專利名稱：細(xì)胞培養(yǎng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)胞培養(yǎng)，并且特別涉及原代細(xì)胞、細(xì)胞系、多潛能細(xì)胞、全能細(xì)胞和干細(xì)胞的培養(yǎng)，及通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)條件對(duì)其多種細(xì)胞過(guò)程的調(diào)節(jié)。本發(fā)明涉及在多種條件下利用多重培養(yǎng)步驟來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞通路并且提供用于確定各種多重培養(yǎng)步驟方式對(duì)細(xì)胞過(guò)程，例如生長(zhǎng)、分化和代謝活動(dòng)的影響的方法。
背景技術(shù)：
近年來(lái)細(xì)胞培養(yǎng)已經(jīng)成為生命科學(xué)中的核心技術(shù)。在，Basic CellCulture 1 Oxford University Press (2002)Ed.J.M.Davis ；和 1 Animal CellCulture' Oxford University Press (2000) Ed.John R.W.Masters 中有關(guān)于細(xì)胞培養(yǎng)的描述，兩者在此全部引入作為參考。細(xì)胞培養(yǎng)為研究細(xì)胞過(guò)程，例如細(xì)胞的存活、表型、基因型、增殖和分化，以及生物分子、中間物和產(chǎn)物的形成提供基礎(chǔ)。也從遺傳學(xué)水平-無(wú)論是在分離物或完整的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中-直到個(gè)體的蛋白質(zhì)分子水平，為研究這些過(guò)程的調(diào)節(jié)提供方法。盡管其對(duì)生物學(xué)目前的狀態(tài)有巨大貢獻(xiàn)，即為令人鼓舞的科學(xué)最終提供了遺傳治療和組織工程的可能性，然而在許多方面細(xì)胞培養(yǎng)仍處于發(fā)展?fàn)顟B(tài)。細(xì)胞培養(yǎng)的重要目的是能夠使多種細(xì)胞在體外生長(zhǎng)?？膳囵B(yǎng)生長(zhǎng)的不同細(xì)胞類型的目錄是廣泛的(參見美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，http://www.atcc.0ra:歐洲細(xì)胞保藏中心，http://www.ecacc.0rg.uk:德國(guó)微牛.物保藏中心,http://www.dsmz.de),包括大多數(shù)細(xì)胞類型的代表物，并且隨著越來(lái)越多的培養(yǎng)條件被發(fā)現(xiàn)而不斷增加。盡管本領(lǐng)域中的發(fā)展是穩(wěn)定的，對(duì)于新的細(xì)胞類型的合適培養(yǎng)條件的確定方法仍保持為完全地經(jīng)驗(yàn)主義狀態(tài):通常用反復(fù)試驗(yàn)的方法發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)條件。起始點(diǎn)的選擇經(jīng)常是基于先前別人對(duì)于相似細(xì)胞所使用的，乃至目前 實(shí)驗(yàn)室對(duì)于不同的細(xì)胞所正在使用的培養(yǎng)條件。通常這些條件可能根本是完全不夠的，并且必須重新開始反復(fù)試驗(yàn)的過(guò)程。即使新的培養(yǎng)條件是成功的，也必須記住對(duì)先前方法的改進(jìn)也為實(shí)驗(yàn)引入了歷史性的偏移。例如，大量的早期組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)使得成纖維細(xì)胞能廣泛使用，并且迄今為止大多數(shù)標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞培養(yǎng)條件促進(jìn)來(lái)源于中胚層的細(xì)胞的生長(zhǎng)(成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮、成肌細(xì)胞)。根據(jù)這些條件開發(fā)用于上皮細(xì)胞和其他細(xì)胞類型的選擇性生長(zhǎng)的培養(yǎng)基是一種挑戰(zhàn)。對(duì)于一些細(xì)胞類型現(xiàn)在已知血清一一用于中胚層細(xì)胞的許多培養(yǎng)基的正常成分一一實(shí)際上抑制生長(zhǎng)。在此所描述的本發(fā)明的一個(gè)方面是開發(fā)容許特定細(xì)胞類型的存活、增殖或生長(zhǎng)以及保持其表型的合適培養(yǎng)條件的方法。除促進(jìn)細(xì)胞增殖的條件外，現(xiàn)代組織培養(yǎng)中特別重要的步驟是能夠控制或指導(dǎo)細(xì)胞向特定的表型分化。因?yàn)榧?xì)胞系的增殖需要細(xì)胞數(shù)目增加，絕大多數(shù)的培養(yǎng)條件已經(jīng)發(fā)展至促進(jìn)最大的細(xì)胞增殖。并不令人驚訝的是這些條件對(duì)細(xì)胞分化沒有幫助，其中細(xì)胞生長(zhǎng)經(jīng)常受到限制乃至消除了細(xì)胞生長(zhǎng)。促進(jìn)細(xì)胞增殖的條件一般是低的細(xì)胞密度、低的Ca2+濃度、和存在生長(zhǎng)因子，例如表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)和血小板衍生的生長(zhǎng)因子(TOGF)。另一方面，在高細(xì)胞密度、高Ca2+濃度和存在分化誘導(dǎo)物，例如激素(例如氫化可的松)、旁泌性因子(例如IL-6、KGF、NGF)、類視黃醇以及甚至平面的極性化合物，例如二甲基亞砜(DMSO)的條件下促進(jìn)白細(xì)胞郁積和分化。因此可能需要不同的條件用于特定細(xì)胞系的增殖和分化，當(dāng)然這些相應(yīng)的條件可能在不同譜系的細(xì)胞之間是不同的。在此所描述的本發(fā)明的第二個(gè)方面是用于發(fā)現(xiàn)容許細(xì)胞選擇性分化的合適培養(yǎng)條件的方法。在細(xì)胞培養(yǎng)中還遇到的一些常見問(wèn)題是原代細(xì)胞系的有限壽命，隨著傳代及其轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系特性的變化伴隨有重要細(xì)胞特性的丟失。這些影響嚴(yán)重地限制了培養(yǎng)細(xì)胞供實(shí)驗(yàn)或分析之用，例如如下所述基于細(xì)胞的分析的實(shí)用性。原代細(xì)胞，即從組織新分離的細(xì)胞，極大地提供了最精確的細(xì)胞培養(yǎng)模型，因?yàn)樗鼈儽憩F(xiàn)出與其組織起源廣泛相似的方式。值得注意的是，仍然沒有開發(fā)出培養(yǎng)原代細(xì)胞的可靠方法，因此這些細(xì)胞在體外顯示出有限的壽命。例如當(dāng)試圖擴(kuò)增原代培養(yǎng)物或當(dāng)試圖進(jìn)行更長(zhǎng)時(shí)間的實(shí)驗(yàn)時(shí)，這表現(xiàn)出嚴(yán)重的技術(shù)限制。與原代培養(yǎng)物的使用相關(guān)的進(jìn)一步問(wèn)題是由于它們需要恒定的新鮮分離物，可能很難找到原材料，特別是來(lái)自于人的原材料，也很難獲得表現(xiàn)一致的品系。因此本發(fā)明的第三個(gè)方面是培養(yǎng)原代細(xì)胞以獲得具有延長(zhǎng)壽命的有存活力培養(yǎng)物的方法。如果原代培養(yǎng)物在體外 維持延長(zhǎng)的時(shí)間，它們一般經(jīng)受大部分細(xì)胞死亡的危險(xiǎn)期，然而幸存的細(xì)胞是壽命較長(zhǎng)的并且可進(jìn)行無(wú)限培養(yǎng)。大多數(shù)的這些連續(xù)細(xì)胞系幾乎總是如同細(xì)胞存在于完整動(dòng)物組織中時(shí)的細(xì)胞的弱表現(xiàn)物。對(duì)于此的一個(gè)原因是容許細(xì)胞變得永生的過(guò)程也對(duì)細(xì)胞的特性有影響。例如，大多數(shù)已建立的細(xì)胞培養(yǎng)物已經(jīng)停止表達(dá)組織特異的基因，并且替代的只表達(dá)為在細(xì)胞培養(yǎng)中連續(xù)生長(zhǎng)所需要的管家基因一一因此大多數(shù)這種細(xì)胞系相互之間的相似性比與其最初來(lái)源的組織之間的相似性要高。例如，大多數(shù)肝細(xì)胞系已經(jīng)停止表達(dá)藥物一代謝酶，該酶一般可能使其成為用于測(cè)試藥物毒性的重要工具。在此所描述的本發(fā)明的進(jìn)一步方面是培養(yǎng)細(xì)胞的方法，以使得它們提供更精確的組織模型。這隨后可能改善基于細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)和分析的可靠性和預(yù)測(cè)功效。本領(lǐng)域中需要培養(yǎng)細(xì)胞的改進(jìn)技術(shù)，以及發(fā)現(xiàn)和實(shí)施這種技術(shù)來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞過(guò)程，例如生長(zhǎng)、分化、代謝活動(dòng)、和表型表達(dá)的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供新的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，該技術(shù)是基于將細(xì)胞培養(yǎng)作為涉及以限定順序進(jìn)行系列培養(yǎng)步驟的動(dòng)力學(xué)過(guò)程從而更好地達(dá)到預(yù)期效果的概念。本發(fā)明認(rèn)識(shí)到可開發(fā)順序暴露于所選擇試劑的方式以調(diào)節(jié)細(xì)胞過(guò)程，因此達(dá)到先前不能通過(guò)傳統(tǒng)技術(shù)可得到的控制水平。本發(fā)明致力于解決通過(guò)傳統(tǒng)技術(shù)即使能夠也很難解決的涉及多個(gè)步驟和試劑的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。由于傳統(tǒng)細(xì)胞培養(yǎng)的繁重特性，復(fù)雜的多階段方法中組織培養(yǎng)條件的經(jīng)驗(yàn)主義確定不是在實(shí)踐中可實(shí)行的，因?yàn)樗ù罅康墓ぷ髫?fù)荷。在第一個(gè)方面，本發(fā)明提供用于確定多種培養(yǎng)條件對(duì)細(xì)胞的影響的方法，包括下列步驟:
