專利名稱：一種重組大腸桿菌及其用于制備蘆薈大黃素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種重組大腸桿菌及其用于制備蘆薈大黃素的方法，屬生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
蘆薈大黃素(Aloe-emodin)，又稱蘆薈瀉素，化學(xué)名稱為1，8_二羥基_3_羥甲基蒽醌，是重要的蒽醌類物質(zhì)，主要存在于蘆薈葉的表層中，具有抗腫瘤、抗菌抗病毒、抗氧化等一系列生物活性，因而在醫(yī)藥、保健食品、化妝品、日用洗滌用品等行業(yè)，獲得廣泛應(yīng)用。
蘆薈大黃素分子結(jié)構(gòu)如通式(I)所示，蘆薈苷的分子結(jié)構(gòu)示于通式(2)，從通式
(I)和通式(2)的分子結(jié)構(gòu)式可以看出，蘆薈大黃素蒽醌環(huán)ClO位上的羰基被葡萄糖取代后即構(gòu)成了蘆薈苷，蘆薈苷是蘆薈大黃素的糖苷衍生物。
OH O OH
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ini
OOH OH
Cl)(2)在蘆薈中，蘆薈苷含量可達(dá)到干重的百分之十幾甚至更高，相當(dāng)于蘆薈大黃素含量的十幾倍甚至上百倍，蘆薈苷的價(jià)格也遠(yuǎn)低于蘆薈大黃素，因此，以蘆薈苷為起始原料制備蘆薈大黃素具有現(xiàn)實(shí)意義。多年來很多學(xué)者相繼發(fā)表了涉及以蘆薈苷為起始原料，經(jīng)過水解氧化反應(yīng)，得到蘆薈大黃素的相關(guān)技術(shù)報(bào)道和專利，其中比較典型的方法有(I)張仰明等人(CN200610028926. 7)以氯化鐵為氧化劑，在酸性條件下，將蘆薈苷氧化得到蘆薈大黃素。雖然產(chǎn)率較高，工業(yè)化操作簡(jiǎn)單易行，但是產(chǎn)生的廢水中含有大量鐵離子，可能會(huì)造成對(duì)環(huán)境的鐵離子污染和產(chǎn)品中的鐵殘留。(2)中國專利申請(qǐng)?zhí)?00580038713. 6公開了瑞士梅迪多姆實(shí)驗(yàn)室股份有限公司S ·卡里諾等人提出的一種制備蘆薈大黃素的方法，即在強(qiáng)酸催化下，以二元醇或三元醇為溶劑，較高溫度、較高壓力下用含氧氣體氧化蘆薈苷得到蘆薈大黃素。該方法較高效地制備了蘆薈大黃素，但存在的最大問題在于反應(yīng)過程需要在較高溫度和較高壓力的條件下使用含氧氣體完成，對(duì)管道設(shè)備的要求較高，在實(shí)際生產(chǎn)中存在不安全因素。此外，成本也較高。(3)蘇為科(CN101508637B)公開了另一種蘆薈大黃素的制備方法，即以過硫酸鹽為氧化劑，氧化蘆薈苷制備蘆薈大黃素。將蘆薈苷和過硫酸鹽氧化劑按一定比例加入到反應(yīng)器中，加入水作為反應(yīng)介質(zhì)，在一定的溫度條件下攪拌反應(yīng)，即可完成蘆薈苷向蘆薈大黃素的轉(zhuǎn)變，轉(zhuǎn)化率較高。該方法工藝簡(jiǎn)單，轉(zhuǎn)化率較高，其不足之處在于加入大量過硫酸鹽強(qiáng)氧化劑，產(chǎn)生大量活性氧，易斷裂蘆薈大黃素蒽醌環(huán)，降低收率；反應(yīng)溫度較高；需要以純蘆薈苷為原料,也會(huì)增加生產(chǎn)成本。以上幾種化學(xué)合成方法需使用強(qiáng)酸或較高溫度或者氧氣，需要特殊設(shè)備或者加入大量過硫酸鹽強(qiáng)氧化劑?？傊?，反應(yīng)條件不溫和，對(duì)反應(yīng)設(shè)備要求較高，而且能耗相對(duì)也較高，增加廢水量不利于環(huán)境保護(hù)，而且反應(yīng)沒有選擇性，容易產(chǎn)生各種副產(chǎn)物，增加產(chǎn)品分離提取的難度和經(jīng)濟(jì)成本，同時(shí)影響最終產(chǎn)品的純度和應(yīng)用效果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種能夠生物轉(zhuǎn)化蘆薈苷生成蘆薈大黃素的重組大腸桿菌，已于2012年5月14日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)、中國科學(xué)院微生物研究所，保藏編號(hào)為CGMCC No. 6114，其分類學(xué)命名為大腸埃希氏菌 Escherichia coli BL21trxB(DE3)-pET28a(+)。