組大腸桿菌菌株含有編碼外源蛋白的重組基因質(zhì)粒，該重組質(zhì)粒中外源蛋白基因與定位于周質(zhì)空間的信號(hào)肽編碼序列相連，從而使胞內(nèi)合成的外源蛋白通過信號(hào)肽導(dǎo)入于周質(zhì)空間進(jìn)而滲漏到培養(yǎng)基中。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種用于重組蛋白分泌型表達(dá)的大腸桿菌構(gòu)建方法，其特征在于所述的分泌型重組大腸桿菌的目標(biāo)蛋白表達(dá)過程指的是在發(fā)酵培養(yǎng)基中使用外源蛋白表達(dá)的分泌型重組大腸桿菌菌株生產(chǎn)外源蛋白。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種用于重組蛋白分泌型表達(dá)的大腸桿菌構(gòu)建方法，其特征在于所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中含有0. I 2%胰蛋白胨，O. 2 10%酵母提取粉，O. 05 5%甘油，O. 02 O. 5% KH2PO4,0. I 2% Κ2ΗΡ04。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種大腸桿菌胞外生產(chǎn)外源蛋白的集成化方法，包括單基因突變的分泌型大腸桿菌的菌株構(gòu)建、外源蛋白表達(dá)的分泌型重組大腸桿菌的菌株構(gòu)建及分泌型重組大腸桿菌的目標(biāo)蛋白表達(dá)過程。本發(fā)明采用大腸桿菌的pal或mrcB等基因突變株為宿主和定位于周質(zhì)空間的重組蛋白質(zhì)粒，使得重組蛋白的發(fā)酵和胞外分泌同時(shí)進(jìn)行。從而實(shí)現(xiàn)降低目標(biāo)蛋白的胞內(nèi)降解，提高重組蛋白表達(dá)；同時(shí)減少重組蛋白的胞內(nèi)過度積累，而降低包涵體形成；消除細(xì)胞破壁工藝，減少熱原污染，方便分離純化；進(jìn)而達(dá)到降低生產(chǎn)成本，提高產(chǎn)品表達(dá)及質(zhì)量的目的。經(jīng)檢測(cè)，超過40％的重組蛋白滲漏到培養(yǎng)基中，表達(dá)水平為10～30%。
文檔編號(hào)C12R1/19GK102827904SQ201210287000
公開日2012年12月19日 申請(qǐng)日期2012年8月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月13日
發(fā)明者童望宇, 宋俊蘭, 陳昭元 申請(qǐng)人:安徽大學(xué)