(a)提供第一組各自包括一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞單元群，并且將所述的群體暴露于所需要的培養(yǎng)條件；(b)再重分一個(gè)或多個(gè)所述的群體以產(chǎn)生進(jìn)一步的細(xì)胞單元群；(C)將所述的進(jìn)一步的群體暴露于所需要的培養(yǎng)條件；(d)任選地，根據(jù)需要反復(fù)地重復(fù)步驟(b)-(c);以及(e)評(píng)估已經(jīng)接觸細(xì)胞的培養(yǎng)條件對(duì)所述的給定細(xì)胞單元的影響。有利的是，根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞群是匯合的并且隨后被分開。因此在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于確定多種培養(yǎng)條件對(duì)細(xì)胞的影響的方法，包括下列步驟:(a)提供第一組各自包括一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞單元群，并且將所述的群體暴露于所需要的培養(yǎng)條件；(b)匯聚兩個(gè)或多個(gè)所述的群體以形成至少一個(gè)庫(kù)；(C)再重分所述庫(kù)以產(chǎn)生進(jìn)一步的細(xì)胞單元群；(d)將所述的進(jìn)一步的群體暴露于所需要的培養(yǎng)條件；(e)任選地，根據(jù)需要反復(fù)地重復(fù)步驟(b)-(d);以及(f)評(píng)估細(xì)胞已經(jīng)接觸的培養(yǎng)條件對(duì)給定細(xì)胞單元的影響。本發(fā)明致力于所有的細(xì)胞過(guò)程，包括細(xì)胞的表型、基因型、分子產(chǎn)生、活力和增殖以及分化。優(yōu)選地，使用本發(fā)明鑒定導(dǎo)致細(xì)胞分化的條件。例如可通過(guò)使細(xì)胞經(jīng)受合適的培養(yǎng)條件來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞沿著所需要的發(fā)育 途徑分化。也研究改變培養(yǎng)條件的時(shí)機(jī)以更好地限定細(xì)胞的發(fā)育程序。培養(yǎng)條件包括生長(zhǎng)培養(yǎng)基、化學(xué)制品、分子、和存在于生長(zhǎng)培養(yǎng)基中的大分子試齊 、溫度狀況、基質(zhì)、大氣條件、物理的細(xì)胞處理等。本發(fā)明的上述方法，被稱為組合的細(xì)胞培養(yǎng)、或分開-匯聚的培養(yǎng)，容許細(xì)胞經(jīng)受一系列培養(yǎng)條件，并且在培養(yǎng)基中以系統(tǒng)的和高度多產(chǎn)的方式接觸一系列試劑。盡管可通過(guò)與組合化學(xué)類似的方式高度有效地使用分開和匯合的重復(fù)循環(huán)，考慮到必要的處理能力可使用包括至少2個(gè)連續(xù)的分開步驟(無(wú)再匯合)的方案。這種方法的缺點(diǎn)是它們可能迅速地產(chǎn)生極大量的已經(jīng)不同處理的分離樣品。然而優(yōu)點(diǎn)是各個(gè)樣品不需要費(fèi)力的重疊合法，因?yàn)槠渲械募?xì)胞單元只暴露于一組條件。因此，考慮到合適的樣品處理設(shè)備，分開的處理可能產(chǎn)生快速的結(jié)果。本發(fā)明使用細(xì)胞單元。這種單元可以是單個(gè)細(xì)胞，或者更有優(yōu)勢(shì)的是兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞的克隆，該細(xì)胞是以甚至在分開匯合培養(yǎng)過(guò)程期間可抗破壞的形式排列的。例如，可在固體基質(zhì)，例如珠子上培養(yǎng)細(xì)胞，如下進(jìn)行更詳細(xì)地描述。優(yōu)選地,可對(duì)細(xì)胞單元進(jìn)行標(biāo)記。標(biāo)記允許對(duì)細(xì)胞已經(jīng)接觸的培養(yǎng)條件,或暴露于不同培養(yǎng)條件的細(xì)胞單元進(jìn)行追蹤；因此，任何給定的細(xì)胞單元可通過(guò)其標(biāo)記讀取以確定它如何來(lái)源于起始細(xì)胞匯合物或培養(yǎng)物。標(biāo)記可能是任何種類的分子或物理形式，包括核酸標(biāo)記、射頻編碼標(biāo)記、熒光或光學(xué)的標(biāo)記、和表面或基質(zhì)上的細(xì)胞單元的空間編碼。本發(fā)明的方法容許以多道傳遞高通量分析的方式測(cè)試成千的或上百萬(wàn)的細(xì)胞培養(yǎng)條件和試劑，以確定為達(dá)到相對(duì)于任何細(xì)胞過(guò)程所需要的結(jié)果而必需的條件。因此，本發(fā)明提供用于將細(xì)胞暴露于多種細(xì)胞培養(yǎng)條件的方法，包括下列步驟:(a)提供第一組各自包括一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞單元群，并且將所述的群體暴露于所需要的培養(yǎng)條件；(b)再重分一個(gè)或多個(gè)所述的群體以產(chǎn)生進(jìn)一步的細(xì)胞單元群；(C)將所述的進(jìn)一步的群體暴露于所需要的培養(yǎng)條件；以及(d)任選地，根據(jù)需要反復(fù)地重復(fù)步驟(b)-(c)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，如上所述使用匯合步驟。在如此的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于確定多種培養(yǎng)條件對(duì)細(xì)胞的影響的方法，包括下列步驟:(a)提供第一組各自包括一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞單元群，并且將所述的群體暴露于所需要的培養(yǎng)條件；(b)匯合兩個(gè)或多個(gè)所述的群體以形成至少一個(gè)第二庫(kù)；(C)再重分第二庫(kù)以產(chǎn)生進(jìn)一步的細(xì)胞單元群；(d)將所述的進(jìn)一步的群體暴露于所需要的培養(yǎng)條件；(e)任選地，根據(jù)需要反復(fù)地重復(fù)步驟(b)-(d);以及(f)評(píng)估細(xì)胞已經(jīng)接觸的培養(yǎng)條件對(duì)給定細(xì)胞單元的影響。在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供用于鑒定影響細(xì)胞過(guò)程的基因的方法，包括下列步驟:a)根據(jù)本發(fā)明中上述的方面來(lái)確定一種或多種培養(yǎng)條件對(duì)細(xì)胞單元的影響；

b)當(dāng)所述的細(xì)胞接觸所述的培養(yǎng)條件時(shí)，在所述的細(xì)胞單元中分析基因表達(dá)；以及c)鑒定在所需要的培養(yǎng)條件下差異表達(dá)的基因。優(yōu)選地，所使用的培養(yǎng)條件引起細(xì)胞過(guò)程的變化；選擇這些培養(yǎng)條件用于產(chǎn)生待分析基因表達(dá)的細(xì)胞?？衫萌魏伪容^性的表達(dá)監(jiān)測(cè)技術(shù)便利地分析基因表達(dá)，包括基于PCR的技術(shù)、基因表達(dá)的系列分析(SAGE)、或例如可從如AfTymetrix供應(yīng)商廣泛獲得的陣列技術(shù)。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供用于產(chǎn)生編碼影響細(xì)胞過(guò)程的基因產(chǎn)物的核酸的方法，包括如上鑒定基因，以及通過(guò)核酸合成或生物復(fù)制制備所述基因的至少編碼區(qū)域。在進(jìn)一步的方面，提供用于在細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞過(guò)程的方法，包括下列步驟:a)根據(jù)本發(fā)明鑒定與細(xì)胞過(guò)程相關(guān)的一個(gè)或多個(gè)差異表達(dá)的基因；以及b)在細(xì)胞中調(diào)節(jié)所述的一種或多種基因的表達(dá)?？赏ㄟ^(guò)例如轉(zhuǎn)染或其他方式將基因轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中，以使得其以瞬時(shí)或永久的方式過(guò)表達(dá)而調(diào)節(jié)細(xì)胞中基因的表達(dá)。備選地，可例如通過(guò)增強(qiáng)子插入或施用在基因表達(dá)中產(chǎn)生增加(例如安慰誘導(dǎo)物)或降低(例如反義RNA1、轉(zhuǎn)錄因子)的外源試劑而改變內(nèi)源基因的表達(dá)。此外，可施用基因產(chǎn)物本身或?qū)爰?xì)胞以實(shí)現(xiàn)增加其活性。而且可對(duì)細(xì)胞施用增減基因產(chǎn)物活性的試劑(例如競(jìng)爭(zhēng)性的和非競(jìng)爭(zhēng)性的抑制劑、藥物、藥品)。在更進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供用于鑒定細(xì)胞中細(xì)胞過(guò)程狀態(tài)的方法，包括下列步驟:a)如上所述鑒定與細(xì)胞過(guò)程相關(guān)的一個(gè)或多個(gè)差異表達(dá)的基因；以及b)檢測(cè)細(xì)胞中所述的一個(gè)或多個(gè)基因表達(dá)的調(diào)節(jié)，由此確定所述細(xì)胞中細(xì)胞過(guò)程的狀態(tài)。優(yōu)選地，用于這個(gè)分析的基因編碼細(xì)胞標(biāo)記，其可例如通過(guò)免疫測(cè)定進(jìn)行檢測(cè)。備選地，基因產(chǎn)物可以是能夠根據(jù)熒光的、色度學(xué)的、放射度的、或其他方法學(xué)分析活性的酶。本發(fā)明進(jìn)一步地提供用于調(diào)節(jié)細(xì)胞過(guò)程的方法，包括下列步驟:a)根據(jù)本發(fā)明中上述的方面來(lái)確定一種或多種培養(yǎng)條件對(duì)細(xì)胞單元的影響；b)將細(xì)胞暴露于影響細(xì)胞過(guò)程變化的培養(yǎng)條件；以及c)分離所需要的細(xì)胞。因此根據(jù) 本發(fā)明的上述方面，本發(fā)明提供用于從雙潛能、多潛能或全能的祖代產(chǎn)生分化細(xì)胞的方法。分化的細(xì)胞、特別是部分分化的、多潛能的細(xì)胞、或發(fā)育定型但未分化的祖細(xì)胞在藥物發(fā)現(xiàn)、細(xì)胞治療和需要限定譜系的細(xì)胞的其他步驟中是有用的。也提供一種用于鑒定能夠誘導(dǎo)細(xì)胞過(guò)程的試劑的方法，包括下列步驟:a)根據(jù)本發(fā)明上述的方面來(lái)確定一種或多種試劑對(duì)細(xì)胞單元的影響；以及b)鑒定在細(xì)胞單元中誘導(dǎo)細(xì)胞過(guò)程的試劑?？赏ㄟ^(guò)常規(guī)的化學(xué)、生物化學(xué)或其他技術(shù)合成根據(jù)本發(fā)明鑒定的試劑，并用于在例如在此所描述的細(xì)胞中調(diào)節(jié)特定細(xì)胞過(guò)程的方法。此外本發(fā)明廣泛提供培養(yǎng)附著于固體載體，例如附著于微載體或珠子的細(xì)胞的方法。這種載體可由大分子組成，例如纖維素、葡聚糖、瓊脂糖、或丙烯酰胺、或無(wú)機(jī)材料，例如玻璃?？赏ㄟ^(guò)物理或化學(xué)處理進(jìn)一步改進(jìn)載體的表面，例如吸附或共價(jià)交聯(lián)具有所需要電荷或其他所需要特性的分子實(shí)體。備選地，載體可由細(xì)胞或包封在基質(zhì)內(nèi)的細(xì)胞組成，該基質(zhì)容許灌注亞細(xì)胞大小的物質(zhì)。微載體培養(yǎng)具有顯著的優(yōu)點(diǎn)，包括擴(kuò)大規(guī)模的培養(yǎng)，以及根據(jù)需要容許細(xì)胞單元便利地暴露于所選擇的培養(yǎng)條件以產(chǎn)生所需要的細(xì)胞過(guò)程。因此在廣泛的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于在體外培養(yǎng)細(xì)胞的方法，包括使所述的細(xì)胞附著于微載體或珠子生長(zhǎng)。優(yōu)選地，細(xì)胞經(jīng)受至少一個(gè)培養(yǎng)條件的變化。優(yōu)選地，它們經(jīng)受2、3、4、5、6、7、8、9或10或10種以上不同的培養(yǎng)條件。優(yōu)選地，所述的培養(yǎng)條件的變化包括培養(yǎng)基的變化。此外本發(fā)明提供用于培養(yǎng)細(xì)胞的方法，其中如本發(fā)明前述實(shí)施方案所描述的產(chǎn)生匯合的細(xì)胞并加以再重分。因此，在一個(gè)方面中，提供用于體外培養(yǎng)細(xì)胞的方法，包括下列步驟:a)組合在不同條件下生長(zhǎng)的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)物；以及b)在普通的條件下培養(yǎng)該細(xì)胞。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，提供用于體外培養(yǎng)細(xì)胞的方法，包括下列步驟:a)培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)物；以及b)將所述的培養(yǎng)物分為兩組或多組細(xì)胞群，并且在兩種或多種不同種類的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)所述的細(xì)胞群。優(yōu)選地，將細(xì)胞暴露于3、4、5、6、7、8、9、10種或10種以上不同的培養(yǎng)條件。所使