本發(fā)明的目的在于公開一種使用重組大腸桿菌培養(yǎng)液制備蘆薈大黃素的方法，利·用微生物產(chǎn)生的酶作為催化劑，生物轉(zhuǎn)化蘆薈苷制備蘆薈大黃素，具有反應(yīng)條件溫和，副產(chǎn)物少，無需特殊設(shè)備，能耗低，對(duì)環(huán)境友好等特點(diǎn)，以期克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述缺陷。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種使用重組大腸桿菌制備蘆薈大黃素的方法，包括發(fā)酵培養(yǎng)重組大腸桿菌Escherichia coli BL2ItrxB (DE3)-pET28a(+)E⑶0416CGMCC No. 6114，和從反應(yīng)產(chǎn)物中純化蘆薈大黃素，其特征在于還包括酶促水解步驟將培養(yǎng)后的大腸桿菌發(fā)酵液過冷凍離心，獲得的上清液作為酶源，以蘆薈苷為底物，蘆薈苷加入量為O. 05 7. 5g/L，酶的加入量為20 300U/g底物，在pH5. O 9. O的磷酸鹽緩沖液中進(jìn)行水解反應(yīng)，反應(yīng)溫度為20 50°C，反應(yīng)時(shí)間為2 24小時(shí)。所述酶液是將重組大腸桿菌發(fā)酵液(含菌體)經(jīng)4°C、12000rpm,離心15min，棄沉淀，上清液即為酶液。所述酶活測(cè)定方法是將5ml酶液、5ml磷酸鹽緩沖液(40mmol/L磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液，pH7. 5,1.2% NaCl)、30mg蘆薈苷，加入50ml三角瓶中，30°C、210rpm振蕩反應(yīng)20min，用HPLC法檢測(cè)蘆薈大黃素的含量。酶活單位(U)的定義在30°C、pH7. 5條件下，每小時(shí)酶促水解蘆薈苷產(chǎn)生I微摩爾蘆薈大黃素所需的酶量。水解反應(yīng)的pH優(yōu)先7 8。水解反應(yīng)的溫度優(yōu)先25 40C。所說的磷酸鹽緩沖液為磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液，濃度為20 200mmol/L，其中含O. 2 I. 5% NaCl0發(fā)酵培養(yǎng)大腸桿菌菌種Escherichia coli BL2ItrxB(DE3)-pET28a(+)E⑶0416CGMCC No. 6114，依次包括下列步驟(I)平板培養(yǎng)將甘油保藏菌種在室溫自然融化，接種到平板培養(yǎng)基上，25 40°C恒溫培養(yǎng)I 2天；(2)種子培養(yǎng)搖瓶裝液量10 30% (v/v)，培養(yǎng)溫度25 40°C，搖床轉(zhuǎn)速60 300rpm,恒溫振蕩培養(yǎng)I 4h (至OD600在O. 6 I. O之間)，4°C靜置過夜；(3)發(fā)酵培養(yǎng)搖瓶裝液量10 30% (v/v)，接種量2 10% (v/v)，培養(yǎng)溫度20 50°C，搖床轉(zhuǎn)速60 300rpm，恒溫振蕩培養(yǎng)5 24h。
所使用的平板培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基均為L(zhǎng)B培養(yǎng)基。種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基均為L(zhǎng)B液體培養(yǎng)基，配方為蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCllOg，溶于800ml去離子水中，用NaOH調(diào)pH至7. 5,加去離子水至1L, 121°C滅菌20min。平板培養(yǎng)基為L(zhǎng)B固體培養(yǎng)基，在LB液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加2. 0%瓊脂粉，121°C滅菌20min后得到。所述從反應(yīng)產(chǎn)物中純化蘆薈大黃素的方法是指，在酶促水解反應(yīng)的混合液中，力口入600mL甲苯，萃取分液3次，合并萃取液，于60°C真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至30ml左右，待冷卻至室溫后放置冰箱中，在4°C下保持I小時(shí)，再在-10°C下保持2小時(shí)；抽濾，洗滌結(jié)晶兩次，60°C真空干燥。，本發(fā)明的積極效果是反應(yīng)條件溫和，副產(chǎn)物較少，提取純化方便；不需要特殊設(shè)備，能耗低，對(duì)環(huán)境友好等特點(diǎn)，轉(zhuǎn)化率可達(dá)到65 %以上，所得蘆薈大黃素純度大于98 %。 利用微生物產(chǎn)生的酶作為催化劑，在溫和條件下催化水解廉價(jià)易得的蘆薈苷，制備應(yīng)用價(jià)值很高的稀有碳糖苷元——蘆薈大黃素，市場(chǎng)應(yīng)用前景寬廣。生物材料樣品保藏與生物材料存活證明