用的培養(yǎng)條件有利地包括培養(yǎng)基的變化。此外本發(fā)明廣泛提供附著于微載體，例如珠子來(lái)體外培養(yǎng)干細(xì)胞和來(lái)源于干細(xì)胞的分化細(xì)胞的方法。微載體培養(yǎng)具有顯著的優(yōu)點(diǎn)，包括擴(kuò)大規(guī)模的培養(yǎng)，以及根據(jù)需要容許干細(xì)胞單元暴露于所選擇的培養(yǎng)條件以獲得所需要的生長(zhǎng)和/或分化條件。因此在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于在體外培養(yǎng)干細(xì)胞和來(lái)源于干細(xì)胞的分化細(xì)胞的方法，包括使所述的細(xì)胞附著于微載體或珠子生長(zhǎng)。
有利地，細(xì)胞經(jīng)受至少一個(gè)培養(yǎng)條件的變化。優(yōu)選地，它們經(jīng)受2、3、4、5、6、7、8、9、10或10種以上不同的培養(yǎng)條件。優(yōu)選地，所述的培養(yǎng)條件的變化包括培養(yǎng)基的變化。此外本發(fā)明提供用于培養(yǎng)干細(xì)胞的方法，其中如本發(fā)明前述實(shí)施方案所描述的產(chǎn)生匯合的干細(xì)胞并加以再重分。因此，在一個(gè)方面中，提供用于體外培養(yǎng)干細(xì)胞和來(lái)源于干細(xì)胞的分化細(xì)胞的方法，包括下列步驟:a)組合在不同條件下生長(zhǎng)的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)物；以及b)在普通的條件下培養(yǎng)該細(xì)胞。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，提供用于體外培養(yǎng)干細(xì)胞和來(lái)源于干細(xì)胞的分化細(xì)胞的方法，包括下列步驟: a)培養(yǎng)干細(xì)胞培養(yǎng)物；以及b)將所述的培養(yǎng)物分為兩組或多組干細(xì)胞群，并且在兩種或多種不同種類的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)所述的干細(xì)胞群組。優(yōu)選地，將細(xì)胞暴露于3、4、5、6、7、8、9、10或10種以上不同的培養(yǎng)條件。所使用
的培養(yǎng)條件有利地包括培養(yǎng)基的變化。有利地，以細(xì)胞單元的方式培養(yǎng)細(xì)胞或干細(xì)胞，每個(gè)細(xì)胞單元包括一個(gè)或多個(gè)這種細(xì)胞。例如，該細(xì)胞單元可以是單個(gè) 細(xì)胞。然而，各個(gè)細(xì)胞單元可能包括附著或結(jié)合固體基質(zhì)，例如微載體或珠子的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞或干細(xì)胞。進(jìn)一步地固體基質(zhì)包括孔或培養(yǎng)基可滲透的屏障物。根據(jù)本發(fā)明用于培養(yǎng)細(xì)胞或干細(xì)胞的方法可以在合適的生物反應(yīng)器中擴(kuò)大規(guī)模。例如，本發(fā)明的方法可利用超過(guò)50g干重的微載體來(lái)實(shí)施。


圖1顯示進(jìn)行三輪分開-匯合細(xì)胞培養(yǎng)的實(shí)施例。通過(guò)在給定的條件下進(jìn)行生長(zhǎng)來(lái)獲得細(xì)胞單元群。將細(xì)胞單元描繪為球狀物而細(xì)胞單元群顯示在培養(yǎng)瓶中。將細(xì)胞單元分為3等分，在標(biāo)示為A、B、C的不同生長(zhǎng)條件下培養(yǎng)2天。隨后匯合細(xì)胞單元并且再一次分為3等分，在條件D、E或F下生長(zhǎng)。在這個(gè)步驟進(jìn)行2輪后，可見多種細(xì)胞群已經(jīng)暴露于所有可能的細(xì)胞培養(yǎng)條件的組合。圖2顯示分開-匯合細(xì)胞培養(yǎng)的另一個(gè)實(shí)例。在這種情況下，實(shí)驗(yàn)從A、B和C3群開始。在第一個(gè)步驟中匯合樣品，隨后分為D、E和F群。圖3顯示分開-匯合方法的變化，其中來(lái)自A、B和C的群直接分為D、E和F群而沒有先前的匯合。個(gè)別細(xì)胞群的分隔可以是隨機(jī)的或可以是預(yù)定的。圖4顯示分開-匯合方法的進(jìn)一步變化，其中將細(xì)胞群A、B和C分為細(xì)胞群D、E和F而沒有先前的匯合，但是在第二個(gè)步驟中細(xì)胞群D、E和F匯合并隨后分為細(xì)胞群G、H和I。圖5顯示分開-分開的方法，包括將細(xì)胞群A分開以形成細(xì)胞群B、C和D的第一步驟，以及將細(xì)胞群B、C和D分開以形成細(xì)胞群E-M的第二步驟。圖6顯示包含分開-分開步驟地分開-匯合方法。在2輪的分開和匯合后，分開細(xì)胞群A、B和C而沒有先前的匯合，結(jié)果形成來(lái)源于細(xì)胞群A、B或C的3組不同的細(xì)胞群譜系。注意可使用包括分開-分開步驟來(lái)推導(dǎo)細(xì)胞效應(yīng)的產(chǎn)生中細(xì)胞培養(yǎng)條件的作用。例如，如果在只來(lái)源于譜系A(chǔ)的細(xì)胞單元中觀察到細(xì)胞效應(yīng)，而假定在譜系A(chǔ)、B和C的分散后的多種細(xì)胞群中分析的細(xì)胞培養(yǎng)條件是相同的，那么在分支點(diǎn)的細(xì)胞群A的培養(yǎng)條件必定對(duì)細(xì)胞效應(yīng)是必不可少的。也注意圖1-6中所說(shuō)明的方法可進(jìn)行許多組合使用。圖7顯示包括多潛能的胚胎干細(xì)胞、表達(dá)嵌合的τ -綠色熒光蛋白、附著于多孔微載體(Cytopore 2, Amersham Biosciences)的細(xì)胞單兀。圖8Α-Η顯示通過(guò)抗體染色法確定神經(jīng)膠質(zhì)標(biāo)記GFAP的表達(dá)，表明包含表達(dá)τ_綠色熒光蛋白(GFP)融合蛋白質(zhì)的ES細(xì)胞和多孔微載體Cultispher G的細(xì)胞單元正在進(jìn)行分化。A-D顯示利用40Χ物鏡在相差顯微鏡(A)下，以及在熒光作用下觀察到的細(xì)胞單元，其中利用DAPI (B)、和(紅色)標(biāo)記GFAP (C)以及(綠色)GFP (D)染成藍(lán)色的細(xì)胞核是明顯的。圖C和D顯示似乎是暗示為神經(jīng)膠質(zhì)包裹神經(jīng)元過(guò)程的細(xì)胞的線性陣列(白色箭頭)。E-H顯示對(duì)照細(xì)胞單元，其中已經(jīng)除去了抗-GFAP的第一抗體。圖1顯示通過(guò)熒光顯微術(shù)獲得的合成圖像，顯示在無(wú)孔微載體(Cytodex 3，Amersham Biosciences)上生長(zhǎng)的分化的胚胎干細(xì)胞。該細(xì)胞表達(dá)τ-GFP并且用針對(duì)神經(jīng)元-特異的蛋白質(zhì)β微管蛋白III的熒光抗體免疫化學(xué)地染成紅色。黃色著色表明紅色和綠色的同時(shí)染色。圖9顯不包括附著于無(wú)孔微載體(Cytodex 3, Amersham Biosciences)的HepG2細(xì)胞的細(xì)胞單元的相差(圖A、C、E)和熒光顯微照片。圖A/B:陽(yáng)性對(duì)照細(xì)胞單元顯示乙氧基9-羥基-3-異吩唑酮轉(zhuǎn)化為紅色熒光產(chǎn)物；圖C/D:以同樣方式培養(yǎng)的陰性對(duì)照細(xì)胞單元，其中沒有加入乙氧基9-羥基-3-異吩唑酮；圖E/F:分開-匯合實(shí)驗(yàn)后的細(xì)胞單元，表明一些用P450誘導(dǎo)劑β -萘黃酮處理的細(xì)胞單元具有高水平的P450，并且能夠快速地轉(zhuǎn)化乙氧基9-羥基-3-異吩唑酮為熒光產(chǎn)物(圖F)，同時(shí)通過(guò)不表達(dá)高水平Ρ450的大量細(xì)胞增殖經(jīng)受分開-匯合培養(yǎng)的其他細(xì)胞單元(例如圖E的底部右側(cè)的明顯細(xì)胞單元)。圖10顯示利用RF ID標(biāo)記細(xì)胞單元。圖A:玻璃包封的射頻轉(zhuǎn)發(fā)器IDlOO-A(Trovan);圖B:在玻璃包封的射頻轉(zhuǎn)發(fā)器的直線邊緣上生長(zhǎng)的表達(dá)τ-GFP融合體蛋白質(zhì)的小鼠胚胎干細(xì)胞(光學(xué)顯微術(shù)，頂部；熒光顯微術(shù)，底部；合并成像，中部)；(C)顯示在玻璃包封的射頻轉(zhuǎn)發(fā)器的圓頭上生長(zhǎng)的表達(dá)GFP的胚胎干細(xì)胞(光學(xué)顯微術(shù)，頂部；熒光顯微術(shù),底部；合并成像，中部)。圖11表明小鼠ES細(xì)胞的分開-匯合培養(yǎng)后有差異的基因表達(dá)。使ES細(xì)胞在Cytopore 2微載體上，在沒有加入物(泳道1、4、7、10)、或加有I μ M LiCl (2、5、8、11)、或I μ M視黃酸(3、6、9、12)的ES培養(yǎng)基(A)、CDM⑶、或DMEM(C)中生長(zhǎng)。從該細(xì)胞制備cDNA，并且以相等的數(shù)量用對(duì)照基因甘油醛3磷酸脫氫酶(G3TOH)、和未分化的ES細(xì)胞的標(biāo)記物(0ct4)、神經(jīng)元前體(Nestin)、和內(nèi)皮細(xì)胞(HNF3 β )的寡核苷酸引物進(jìn)行PCR。該照片是PCR產(chǎn)物的溴化乙唳-染色的瓊脂糖凝膠,其以開括號(hào)(open brackets)表明。'PD'表明引物-二聚體產(chǎn)物。圖12顯示微載體的標(biāo)記。圖A-D:沒有(A、B)或有(C、D)生物素?；目筥膠原抗體孵育的、用鏈霉抗生物素-FITC染色的CytodeX3微載體，并且在相差(A、C)和熒光(B、D)顯微鏡下觀察。圖E-H:沒有(E、F)或有(G、H)交聯(lián)的生物素部分的、用鏈霉抗生物素-包被的I μ m直徑的紅色熒光珠染色的Cultispher G微載體，并且在相差(E、G)和熒光(F、H)顯微鏡下觀察。圖片a顯示將CytodeX3微載體與表達(dá)τ -GFP轉(zhuǎn)基因的ES細(xì)胞一起接種。圖13顯示具有2種不同熒光標(biāo)記的微載體的2個(gè)群體的標(biāo)記。將CytodeX3微載體分別與紅色或綠色的鏈霉抗生物素乳狀珠孵育，然后以1:1比率混合。利用相差顯微鏡術(shù)(A)進(jìn)行觀察，并且用濾光器檢測(cè)綠色(C)或紅色(D)熒光。B是C+D的合并照像。兩個(gè)標(biāo)記是容易檢測(cè)的，并且沒有檢測(cè)到標(biāo)記的顯著轉(zhuǎn)移。圖14表明具有2種不同突光標(biāo)記的微載體的雙標(biāo)記。將Cytodex3微載體與紅色和綠色鏈霉抗生物素乳狀珠的1:1混合物孵育。在相差顯微鏡(A)下進(jìn)行觀察，并且用濾光器檢測(cè)綠色(C)或紅色(D)熒光。B是C+D的合并照像。每種微載體都是雙標(biāo)記的。圖15顯示利用相差(圖A)或熒光(圖B)顯微鏡檢測(cè)顯示細(xì)胞過(guò)程的細(xì)胞單元。可利用熒光顯微術(shù)⑶容易地從背景辨別出表達(dá)τ-GFP融合蛋白的細(xì)胞單元，并且可從混合物人工分離出來(lái)。圖16 顯不來(lái)自利用 COPAS 選擇(Union Biometricalnc., SomerviIle,MA)儀器自動(dòng)分析微載體和細(xì)胞單元的的數(shù)據(jù)。圖A和B:將懸浮在PBS中的CytodeX3微載體通過(guò)分揀器并且監(jiān)測(cè)大小(飛行時(shí)間；T0F)對(duì)光散射(消光；Ext) [A]，以及監(jiān)測(cè)綠色熒光(FLUl)對(duì)紅色熒光(FLU2) [B]。圖C和D:對(duì)標(biāo)記有紅色熒光乳狀珠的CytodeX3微載體的分析顯示Ext對(duì)T0F[C]、和熒光[D]的曲線圖；圖B和D的比較說(shuō)明微載體的標(biāo)記導(dǎo)致其紅色熒光信號(hào)的增加。圖E和F:分析包括CytodeX3和表達(dá)τ-GFP轉(zhuǎn)基因的ES細(xì)胞的細(xì)胞單元群。Ext對(duì)T0F[E]的曲線圖中增加的散射和綠色熒光的寬范圍(FLUl) [F]顯示可根據(jù)細(xì)胞數(shù)目分揀細(xì)胞單元。圖17顯示鑒定用于標(biāo)記細(xì)胞單元的標(biāo)記。圖A-D:用生物素修飾的Cultispher微載體的鏈霉抗生物素-FITC標(biāo)記(A、B)或其天然的未處理狀態(tài)(C、D)。圖E-G:在相差顯微鏡術(shù)(E)下，和在綠色(F)和紅色(G)落射熒光光學(xué)裝置下觀察包括表達(dá)τ-GFP融合蛋白的ES細(xì)胞,和用鏈霉抗生物素-包被的I μ M紅色-熒光乳狀珠(Sigma)標(biāo)記的生物素?；疌ultispher G微載體的細(xì)胞單元，以分別顯像GFP-標(biāo)記的細(xì)胞和紅色突光標(biāo)記。圖H-K:利用I μ M紅色-熒 光乳狀珠(Sigma)的對(duì)照樣品校準(zhǔn)FACS，顯示FL3熒光通路⑴中特征性的前向和旁側(cè)的-散射參數(shù)(H;方框區(qū)域)和特征性的熒光強(qiáng)度。通過(guò)控制預(yù)先確定的標(biāo)記的大小參數(shù)對(duì)單獨(dú)蛋白水解消化的、用I μ M紅色-熒光乳狀珠(Sigma)標(biāo)記的細(xì)胞單元進(jìn)行FACS分析(J ;方框區(qū)域)，然后檢測(cè)特征性標(biāo)記的特征性的FL3通路強(qiáng)度(K)。圖18顯示鑒定用于標(biāo)記微載體的多個(gè)標(biāo)記。圖A:使用對(duì)照標(biāo)記的前進(jìn)/旁側(cè)散射參數(shù)限定控制門大小為4.4 μ Μ(控制門Rl)、5.5μΜ(控制門R2)、和1μΜ(控制門R3)珠。圖B-D:蛋白水解消化的標(biāo)記的微載體的FACS分析顯示存在相應(yīng)于來(lái)自Bangs Labs5號(hào)組的綠色熒光4.4 μ M珠的標(biāo)記(圖B);來(lái)自Bangs Labsl號(hào)組的綠色-熒光5.5 μ M珠(圖C)，和來(lái)自Sigma的I μ M紅色熒光珠(圖D)。
具體實(shí)施例方式定義培養(yǎng)條件如在此所使用的，術(shù)語(yǔ)"培養(yǎng)條件"是指為了促進(jìn)所述細(xì)胞的生長(zhǎng)或分化而放置細(xì)胞或細(xì)胞接觸的環(huán)境。因此，該術(shù)語(yǔ)是指可能影響細(xì)胞的生長(zhǎng)和/或分化的培養(yǎng)基、溫度、大氣條件、基質(zhì)、攪拌條件等。更特別地，該術(shù)語(yǔ)是指可摻入培養(yǎng)基并可影響細(xì)胞的生長(zhǎng)和/或分化的特定試劑。細(xì)胞如在此所指，細(xì)胞被定義為能夠獨(dú)立發(fā)揮功能的生物體的最小結(jié)構(gòu)單位，或單細(xì)胞的生物體，其由全部都被半透性的細(xì)胞膜或細(xì)胞壁包圍的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和多種細(xì)胞器組成。該細(xì)胞可以是原核的、真核的或古細(xì)菌的。例如，細(xì)胞可以是真核細(xì)胞。優(yōu)選哺乳動(dòng)物細(xì)胞，特別是人細(xì)胞。細(xì)胞可以是天然的或例如通過(guò)遺傳操作或在培養(yǎng)物中傳代而改進(jìn)以獲得所需要的特性。對(duì)干細(xì)胞如下進(jìn)行更詳細(xì)地定義，其是能夠產(chǎn)生一個(gè)以上分化的細(xì)胞類型的全能性、多潛能或多能細(xì)胞。干細(xì)胞可以在體外分化以產(chǎn)生分化的細(xì)胞，其本身可以是多能的，或可以是末端分化的。體外分化的細(xì)胞是已經(jīng)通過(guò)將干細(xì)胞暴露于一種或多種促進(jìn)細(xì)胞分化的試劑而人工產(chǎn)生的細(xì)胞。細(xì)胞過(guò)程細(xì)胞過(guò)程是任何胞內(nèi)或胞外發(fā)生或觀察到的，或可歸于細(xì)胞的特性、功能、過(guò)程、事件、起因或效應(yīng)。細(xì)胞過(guò)程的實(shí)例包括但不限于，活力、衰老、死亡、多能性、形態(tài)學(xué)、信號(hào)、結(jié)合、識(shí)別、分子的產(chǎn)生或破壞(降解作用)、突變、蛋白折疊、轉(zhuǎn)錄、翻譯、催化作用、突觸傳遞、泡囊轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞器功能、細(xì)胞周期、代謝、增殖、分裂、分化、表型、基因型、基因表達(dá)、或這些過(guò)程的調(diào)控。細(xì)胞單元一群細(xì)胞，其可以是一種細(xì)胞的群體?？梢允腔旧喜浑x解細(xì)胞單元本身而分揀、重分和處理的細(xì)胞單元的匯合，該細(xì)胞單元表現(xiàn)為細(xì)胞的集落并且在該細(xì)胞單元中各個(gè)細(xì)胞暴露于相同的培養(yǎng)條件。例如，細(xì)胞單元可包括粘附細(xì)胞群體的珠子。全能性全能細(xì)胞是存在于生物體中具有分化成為任何類型的體細(xì)胞或生殖細(xì)胞的潛力細(xì)胞。因此，可以從全能細(xì)胞以一些方式衍生出任何所需要的細(xì)胞。多潛能性多潛能的細(xì)胞是可分化成為一種以上但不是所有細(xì)胞類型的細(xì)胞。標(biāo)記如在此所 使用的,標(biāo)記或標(biāo)記物是鑒定細(xì)胞單元和/或確定接觸細(xì)胞單元的培養(yǎng)條件、或培養(yǎng)條件的順序的方式。因此，標(biāo)記可以是各自在特定的培養(yǎng)步驟加入的一組標(biāo)記；或在開始階段或?qū)嶒?yàn)中加入的標(biāo)記，其根據(jù)接觸細(xì)胞單元的培養(yǎng)步驟進(jìn)行改進(jìn)或在培養(yǎng)期間進(jìn)行追蹤；或只是定位的參考，其容許推導(dǎo)所使用的培養(yǎng)步驟。標(biāo)記或標(biāo)記物也可以是在任一時(shí)刻報(bào)告或記錄細(xì)胞單元的位置或同一性，或?qū)ⅹ?dú)特的識(shí)別器指派給細(xì)胞單元的裝置。標(biāo)記或標(biāo)記物的實(shí)例是單一序列的分子、結(jié)構(gòu)或質(zhì)量；或熒光分子或物體，例如珠子；或射頻和其他轉(zhuǎn)發(fā)器；或具有獨(dú)特標(biāo)記或形狀的物體。暴露于培養(yǎng)條件當(dāng)使細(xì)胞處于與培養(yǎng)基接觸，或在影響一種或多種細(xì)胞過(guò)程，例如細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、或新陳代謝狀態(tài)的條件下生長(zhǎng)時(shí)，該細(xì)胞是暴露于培養(yǎng)條件的。因此，如果培養(yǎng)條件包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞，將細(xì)胞置于培養(yǎng)基中足夠的時(shí)段以使它具有效應(yīng)。同樣地，如果該條件是溫度條件，在所需要的溫度培養(yǎng)細(xì)胞。匯合一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞單元群的匯合包括混合群體以產(chǎn)生單個(gè)的群體或匯合，其包括一種以上背景的細(xì)胞單元，即，已經(jīng)暴露于一種以上不同種類的培養(yǎng)條件的背景細(xì)胞單元?？梢赃M(jìn)一步隨機(jī)或非隨機(jī)地重分匯合成為群體；這種群體不是為了現(xiàn)成的目的而本身"匯合"，但是可以通過(guò)聯(lián)合，例如在暴露于不同種類的培養(yǎng)條件后而自身匯合的。增殖在此細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞增殖是可互換使用的，以表示細(xì)胞數(shù)目的增加而不是分化成為不同的細(xì)胞類型或譜系。換言之，該術(shù)語(yǔ)表示活細(xì)胞數(shù)目的增加。優(yōu)選地增殖不伴隨有表型或基因型中的明顯變化。分化細(xì)胞分化是從不同細(xì)胞類型的細(xì)胞類型進(jìn)行發(fā)育。例如，雙潛能、多潛能或全能細(xì)胞可以分化成為神經(jīng)細(xì)胞。分化可以伴隨有增殖，或可以是獨(dú)立的。術(shù)語(yǔ)'分化'泛指從較少發(fā)育性限定的細(xì)胞類型獲得成熟細(xì)胞類型的表型，例如神經(jīng)元或淋巴細(xì)胞，但是不排除轉(zhuǎn)分化，由此一種成熟細(xì)胞類型可能轉(zhuǎn)化成另一種成熟細(xì)胞類型，例如神經(jīng)元到淋巴細(xì)胞。分化狀態(tài)細(xì)胞的分化狀態(tài)是細(xì)胞沿著特定的途徑或譜系分化的水平。細(xì)胞過(guò)程的狀態(tài)細(xì)胞過(guò)程的狀態(tài)是指無(wú)論是否發(fā)生或沒有發(fā)生細(xì)胞過(guò)程，以及在復(fù)雜的細(xì)胞過(guò)程中，可能表示該細(xì)胞過(guò)程中特定的步驟或階段。例如，細(xì)胞中的細(xì)胞分化途徑可以是非活化的或可能受到誘導(dǎo)，以及可以包括許多不連續(xù)的階段或組成，例如由存在特征性種類的酶或中間物而表征的信號(hào)事件?