一種能夠生物轉(zhuǎn)化蘆薈苷生成蘆薈大黃素的重組大腸桿菌，其分類學(xué)命名為大腸埃希氏菌Escherichia coli,該菌株于2012年5月14日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)、中國科學(xué)院微生物研究所，保藏編號(hào)為CGMCC No. 6114。


圖I為本發(fā)明中蘆薈大黃素的質(zhì)譜圖；圖2為本發(fā)明中蘆薈大黃素的核磁共振譜圖。
具體實(shí)施例方式下面將通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述，其目的是為更好理解本發(fā)明的內(nèi)容。因此，所舉之例并不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明提供了一種能夠生物轉(zhuǎn)化蘆薈苷生成蘆薈大黃素的重組大腸桿菌，已于2012年5月14日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)、中國科學(xué)院微生物研究所，保藏編號(hào)為CGMCC No. 6114，其分類學(xué)命名為大腸埃希氏菌 Escherichia coli BL21trxB(DE3)-pET28a(+)。本發(fā)明公開了一種使用重組大腸桿菌培養(yǎng)液生物轉(zhuǎn)化蘆薈苷制備蘆薈大黃素的方法，包括發(fā)酵培養(yǎng)大腸桿菌Escherichia coli BL2ItrxB (DE3) -pET28a (+)，和從反應(yīng)產(chǎn)物中提取純化蘆薈大黃素，其特征在于包括酶促水解步驟。菌種篩選將vector pET28a(+) (NcoI&EcoRI)載體直接轉(zhuǎn)入 Escherichia coliBL2ItrxB(DE3)菌株，得到帶卡那抗性的重組大腸桿菌E. coli BL2ItrxB(DE3)-pET28a(+)。將該菌接種到平板分離培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)24h，再從平板中挑取單菌落培養(yǎng)。重復(fù)60個(gè)周期，得到能夠代謝蘆薈苷制備蘆薈大黃素的重組菌株。平板分離培養(yǎng)基配方蛋白胨1%，蘆薈苷0.4%，NaClO. 5%，瓊脂2%。制備方法用INNaOH調(diào)節(jié)pH至7. 5，121°C滅菌20min。高壓滅菌后待降溫到55°C左右，加入蘆薈苷，按照0. 5ml/L加入卡那霉素，搖勻后倒平板。發(fā)酵培養(yǎng)大腸桿菌Escherichia coli BL21trxB (DE3)-pET28a (+),依次包括下列步驟(I)平板培養(yǎng)將甘油保藏菌室溫融化，接種到平板培養(yǎng)基上，25 40°C培養(yǎng)I 2天；(2)種子培養(yǎng)搖瓶裝液量10 30% (v/v)，培養(yǎng)溫度25 40°C，搖床轉(zhuǎn)速60 300rpm,恒溫振蕩培養(yǎng)I 4h (至OD600在O. 6 I. O之間)，4°C靜置過夜；(3)發(fā)酵培養(yǎng)搖瓶裝液量10 30% (v/v)，接種量2 10% (v/v)，培養(yǎng)溫度20 50°C，搖床轉(zhuǎn)速60 300rpm，恒溫振蕩培養(yǎng)5 24h。所使用的平板培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基均為L(zhǎng)B培養(yǎng)基。種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基均為L(zhǎng)B液體培養(yǎng)基，配方為蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCllOg， 溶于800ml去離子水中，用NaOH調(diào)pH至7. 5,加去離子水至1L, 121°C滅菌20min。平板培養(yǎng)基為L(zhǎng)B固體培養(yǎng)基，在LB液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加2. O %瓊脂粉，121°C滅菌20min。實(shí)施例中所述酶液是將大腸桿菌發(fā)酵液(含菌體)經(jīng)4°C、12000rpm,離心15min，棄沉淀，上清液即為酶液。