；蚧蚴?編碼基因產(chǎn)物，如多肽或RNA基因產(chǎn)物的核酸。如在此所使用的，基因至少包括編碼基因產(chǎn)物的編碼序列；它可以任選地包括一個(gè)或多個(gè)為編碼序列的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯所必需的調(diào)節(jié)區(qū)域。基因產(chǎn)物基因產(chǎn)物一般是由基因以常規(guī)的方式編碼的蛋白質(zhì)。然而，該術(shù)語(yǔ)也包括非多肽的基因產(chǎn)物，例如核糖核酸，其由基因編碼。核酸合成可以根據(jù)任何可利用的技術(shù)合成核酸。優(yōu)選地，核酸合成是自動(dòng)的。此夕卜，可以通過(guò)生物復(fù)制產(chǎn)生核酸，例如通過(guò)在細(xì)菌或真核細(xì)胞中根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行克隆和復(fù)制。差異表達(dá)可通過(guò)基因表達(dá)分析，例如在基因芯片上通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法鑒定應(yīng)答細(xì)胞培養(yǎng)條件而在不同水平表達(dá)的基因。在測(cè)試條件下的細(xì)胞比在備選條件下的細(xì)胞中差異表達(dá)的基因相對(duì)于總的基因表達(dá)水平顯示更多或更少數(shù)量的mRNA或基因產(chǎn)物。轉(zhuǎn)染可以通過(guò)任何適當(dāng)?shù)姆绞綄⒒蜣D(zhuǎn)染到細(xì)胞中。在此使用該術(shù)語(yǔ)以表示常規(guī)的轉(zhuǎn)染，例如利用磷酸鈣，但是也包括將核酸轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中的其他技術(shù)，包括轉(zhuǎn)化、病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)、電穿孔等。調(diào)節(jié)使用術(shù)語(yǔ)調(diào)節(jié)表示增加和/或減少被調(diào)節(jié)的參數(shù)。因此，基因表達(dá)的調(diào)節(jié)包括增加基因表達(dá)和降低基因表達(dá)?；诩?xì)胞的分析基于細(xì)胞的分析是現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)科學(xué)的重要部分，包括對(duì)涉及使用細(xì)胞的步驟的任何分析?；诩?xì)胞的分析可用于跨越醫(yī)藥藥物發(fā)現(xiàn)和開發(fā)過(guò)程的幾乎所有階段，又在提供關(guān)于化合物如何在生物系統(tǒng)中相互作用，以及其如何與分離物中潛在的藥物靶標(biāo)相互作用的信息中是有價(jià)值的。例如，基于細(xì)胞的分析可用于鑒定和驗(yàn)證潛在的藥物靶物。已經(jīng)開發(fā)基于細(xì)胞的分析來(lái)用于鑒定涉及疾病過(guò)程的基因或細(xì)胞途徑，用于確定靶基因的功能，或測(cè)量在活化某些基因或其產(chǎn)物后誘導(dǎo)的表型變化?；诩?xì)胞的分析也可用于對(duì)先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)、選擇和優(yōu)化的藥物發(fā)現(xiàn)。不同于經(jīng)常被用于常規(guī)高通量篩選分析的生物化學(xué)分析，基于細(xì)胞的分析可提供關(guān)于藥物特性，例如吸收作用、滲透性、選擇性、特異性和代謝的信息。因此，更好地鑒定在基于細(xì)胞篩選后所選擇的先導(dǎo)化合物，更可能提供有價(jià)值的引導(dǎo)，并且更少可能在藥物發(fā)現(xiàn)過(guò)程的后繼階段中被除去?；诩?xì)胞的分析的主要應(yīng)用是在毒性篩選中。藥物發(fā)現(xiàn)和開發(fā)的決定性部分是藥物候選物的篩選，以除去可能產(chǎn)生副作用的化合物。然而，現(xiàn)在的方法大多是不夠的，特別是利用動(dòng)物模型用于毒性篩選是費(fèi)錢且費(fèi)時(shí)的。此外，動(dòng)物模型可能是不可靠的，因?yàn)檫@些模型中的結(jié)果不總是準(zhǔn)確預(yù)測(cè)化合物將在人類中如何進(jìn)行。因此基于人細(xì)胞的篩選是優(yōu)選的。干細(xì)朐在 Stem Cells !Scientific Progress and Future Research Directions 中詳細(xì)描述了干細(xì)胞。Department of Health and Human Services.2001 年 6 月 http://www.nih.govlnews/stemcell/scireport.htm.在此引入該報(bào)告的內(nèi)容作為參考。干細(xì)胞是能夠分化形成至少一種以及有時(shí)形成許多特化的細(xì)胞類型的細(xì)胞?？蓮母杉?xì)胞形成的不同細(xì)胞的庫(kù)被認(rèn)為是完全的；即它包括組成生物體的所有不同的細(xì)胞類型。從干細(xì)胞相對(duì)充足的早期胚胎到它們相對(duì)稀少的成體，干細(xì)胞在生物體的終生自始至終都存在。存在于成體動(dòng)物的許多組織中的干細(xì)胞在正常的組織修復(fù)和體內(nèi)平衡中是很重要的。這些細(xì)胞的存在增加了提供產(chǎn)生特化的功能性細(xì)胞來(lái)移植到人中和在疾病組織中替代死的或無(wú)功能細(xì)胞的方式的可能性。由此可以提供治療的疾病的列表包括帕金森氏癥、糖尿病、脊髓損傷、中風(fēng)、慢性心臟病、晚期腎病、肝功能衰竭和腫瘤。為了使細(xì)胞代替治療成為可行的，在干細(xì)胞研究中需要至少兩個(gè)主要的突破。首先，需要開發(fā)使干細(xì)胞生長(zhǎng)至足夠數(shù)目的條件，以便能夠制備治療相關(guān)劑量的細(xì)胞。理論上大規(guī)模的培養(yǎng)物可能為治療多數(shù)患者提供材料。其次，由于移植到動(dòng)物中的未分化干細(xì)胞經(jīng)常產(chǎn)生腫瘤，設(shè)想使干細(xì)胞分化成為更特化的細(xì)胞對(duì)于細(xì)胞代替治療將是首要的，因此它對(duì)于發(fā)現(xiàn)使干細(xì)胞分化成為不同疾病需要的特別特化的細(xì)胞類型的條件是必需的。很明顯克服這些障礙的關(guān)鍵是設(shè)計(jì)用于干細(xì)胞及其衍生物的細(xì)胞培養(yǎng)的合適方法。然而，由于上述闡明的理由，即涉及細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)發(fā)展的反復(fù)試驗(yàn)的繁重過(guò)程，該任務(wù)是特別困難的。因此在此所描述的本發(fā)明的一個(gè)應(yīng)用是說(shuō)明用于干細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的技術(shù)。干細(xì)胞的類型關(guān)于什么構(gòu)成干細(xì)胞仍然存在相當(dāng)多的爭(zhēng)論，然而為了這些討論的目的，關(guān)鍵特征是能夠分化成為不同的細(xì)胞類型。如下列出干細(xì)胞的實(shí)例。不同的干細(xì)胞具有形成多種細(xì)胞類型的不同潛能:精子發(fā)生干細(xì)胞是單潛能的，因?yàn)樗鼈冎蛔匀坏禺a(chǎn)生精子，但是造血干細(xì)胞是多能的，而胚胎干細(xì)胞被認(rèn)為能夠產(chǎn)生所有的細(xì)胞類型，是全能性或多潛能的。迄今為止已經(jīng)分離了 3種類型的哺乳動(dòng)物多潛能干細(xì)胞。這些細(xì)胞能夠產(chǎn)生通常來(lái)源于胚胎的所有3種胚層(內(nèi)胚層、中胚層和外胚層)的細(xì)胞類型。干細(xì)胞的3種類型是:來(lái)源于睪丸腫瘤的胚胎性癌(EC)細(xì)胞；來(lái)源于植入前胚胎(通常為胚囊)的胚胎干(ES)細(xì)胞；來(lái)源于植入后胚胎(通常為將會(huì)成為生殖腺部分的胎兒細(xì)胞)的胚胎生殖(EG)細(xì)胞。正好因?yàn)樗鼈兪嵌酀撃艿?，這些細(xì)胞在指導(dǎo)分化的作用中受到特別的注意。干細(xì)胞也存在于成 年生物體中。成年干細(xì)胞是存在于分化(特化的)組織中，對(duì)本身進(jìn)行更新，并且能夠分化產(chǎn)生更特化細(xì)胞的未分化細(xì)胞。最近已經(jīng)表明成年干細(xì)胞具有可塑性，即它們能夠分化產(chǎn)生具有不是其駐留的組織或組織起源的實(shí)際胚層的特性的細(xì)胞類型。例如，已經(jīng)表明血液干細(xì)胞(來(lái)源于中胚層)能夠分化成為神經(jīng)元(通常來(lái)源于外胚層)。Toma等人(2001, Nature Cell Biol.3, p778_784)最近已經(jīng)描述了鑒定和分離來(lái)源于皮膚下真皮層的新型干細(xì)胞。定義這些干細(xì)胞是皮膚衍生的前體(SKP)細(xì)胞?？赏ㄟ^(guò)在聚賴氨酸上培養(yǎng)和變化培養(yǎng)基中血清的濃度誘導(dǎo)SKP細(xì)胞分化。當(dāng)缺少血清時(shí)，它們分化成為神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞；加入3%血清它們分化成為平滑肌細(xì)胞；增加血清至10%導(dǎo)致SKP細(xì)胞分化成為脂肪細(xì)胞。迄今為止已經(jīng)報(bào)道成年的干細(xì)胞存在于各種組織中，如神經(jīng)系統(tǒng)、骨髓和血液、肝臟、骨骼肌、皮膚和消化系統(tǒng)。除成年的干細(xì)胞之外，存在許多類型的祖代或前體細(xì)胞。這些細(xì)胞部分地限制了其分化潛能并且可能存在于所有的機(jī)體組織中，它們能夠分化但是不同于干細(xì)胞，因?yàn)樗鼈兊乃薪M成成分不是廣泛的，并且由于限制，它們不能自我更新。最近的證據(jù)甚至表明分化的細(xì)胞類型能夠改變表型。這個(gè)現(xiàn)象，被定義為轉(zhuǎn)分化，是分化的細(xì)胞類型在有或沒有介入細(xì)胞分裂下轉(zhuǎn)化為另一個(gè)細(xì)胞類型。先前普遍接受的是終端分化狀態(tài)是固定的，但是現(xiàn)在表明有時(shí)候分化可能是逆轉(zhuǎn)或改變的?，F(xiàn)在體外方法是可利用的，其中可誘導(dǎo)細(xì)胞系轉(zhuǎn)分化(參見Shen,Slack & Tosh 2000,Nature Biol, vol 2,p.879-887 Horb 等人，2003，CurrentBiol.Vol 13，pl05_115)。最后，已經(jīng)報(bào)道特化的細(xì)胞類型可能去分化而產(chǎn)生具有分化成為進(jìn)一步細(xì)胞類型的潛能的干樣細(xì)胞。干細(xì)朐的牛長(zhǎng)和分化干細(xì)胞的重要特性是它們?cè)谂囵B(yǎng)中對(duì)稱分裂，產(chǎn)生2個(gè)子細(xì)胞的能力，該子細(xì)胞是其衍生的干細(xì)胞的精確拷貝。這容許干細(xì)胞在培養(yǎng)中以其未分化的狀態(tài)擴(kuò)展，產(chǎn)生足夠用于生物研究甚至細(xì)胞治療的物質(zhì)。隨著對(duì)個(gè)體的深入研究可理解干細(xì)胞能夠如此進(jìn)行的方式，然而對(duì)于促進(jìn)干細(xì)胞更新的因子知之甚少。一般地，多潛能的干細(xì)胞系保持在成纖維細(xì)胞的有絲分裂非活化的滋養(yǎng)層上，或這種細(xì)胞的培養(yǎng)基條件中。假定培養(yǎng)的細(xì)胞從培養(yǎng)基移出/中和一些未知的因子，和/或它們提供抑制干細(xì)胞分化和促進(jìn)干細(xì)胞自我更新的因子。這種因子的一種是白血病抑制因子(LIF)，與IL-6相關(guān)的細(xì)胞因子家族成員，其當(dāng)缺少飼養(yǎng)細(xì)胞時(shí)能夠促進(jìn)小鼠ES細(xì)胞自我更新。在缺乏飼養(yǎng)細(xì)胞(和/或LIF)時(shí)生長(zhǎng)的干細(xì)胞經(jīng)常自然和不規(guī)則 地分化，產(chǎn)生分化細(xì)胞類型的混合物。影響干細(xì)胞自我更新的因子可能是刺激或抑制的，并且可能在胞外或胞內(nèi)發(fā)揮作用。就分泌因子LIF來(lái)說(shuō)，已知其胞外的受體是gpl30，而且該蛋白質(zhì)的活化足以抑制鼠類ES細(xì)胞的分化。在細(xì)胞內(nèi)，gpl30的重要下游效應(yīng)物是轉(zhuǎn)錄-3的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)物和活化物(STAT-3)。另一個(gè)對(duì)保持干細(xì)胞多潛能性特別重要的分子是轉(zhuǎn)錄因子Oct-4，當(dāng)人工下調(diào)時(shí)其導(dǎo)致小鼠ES細(xì)胞中可塑性狀態(tài)的丟失。也已經(jīng)闡明了天然抑制ES細(xì)胞自我更新的其他信號(hào)分子，例如促分裂原-活化的蛋白激酶。干細(xì)胞研究的主要目的是發(fā)現(xiàn)天然和合成的因子、藥物、多肽、基因、寡核苷酸、組織培養(yǎng)基和條件、特定處理的培養(yǎng)基、培養(yǎng)細(xì)胞、和對(duì)促進(jìn)多種類型干細(xì)胞分化潛能的擴(kuò)展和保持具有作用的其他刺激。這包括成年干細(xì)胞，目前其還沒有以細(xì)胞培養(yǎng)的方式進(jìn)行可觀地?cái)U(kuò)展。干細(xì)胞研究的第二大挑戰(zhàn)是指導(dǎo)分化為特定的功能性的細(xì)胞類型，其能替代在多種疾病狀態(tài)中丟失的細(xì)胞，并且產(chǎn)生積極的臨床結(jié)果。誘導(dǎo)干細(xì)胞開始分化實(shí)際上是相當(dāng)簡(jiǎn)單的過(guò)程。例如，從培養(yǎng)的培養(yǎng)物移出并且在附著基質(zhì)上生長(zhǎng)匯合的ES細(xì)胞將開始自然地分化。類似地，從培養(yǎng)的培養(yǎng)物移出并且在非附著的基質(zhì)上生長(zhǎng)的ES細(xì)胞將從所有的3種胚層形成未分化的和部分分化細(xì)胞的胚狀體-簇?？呻S后分離這些細(xì)胞，接種為單層的培養(yǎng)物，并且暴露于促進(jìn)直接分化的因子。與包括許多不同細(xì)胞類型的混合物的分化細(xì)胞的胚狀體或未處理的培養(yǎng)物相比，很可能通過(guò)很少類型的分化細(xì)胞增殖暴露于這些因子的培養(yǎng)物。盡管如此，即使有也是極少數(shù)設(shè)計(jì)了產(chǎn)生基本上純的分化細(xì)胞培養(yǎng)物的條件。此外還不清楚即使有設(shè)計(jì)用于干細(xì)胞分化產(chǎn)生適于細(xì)胞代替治療的細(xì)胞的任何方法，可能該細(xì)胞不能末端分化成為需要的準(zhǔn)確表型，或分化的細(xì)胞在體內(nèi)不再是有生存力的。已經(jīng)用于誘導(dǎo)干細(xì)胞的直接分化的因子包括:視黃酸、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白質(zhì)(BMPs)、堿性的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、活化素-A、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β-1 (TFG β-l)、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、神經(jīng)生長(zhǎng)因子、sonic hedgehog (SHH)、白介素-3(IL-3)、白介素-6(IL-6)、粒性巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、促紅細(xì)胞生成素、維生素D3、地塞米松、β-巰基乙醇、丁基化羥基苯甲醚、5-氮胞苷、DMS0、胰島素、甲狀腺激素(T3)、LIF、胎牛血清、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、鋼化因子、氧濃度的變化、抗壞血酸、β-磷酸甘油、煙酰胺、血小板衍生生長(zhǎng)因子(TOGF)、cAMP、多種細(xì)胞粘附分子和底物等。除這些限定的因子之外，很可能不限定提取物，例如條件培養(yǎng)基、人和動(dòng)物組織的勻漿物、或植物提取物，都可用于指導(dǎo)干細(xì)胞分化。這些不定提取物的漸進(jìn)性分級(jí)分離可以產(chǎn)生活性部份或具有高效力的更純的成分?？蓪⑦@些因子單獨(dú)或組合或以對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果至關(guān)重要的限定順序的方式加入用于特定實(shí)驗(yàn)的生長(zhǎng)培養(yǎng)基。已經(jīng)設(shè)計(jì)用于體外干細(xì)胞分化的許多系統(tǒng)是復(fù)雜的多階段步驟，其中多種步驟的準(zhǔn)確特征以及多種步驟的時(shí)序是重要的。例如，Lee等人(2000, Nature Biotechnology,vol.18, p 675-679)使用5階段的方案從小鼠ES細(xì)胞衍生出多巴胺能神經(jīng)元:1)使未分化的ES細(xì)胞在涂有白明膠的組織培養(yǎng)表面上在ES細(xì)胞培養(yǎng)基中，在存在LIF時(shí)擴(kuò)展；2)在ES細(xì)胞培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)4天產(chǎn)生胚狀體；3)nestin-陽(yáng)性的細(xì)胞選自在組織培養(yǎng)表面上接種8天后的ITSFn培養(yǎng)基中的胚狀體；4)在含有bFGF/層粘連蛋白的N2培養(yǎng)基中擴(kuò)展nestin-陽(yáng)性細(xì)胞6天；5)最后通過(guò)從含有層粘連蛋白的N2培養(yǎng)基取出bFGF誘導(dǎo)擴(kuò)展的神經(jīng)元前體細(xì)胞分化。在連續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)的第二個(gè)實(shí)施例 中，Bonner-Weir等人[Proc.Natl.Acad.Sc1.(2000)97 =7999-8004]從人胰管細(xì)胞得到產(chǎn)生胰島素的細(xì)胞:1)通過(guò)在存在血清2_4天時(shí)選擇性粘附在固體表面上而從胰島細(xì)胞選擇導(dǎo)管細(xì)胞；2)隨后取出血清并向成纖維細(xì)胞的導(dǎo)管上皮細(xì)胞加入角質(zhì)化細(xì)胞生長(zhǎng)因子5-10天；以及3)用胞外基質(zhì)制品'Matrigel'覆蓋細(xì)胞3-6周。在連續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)的另一個(gè)實(shí)施例中，Lumelsky等人[Science (2001) 292:1389-1394]通過(guò)直接分化小鼠胚胎干(ES)細(xì)胞衍生出分泌胰島素的細(xì)胞:1)在存在LIF時(shí)擴(kuò)展ES細(xì)胞2-3天；2)在缺乏LIF4天中產(chǎn)生胚狀體；3)利用ITSFn培養(yǎng)基選擇nestin-陽(yáng)性細(xì)胞6_7天；4)在含有B27培養(yǎng)基添加劑和bFGF的N2培養(yǎng)基中擴(kuò)展胰腺的內(nèi)分泌前體6天；以及5)通過(guò)取出bFGF并加入煙酰胺誘導(dǎo)分化為分泌胰島素的細(xì)胞。然而不只是多種步驟的順序和持續(xù)時(shí)間或加入不同因子的系列對(duì)于決定細(xì)胞分化是重要的。因?yàn)榕咛グl(fā)育受到透露定位信息的信號(hào)因子梯度作用的調(diào)節(jié)，所以預(yù)期單個(gè)信號(hào)因子的濃度，以及兩個(gè)或多個(gè)因子的相對(duì)濃度在體外和體內(nèi)指定細(xì)胞群體的命運(yùn)中是重要的。因子濃度在發(fā)育期間發(fā)生變化，干細(xì)胞對(duì)于相同分子的不同濃度產(chǎn)生不同的應(yīng)答。例如，從晚期胚胎的CNS分離的干細(xì)胞對(duì)不同濃度的EGF產(chǎn)生不同的應(yīng)答:EGF的低濃度產(chǎn)生增殖的信號(hào)，而EGF的高濃度產(chǎn)生增殖和分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞。已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)體外影響干細(xì)胞的自我更新和分化的許多因子是天然存在的分子。這是可以預(yù)期的，因?yàn)橥ㄟ^(guò)沿著信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑起作用的信號(hào)分子和受體誘導(dǎo)和控制了分化。然而同理，很可能許多合成的化合物對(duì)干細(xì)胞分化具有影響。通常人工合成這種在信號(hào)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑內(nèi)具有與細(xì)胞靶物(也稱為藥物靶)相互作用的高度可能性的合成化合物，例如用于醫(yī)藥公司的藥物篩選。一旦已知這些化合物可用于自體內(nèi)指導(dǎo)干細(xì)胞的分化，或可用于體內(nèi)給藥，在這種情況下它們將對(duì)患者靶器官中的固有干細(xì)胞起作用。組織培養(yǎng)中的常見變化在開發(fā)用于成功培養(yǎng)特定細(xì)胞類型的條件中，或?yàn)榱藢?shí)現(xiàn)或調(diào)節(jié)細(xì)胞過(guò)程，考慮多種因素通常是很重要的。一個(gè)重要因素是判斷是否懸浮增殖細(xì)胞或以附著于基質(zhì)的單層增殖細(xì)胞。大多數(shù)細(xì)胞優(yōu)選附著于基質(zhì)，而一些細(xì)胞，包括轉(zhuǎn)化的細(xì)胞、造血細(xì)胞和來(lái)自腹水的細(xì)胞可懸浮增殖。假定是貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)，一個(gè)重要因素是選擇粘附基質(zhì)。大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室使用一次性的塑料作為用于組織培養(yǎng)的基質(zhì)。已經(jīng)使用的塑料包括聚苯乙烯(最常見的類型)、聚乙烯、聚碳酸酯、有機(jī)玻璃、PVC、特氟隆、玻璃紙和醋酸纖維素?？墒褂萌魏嗡芰?，但是其中許多塑料需要處理以使得它們可潤(rùn)濕并且適于細(xì)胞附著。此外可使用任何適當(dāng)制備的固體基質(zhì)提供細(xì)胞的支持物，目前已經(jīng)使用的基質(zhì)包括玻璃(例如明礬-硅酸硼和鈉鈣玻璃)、橡膠、合成纖維、聚合的葡聚糖、金屬(例如不銹鋼和鈦)等。