所述酶活測(cè)定方法是將5ml酶液、5ml磷酸鹽緩沖液(40mmol/L磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液，pH7. 5,1.2% NaCl)、30mg蘆薈苷，加入50ml三角瓶中，30°C、210rpm振蕩反應(yīng)20min，用HPLC法檢測(cè)蘆薈大黃素的含量。酶活單位(U)的定義在30°C、pH7. 5條件下，每小時(shí)酶促水解蘆薈苷產(chǎn)生I微摩爾蘆薈大黃素所需的酶量。所述反應(yīng)產(chǎn)物中純化蘆薈大黃素的方法是指水解反應(yīng)產(chǎn)物中，加入600mL甲苯，3次萃取分液，合并萃取液，于60°C真空濃縮至30ml左右，待冷卻至室溫后放置冰箱，在4°C下保持I小時(shí)，再在-10°C下保持2小時(shí)；抽濾，洗滌結(jié)晶兩次，60°C真空干燥。用HPLC法檢測(cè)蘆薈大黃素的純度檢測(cè)方法，并計(jì)算酶催化反應(yīng)轉(zhuǎn)化率蘆薈大黃素高壓液相檢測(cè)方法色譜柱=Eclipse XDB-C18柱(4. 6mmX250mm，5 μ m);檢測(cè)波長(zhǎng)254nm ;流動(dòng)相甲醇-水溶液(80 20);流速0. 8mL/min ;柱溫室溫。蘆薈大黃素的質(zhì)譜條件ESI離子源噴霧電壓4. 5kV ;毛細(xì)管溫度200°C ;毛細(xì)管電壓45V ;鞘氣(N2)流速40個(gè)單位；流動(dòng)相甲醇0. 01mol/L乙酸銨水溶液(50 50V/V);流速0. 20mL/min ;負(fù)離子一級(jí)質(zhì)譜全掃描。蘆薈大黃素的核磁共振條件Varian XL400 (400MHz)超導(dǎo)核磁共振儀上進(jìn)行，以DMSO-d6為溶劑，1H-匪R的工作頻率為400. 13MHz。產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)譜和核磁共振鑒定，表明產(chǎn)物確為蘆薈大黃素。實(shí)施例I一株重組大腸桿菌菌株及其用于制備蘆薈大黃素的方法，包括發(fā)酵培養(yǎng)重組大腸桿菌菌株 Escherichia coli BL21trxB (DE3)-pET28a(+)ECU0416CGMCC No. 6114 (I)平板培養(yǎng)將篩選出來的重組菌株，接種到平板培養(yǎng)基上，37°C恒溫培養(yǎng)I天;(2)種子培養(yǎng)從平板上挑取菌落接種于種子培養(yǎng)基(250ml瓶裝液50ml)，37°C、250rpm振蕩培養(yǎng)4h (至OD600在O. 6 I. O之間)，4°C靜置過夜；(3)發(fā)酵培養(yǎng)按4%接種量將種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基(250ml瓶裝液50ml)，于30°C、250rpm振蕩培養(yǎng)llh，產(chǎn)酶量可以達(dá)到148U/L發(fā)酵液。上述重組大腸桿菌發(fā)酵終止后，將發(fā)酵液(含菌體)經(jīng)4°C、12000rpm，離心15min,棄沉淀，上清液即為酶液。將300mg蘆薈苷，50ml酶液，50ml磷酸鹽緩沖液(40mmol/L磷酸氫二鈉·磷酸二氫鈉緩沖液，PH7. 5，I. 2% NaCl)加入到500ml三角瓶中，30°C、210rpm振蕩反應(yīng)8小時(shí)。加入600mL甲苯，3次萃取分液，合并萃取液。于60°C真空濃縮至30ml左右，待冷卻至室溫后放置冰箱，在4°C下保持I小時(shí)，再在-10°C下保持2小時(shí)。抽濾，洗滌結(jié)晶兩次，60°C真空干燥。結(jié)晶產(chǎn)物經(jīng)HPLC檢測(cè)，純度為98. 5%，酶促反應(yīng)轉(zhuǎn)化率為73%。產(chǎn)物質(zhì)譜圖如圖1，顯示分子量為270 ;產(chǎn)物核磁共振圖譜如圖2，由此確定產(chǎn)物為蘆薈大黃素。實(shí)施例2實(shí)施例I中發(fā)酵終止后，將發(fā)酵液(含菌體)經(jīng)4°C、12000rpm,離心15min，棄沉淀，上清液即為酶液。將500mg蘆薈苷，75ml酶液，50ml磷酸鹽緩沖液(160mmOl/L磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液，pH8. 0,1. 5% NaCl)加入到500ml三角瓶中，25°C、210rpm振蕩反應(yīng)24小時(shí)。加入600mL甲苯，3次萃取分液，合并萃取液。于60°C真空濃縮至30ml左右，待冷卻至室溫后放置冰箱，在4°C下保持I小時(shí)，再在-10°C下保持2小時(shí)。