一些細(xì)胞類型，例如支氣管上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮、骨骼肌和神經(jīng)元需要涂有生物制品的生長(zhǎng)基質(zhì)，通常為胞外基質(zhì)材料例如纖粘連蛋白、膠原、層粘連蛋白、多溶素等。生長(zhǎng)基質(zhì)和應(yīng)用方法(濕或干的涂 布、或凝膠)可能對(duì)細(xì)胞過(guò)程，例如細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化特性有影響，而這些必須如上所述憑經(jīng)驗(yàn)確定?？赡芗?xì)胞培養(yǎng)中最重要的變化因素是培養(yǎng)基和補(bǔ)充物，例如血清的選擇。這些為細(xì)胞生長(zhǎng)提供了含水的間隔，以營(yíng)養(yǎng)物和多種因子實(shí)現(xiàn)，其中一些已經(jīng)在上文列出、其它的則很少有限定。一些因子對(duì)粘附是必不可少的，其它對(duì)傳遞信息必不可少(例如激素、促分裂原、細(xì)胞因子)，而其他的可作為解毒物。通常使用的培養(yǎng)基包括RPMI1640、MEM/Hank' s 鹽、MEM/Earle' s 鹽、F12、DMEM/F12、L15、MCDB 153 等。多種培養(yǎng)基在其成分中具有很大的差別，一些常見的差異包括碳酸氫鈉濃度、二價(jià)離子的濃度，例如Ca和Mg，緩沖液組成、抗生素、微量元素、核苷、多肽、合成的化合物、藥物等。已知不同的培養(yǎng)基是選擇性的，指它們只促進(jìn)一些細(xì)胞類型的生長(zhǎng)。培養(yǎng)基補(bǔ)充物，例如血清、腦垂體和其他提取物，經(jīng)常對(duì)培養(yǎng)物中細(xì)胞的生長(zhǎng)是不可缺少的，此外經(jīng)常對(duì)決定培養(yǎng)物中細(xì)胞的表型負(fù)責(zé)，即它們能夠決定細(xì)胞的生存或直接分化。例如分化的細(xì)胞過(guò)程中補(bǔ)充物的作用是復(fù)雜的，并且取決于它們的濃度、它們加入培養(yǎng)物的時(shí)間點(diǎn)、細(xì)胞類型和所使用的培養(yǎng)基。這些補(bǔ)充物的不確定特性及其對(duì)于細(xì)胞表型影響的潛能刺激了無(wú)血清培養(yǎng)基的發(fā)展。對(duì)于所有的培養(yǎng)基，如上所述主要通過(guò)反復(fù)試驗(yàn)進(jìn)行它們的開發(fā)。組織培養(yǎng)的氣相態(tài)是同樣重要的，并且應(yīng)使用的其組成和體積可能取決于所使用培養(yǎng)基的類型、需要的緩沖數(shù)量、培養(yǎng)瓶是否是敞開或密封的、以及特定的細(xì)胞過(guò)程是否需要調(diào)節(jié)。常見的變化包括二氧化碳和氧的濃度。對(duì)組織培養(yǎng)重要的其他條件包括選擇培養(yǎng)容器、罐頂空隙量、接種密度、溫度、培養(yǎng)基變化的頻率、酶處理、振蕩或攪拌的速率和模式。因此變化細(xì)胞培養(yǎng)條件是獲得所需要細(xì)胞過(guò)程的方法。本發(fā)明的一個(gè)方面認(rèn)識(shí)到連續(xù)方式中細(xì)胞培養(yǎng)條件的變化可能是獲得細(xì)胞效應(yīng)的卓有成效的方法。在多種應(yīng)用中，例如在細(xì)胞分化的研究中，經(jīng)常需要特異的連續(xù)不同的組織培養(yǎng)條件以作用于細(xì)胞過(guò)程。不同的條件可包括向/從培養(yǎng)基進(jìn)行加入或取出或在特定的時(shí)間點(diǎn)變化培養(yǎng)基。如下給出這類條件的實(shí)施例，通常是如上所述通過(guò)反復(fù)試驗(yàn)而發(fā)展出來(lái)的。細(xì)胞單元的形成本發(fā)明的一個(gè)重要方面是細(xì)胞群(細(xì)胞集落)能夠在多種條件下生長(zhǎng)在細(xì)胞培養(yǎng)物中，并且當(dāng)受到干擾以及當(dāng)與其他集落混合時(shí)該集落可在多種條件下基本上保持其完整性。這種群體或集落在此稱為細(xì)胞單元。可經(jīng)由例證說(shuō)明，通過(guò)使細(xì)胞在例如載體的固體基質(zhì)上附著培養(yǎng)生長(zhǎng)來(lái)實(shí)現(xiàn)細(xì)胞單元的形成。如果細(xì)胞增殖發(fā)生在接種于載體上后，子細(xì)胞將附著在相同的載體上并且形成相同集落的部分。一般，活的貼壁細(xì)胞不是容易地從其生長(zhǎng)基質(zhì)上分離的，因此不管對(duì)載體進(jìn)行任何機(jī)械操作、振蕩培養(yǎng)基、或轉(zhuǎn)移到另一個(gè)組織培養(yǎng)系統(tǒng)中都可持續(xù)該細(xì)胞集落的完整性。類似地，如果任何時(shí)候多數(shù)載體處于相同的容器中(例如匯合珠子)，將沒有細(xì)胞從一個(gè)珠子實(shí)質(zhì)性的轉(zhuǎn)移到另一個(gè)珠子。在單元或集落中生長(zhǎng)細(xì)胞的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是如果將單元連續(xù)地置于一組不同的組織培養(yǎng)基中，包括該集落的所有細(xì)胞將按相同的順序和相同的時(shí)段暴露于相同的系列培養(yǎng)條件。使細(xì)胞在不一定本身附著于組織培養(yǎng)容器的單元中生長(zhǎng)有下列好處，即能夠隨意移出個(gè)別集落并轉(zhuǎn)入不同的培養(yǎng)容器。該方法的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是能夠最小化組織培養(yǎng):即使與最小的組織培養(yǎng)瓶相比，只需要相對(duì)很少的細(xì)胞來(lái)建立微載體珠子克隆(參見下文)。在載體上形成生長(zhǎng)細(xì)胞單元的進(jìn)一步的優(yōu)點(diǎn)是能夠擴(kuò)大細(xì)胞培養(yǎng)的規(guī)模。在載體上生長(zhǎng)干細(xì)胞提供了擴(kuò)大生產(chǎn)規(guī)模以提供足夠用于干細(xì)胞治療的材料的方法。同樣地，在載體上分化干細(xì)胞提供隨分化進(jìn)行而擴(kuò)大生產(chǎn)規(guī) 模，最后提供足夠用于細(xì)胞替代治療的材料。這種細(xì)胞培養(yǎng)的規(guī)模擴(kuò)大需要至少50g (干重)的微載體，優(yōu)選100g、500g、lkg、10kg或以上。在固體基質(zhì)上形成細(xì)胞單元的另一個(gè)重要優(yōu)點(diǎn)是可通過(guò)多種方式標(biāo)記由于締合而附著細(xì)胞的基質(zhì)。已經(jīng)廣泛使用3_和5_的玻璃珠作為細(xì)胞粘附的基質(zhì)，特別是在使用玻璃珠生物反應(yīng)器(例如由Meredos Gmbh制造)來(lái)擴(kuò)大細(xì)胞培養(yǎng)的規(guī)模時(shí)。這些珠子一般被用于分層包裝而不是分批培養(yǎng)，避免對(duì)貼壁細(xì)胞造成機(jī)械損傷。相比之下，當(dāng)細(xì)胞在較小的載體上生長(zhǎng)時(shí)它們可當(dāng)做懸浮培養(yǎng)物。在小的載體上生長(zhǎng)細(xì)胞的常見方法被稱為微載體細(xì)胞培養(yǎng)(參見'Microcarrier cell culture,Principles and Methods1 , Edition AA,可從Amersham Biosciences (18-1140-62)獲得；在此全部引入作為參考)。商業(yè)上使用微載體培養(yǎng)用于在多達(dá)4000升的發(fā)酵罐中生產(chǎn)抗體和干擾素。各種微載體都是有效的，無(wú)論其形狀和大小以及由不同的材料制成。其中由聚苯乙烯(Biosilon, Nunc)、玻璃(Bioglass, Solohill Eng)、膠原(Biospheres, SolohillEng)、DEAE 交聯(lián)葡聚糖凝膠(Cytodex-1, Pharmacia)、葡聚糖(DormacelI, Pfeifer &Langen)、纖維素(DE-53, Whatman)、白明膠(Gelibead, Hazelton Lab)、和 DEAE 葡聚糖(Microdex7Dextran Prod.)制成的微載體珠子是可商業(yè)購(gòu)買的。根據(jù)珠子的相對(duì)密度、直徑和適于細(xì)胞生長(zhǎng)的表面積可很好表征這些載體。此外可利用許多具有極大增加細(xì)胞生長(zhǎng)的表面積的多孔(微)載體。這些多孔載體的進(jìn)一步特征是它們適合于錨定依賴性的細(xì)胞以及懸浮細(xì)胞的生長(zhǎng)，這些細(xì)胞通過(guò)滯留在開放的連通的孔的網(wǎng)絡(luò)中而被攜帶。多孔載體可利用的材料是例如白明膠(Cultispher G, HyClone)、纖維素(CytocelI, Pharmacia)、聚乙烯(Cytoline I 和 2, Pharmacia)、娃橡膠(Immobasi I, Ashby Scientific)、膠原(Microsphere, Cellex Biosciences),和玻璃(Siran, Schott Glassware) 這些載體是分別適合于攪拌、流化或固定床培養(yǎng)系統(tǒng)的。由于載體的物理性能是已知的，很容易計(jì)算用于實(shí)驗(yàn)的載體的數(shù)目。所述的一些載體和除此之外的許多載體有效的，其作為干制品可準(zhǔn)確地稱重，并隨后通過(guò)在液體培養(yǎng)基中膨脹而制備。此外用于接種在微載體培養(yǎng)中的細(xì)胞數(shù)目是可以計(jì)算并進(jìn)行變化的。例如，以每個(gè)珠子接種6個(gè)細(xì) 胞的Cytodex 3 (2g/升)的培養(yǎng)將產(chǎn)生包含8百萬(wàn)個(gè)微載體的培養(yǎng)物，其中以5X IO4個(gè)細(xì)胞/cm2的密度生長(zhǎng)4千8百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞/升。可通過(guò)細(xì)胞的酶促脫附，和/或通過(guò)合適的載體消化來(lái)收獲在微載體上生長(zhǎng)的細(xì)胞，或從微載體釋放標(biāo)記(參見下文):可通過(guò)胰蛋白酶和/或EDTA溶解白明膠載體，利用膠原酶溶解膠原載體以及利用葡聚糖酶溶解葡聚糖載體。除固體或多孔的微載體之外，可通過(guò)禁閉，即限制在培養(yǎng)基可滲透屏障物的范圍內(nèi)來(lái)分群細(xì)胞。已經(jīng)開發(fā)了膜培養(yǎng)系統(tǒng)，其中可滲透的滲析膜保留細(xì)胞群體，但是容許培養(yǎng)基及其成分在內(nèi)部和外部的間隔進(jìn)行自由交換。也已經(jīng)開發(fā)了在空心纖維柱體中的細(xì)胞培養(yǎng)，大量的纖維以及全部完整的系統(tǒng)都是可商業(yè)購(gòu)買的(例如來(lái)自Amicon，CellexBiosciences)。也已經(jīng)開發(fā)了在半固體基質(zhì)中的細(xì)胞包封，其中通過(guò)吸附、共價(jià)鍵、交聯(lián)或滯留在聚合物基質(zhì)中使細(xì)胞固定。已經(jīng)使用的材料包括白明膠、聚賴氨酸、藻酸鹽和瓊脂糖。一般的方法是在40°C將5%瓊脂糖與在正常生長(zhǎng)培養(yǎng)基中的細(xì)胞混合，利用等體積的石蠟油使該混合物乳化，在冰浴中冷卻產(chǎn)生直徑為80-200 μ M的球狀物。