抽濾，洗滌結(jié)晶兩次，60°C真空干燥。結(jié)晶產(chǎn)物經(jīng)HPLC檢測(cè)，純度為98. 2%，酶催化反應(yīng)轉(zhuǎn)化率為65%。·實(shí)施例3實(shí)施例I中發(fā)酵終止后，將發(fā)酵液(含菌體)經(jīng)4°C、12000rpm，離心15min，棄沉淀，上清液即為酶液。將200mg蘆薈苷，IOOml酶液，IOOml磷酸緩沖液(80mmol/L磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液，pH7. 0，0. 6%NaCl)加入到500ml三角瓶中，40°C、210rpm振蕩反應(yīng)12小時(shí)。加入600mL甲苯，3次萃取分液，合并萃取液。于60°C真空濃縮至30ml左右，待冷卻至室溫后放置冰箱，在4°C下保持I小時(shí)，再在-10°C下保持2小時(shí)。抽濾，洗滌結(jié)晶兩次，60°C真空干燥。結(jié)晶產(chǎn)物經(jīng)HPLC檢測(cè)，純度為98. 3%，酶催化反應(yīng)轉(zhuǎn)化率為71. 8%。
權(quán)利要求
1.一株重組大腸桿菌菌株 Escherichia coli BL2ItrxB(DE3)-pET28a(+)ECU0416CGMCCNo. 6114。
2.采用權(quán)利要求I所述的菌種制備蘆薈大黃素的方法，包括發(fā)酵培養(yǎng)重組大腸桿菌菌株 Escherichia coli BL21trxB (DE3)-pET28a(+)ECU0416CGMCC No. 6114，和反應(yīng)產(chǎn)物中純化蘆薈大黃素，其特征在于包括酶促水解步驟將培養(yǎng)后的大腸桿菌發(fā)酵液冷凍離心，獲得的上清液作為酶源，以蘆薈苷為底物，蘆薈苷加入量為O. 05 7. 5g/L，酶的加入量為20 300U/g底物，在pH5. O 9. O的磷酸鹽緩沖液中進(jìn)行水解反應(yīng)，反應(yīng)溫度為20 50°C，反應(yīng)時(shí)間為2 24小時(shí)。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述水解反應(yīng)的pH優(yōu)先選擇7 8。
4.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述水解反應(yīng)的溫度優(yōu)選25 40°C。
5.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述磷酸鹽緩沖液為磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液，濃度為20 200mmol/L，其中含O. 2 I. 5% NaCl。
全文摘要
本發(fā)明涉及用重組大腸桿菌菌株Escherichia coli BL21trxB(DE3)-pET28a(+)ECU0416 CGMCC No.6114制備蘆薈大黃素，屬生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明包括發(fā)酵培養(yǎng)重組大腸桿菌和從生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)液中提取純化蘆薈大黃素，其特征在于包括酶促水解步驟將發(fā)酵培養(yǎng)后的大腸桿菌發(fā)酵液冷凍離心，獲得的上清液作為粗酶液，以蘆薈苷為底物，蘆薈苷加入量為0.05～7.5g/L，酶的加入量為20～300U/g底物，在pH5.0～9.0的磷酸鹽緩沖液中進(jìn)行水解反應(yīng)，反應(yīng)溫度為20～50℃，反應(yīng)時(shí)間為2～24小時(shí)。積極效果是利用微生物產(chǎn)生的酶作為催化劑，催化水解價(jià)廉易得的蘆薈苷，制備價(jià)值很高的稀有碳糖苷元——蘆薈大黃素，具有反應(yīng)條件溫和，不需要特殊設(shè)備，能耗低，對(duì)環(huán)境友好等特點(diǎn)，轉(zhuǎn)化率可達(dá)到65％以上，所得蘆薈大黃素純度大于98％。
文檔編號(hào)C12P7/66GK102952773SQ201210290350
公開日2013年3月6日 申請(qǐng)日期2012年8月15日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月15日
發(fā)明者寇正福, 許建和, 劉坐鎮(zhèn), 江邦和, 牛艷豐 申請(qǐng)人:華東理工大學(xué), 上海華震科技有限公司