可從油類分離這些球狀物并轉(zhuǎn)入組織培養(yǎng)容器中的培養(yǎng)基中。細(xì)胞截留是用于固定細(xì)胞群的簡(jiǎn)單方法，類似于利用微載體或多孔的基質(zhì)。簡(jiǎn)單的技術(shù)是使細(xì)胞陷入纖維素纖維，例如DEAE、TLC、QAE、TEAE (所有的都獲得自Sigma)中。其他更改進(jìn)的裝置是如Opticel培養(yǎng)系統(tǒng)(Cellex Biosciences)中的適合于懸浮細(xì)胞的陶瓷柱體。除上述產(chǎn)生細(xì)胞單元的方法之外，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將設(shè)想其他產(chǎn)生細(xì)胞群的方法，包括形成細(xì)胞的3D培養(yǎng)物，例如神經(jīng)的球狀物或胚狀體、或利用組織和實(shí)際上完整的生物體，例如果蠅或秀麗線蟲。細(xì)胞單元或包括細(xì)胞單元的基質(zhì)可能與特定的因子相關(guān)，包括但不限于蛋白質(zhì)、核酸或其他化學(xué)品，例如藥物?？赏ㄟ^(guò)許多途徑實(shí)現(xiàn)基質(zhì)的預(yù)處理，例如僅僅通過(guò)使基質(zhì)與目標(biāo)因子孵育，或通過(guò)共價(jià)或非共價(jià)地使因子附著于基質(zhì)?？赏ㄟ^(guò)浸透使可溶性因子結(jié)合到干燥材料中。這個(gè)技術(shù)依賴于攜帶可溶性因子的液體快速進(jìn)入干燥的多孔材料，其附隨地變得溶脹而隨時(shí)可使用?？稍谛纬珊幸蜃拥睦w維蛋白凝塊時(shí)，通過(guò)在凝血酶溶液的纖維蛋白原中混合因子而摻入固體因子。除浸滲之外可設(shè)計(jì)使因子與細(xì)胞群締合的多種其他方法來(lái)截留或包封與細(xì)胞一起的因子。
用于使細(xì)胞群與許多不同因子締合的方法是預(yù)先形成因子的混合物，隨后與特定的細(xì)胞群締合。第二個(gè)方法是以許多因子連續(xù)地處理細(xì)胞群。利用細(xì)胞群生長(zhǎng)基質(zhì)的干燥制劑舉例來(lái)說(shuō)，這個(gè)方法包括首先在包含第一因子的溶液中部分地溶脹該基質(zhì)，隨后進(jìn)一步地在包含第二因子的溶液中進(jìn)行相同溶脹，使兩個(gè)因子都與基質(zhì)締合。通過(guò)設(shè)計(jì)使細(xì)胞群與不同因子的不同組合締合的系統(tǒng)性方法，可能取樣檢查任何組合的一組因子對(duì)細(xì)胞群的影響。不考慮用于處理細(xì)胞單元與因子的方法，該因子被包括細(xì)胞單元的細(xì)胞吸收。稀釋滲入生長(zhǎng)培養(yǎng)基的因子達(dá)到這樣的程度以至它們的濃度低于生理學(xué)相關(guān)的限制并且它們對(duì)任何接觸的附加細(xì)胞群無(wú)效。在例如基質(zhì)外分散的因子成為細(xì)胞單元的一部分取決于下列參數(shù)，例如材料的特性和大小、平均孔徑、以及因子的分子量和濃度。必要時(shí)為了校準(zhǔn)該過(guò)程，可通過(guò)物理的分析，例如HPLC分析或標(biāo)記因子到培養(yǎng)基中的釋放、或通過(guò)生物測(cè)定，例如針對(duì)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng) 性因子的脊神經(jīng)后根神經(jīng)節(jié)長(zhǎng)出的生物測(cè)定來(lái)測(cè)量因子的釋放。細(xì)胞的組合連續(xù)培養(yǎng)分開-匯合的細(xì)胞培養(yǎng)此外形成細(xì)胞單元(特別是顯微的細(xì)胞單元)可用于取樣多重組織培養(yǎng)條件，因?yàn)楦鱾€(gè)細(xì)胞單元構(gòu)成可暴露于各種細(xì)胞培養(yǎng)條件的容易處理的單元。為簡(jiǎn)單起見，在討論中我們假定細(xì)胞群是通過(guò)在微載體培養(yǎng)中生長(zhǎng)而產(chǎn)生的，并且術(shù)語(yǔ)細(xì)胞單元、細(xì)胞群、集落和珠子可互換地使用。然而，所述的方法同樣地適用于任何細(xì)胞單元，例如如上所述的細(xì)胞單元。用于取樣大量細(xì)胞培養(yǎng)條件的特別有效的方法被稱為組合的細(xì)胞培養(yǎng)或分開-匯合的細(xì)胞培養(yǎng)(圖1和2)，在一個(gè)實(shí)施方案中，包括為了取樣多重組合的細(xì)胞培養(yǎng)條件連續(xù)的重分并組合細(xì)胞單元群。在本發(fā)明的一個(gè)方面，操作方法為將最初的起始培養(yǎng)物分成Xl數(shù)目等分的細(xì)胞單元(或不同的起始培養(yǎng)物)，其各自包含分別在不同的培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)的多個(gè)珠子(群體/集落/載體)。細(xì)胞培養(yǎng)給定的時(shí)間后，通過(guò)組合和混合來(lái)自不同等分的珠子而匯合細(xì)胞單元。這個(gè)匯合可再次分開成為X2數(shù)目等分，各自在不同的條件下培養(yǎng)一段時(shí)間隨后再匯合。這個(gè)分開、培養(yǎng)和匯合細(xì)胞單元(或匯合，分開和培養(yǎng)；取決于在何處進(jìn)入循環(huán))的重復(fù)步驟容許系統(tǒng)取樣許多不同細(xì)胞培養(yǎng)條件的組合。實(shí)驗(yàn)的復(fù)雜性，或換言之不同待測(cè)試細(xì)胞培養(yǎng)條件組合的數(shù)目等于在每輪中取樣的不同條件的數(shù)目的產(chǎn)物(X1XX2X...Xn)。注意在隨后的分開前匯合所有細(xì)胞單元的步驟可以是任選的，其中匯合有限數(shù)目的細(xì)胞單元，這可能具有如圖3和4中所說(shuō)明的相同的效應(yīng)。因此本發(fā)明包含許多系統(tǒng)地取樣細(xì)胞培養(yǎng)條件的多重組合的相關(guān)方法，其中成批地處理細(xì)胞單元群。不考慮用這種方法取樣多種細(xì)胞培養(yǎng)條件的精確方式，該方法都是有效的，因?yàn)槎嘀丶?xì)胞單元可共享單個(gè)容器，它們?cè)谙嗤瑮l件下培養(yǎng)，并且可在任一時(shí)刻只利用少量的培養(yǎng)容器進(jìn)行培養(yǎng)(所使用的培養(yǎng)容器的數(shù)目等于分開取樣的數(shù)目)。在許多方面這個(gè)方法的原理相似于大型化學(xué)文庫(kù)的分開合成(被稱為組合化學(xué))，其中取樣在化學(xué)品結(jié)構(gòu)單元群之間結(jié)合的所有可能的組合(參見例如！Combinatorial Chemistry, OxfordUniversity Press (2000), Hicham Fenniri (Editor))。可重復(fù)分開-匯合的細(xì)胞培養(yǎng)許多輪，并且可在每一輪中取樣任意數(shù)目的條件。只要細(xì)胞單元的數(shù)目(或在這個(gè)實(shí)例中為集落化的珠子)大于或等于所有輪中取樣的不同條件的數(shù)目，并且假定細(xì)胞單元的分開完全隨機(jī)發(fā)生，預(yù)計(jì)通過(guò)實(shí)驗(yàn)將取樣到至少一個(gè)已經(jīng)按照多種培養(yǎng)條件組合中的一種培養(yǎng)的細(xì)胞單元。這個(gè)方法可用于取樣對(duì)于任何細(xì)胞類型的生長(zhǎng)或分化條件，或由任何細(xì)胞類型生產(chǎn)生物分子(例如生產(chǎn)促紅細(xì)胞生成素或干擾素)的效率。因?yàn)樵摲椒ㄊ侵貜?fù)的，理論上它適合于測(cè)試多級(jí)的組織培養(yǎng)方法，例如如上所述與干細(xì)胞分化相關(guān)的方法。利用這個(gè)技術(shù)可取樣的變化包括細(xì)胞類型、細(xì)胞群(例如微載體培養(yǎng)、細(xì)胞包封、完整的生物體)、生長(zhǎng)基質(zhì)(例如微載體上有纖粘連蛋白)、細(xì)胞培養(yǎng)一輪的持續(xù)時(shí)間、溫度、不同的培養(yǎng)基(包括成分的不同濃度)、生長(zhǎng)因子、條件培養(yǎng)基、多種細(xì)胞類型的共培養(yǎng)(例如飼養(yǎng)細(xì)胞)、動(dòng)物或植物提取物、藥物、其他的合成化學(xué)品、用病毒感染(包括轉(zhuǎn)基因的病毒)、加入轉(zhuǎn)基因、加入反義或抗基因的分子(例如RNA1、三鏈螺旋)、感覺輸入(就生物體來(lái)說(shuō))、電、光、或紅外刺激等。分開-分開的細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)細(xì)胞單元進(jìn)行分開匯合過(guò)程的目的是將這些細(xì)胞單元有系統(tǒng)地暴露于預(yù)定的條件組合。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將設(shè)想許多不同的方式來(lái)達(dá)到這些結(jié)果。除分開-匯合過(guò)程及其變化之外，也值得簡(jiǎn)要地論述分開-分開過(guò)程。分開-分開過(guò)程包括至少重分細(xì)胞單元群兩次，而不插入細(xì)胞單元的匯合(圖5)。如果將分開-分開過(guò)程進(jìn)行很多輪，產(chǎn)生的分離樣品的數(shù)目按指數(shù)增加。在這種情況下重要的是使用一些自動(dòng)操作水平，例如利用機(jī)器人平臺(tái)和改進(jìn)的取樣追蹤系統(tǒng)。分開-分開步驟的優(yōu)點(diǎn)是(因?yàn)椴唤M合細(xì)胞單元)有可能根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)歷史分離多種細(xì)胞單元的譜系。因此分開-分開步驟可用于推導(dǎo)是否特定的細(xì)胞培養(yǎng)條件決定了任何產(chǎn)生的細(xì)胞過(guò)程并因此用于推導(dǎo)細(xì)胞單元的培養(yǎng)歷史(在圖6中說(shuō)明，并且在'細(xì)胞單元培養(yǎng)歷史的確定'下詳細(xì)說(shuō)明)。預(yù)定的方法可完全隨機(jī)地或可按照預(yù)定的方法完成細(xì)胞單元的分開和/或匯合。細(xì)胞單元在何處隨機(jī)分開和/或匯合，給定細(xì)胞單元在何處分離成為任何群體不是能以任何方式預(yù)定或預(yù)見的。為了產(chǎn)生使至少一個(gè)細(xì)胞單元暴露于細(xì)胞培養(yǎng)條件可能組合的每一種的高可能性，使用大于待測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)條件組合的總數(shù)的細(xì)胞單元數(shù)目是有利的。因此在某些情況下根據(jù)預(yù)定的方法分開和/ 或匯合細(xì)胞單元是有利的，防止了組合的偶發(fā)重復(fù)或遺漏的總的效應(yīng)?？深A(yù)先選擇性地計(jì)劃細(xì)胞單元的預(yù)定處理并且記錄在電子數(shù)據(jù)表或計(jì)算機(jī)程序上，利用自動(dòng)方法，例如機(jī)器人執(zhí)行分開和/或匯合的操作?？赏ㄟ^(guò)任何方式標(biāo)記細(xì)胞單元(參見下文)，例如通過(guò)RFID、光學(xué)標(biāo)記物或空間編碼進(jìn)行標(biāo)記。機(jī)器人裝置能夠確定取樣的同一'I"生，因此根據(jù)預(yù)定的方法區(qū)分樣品，這已經(jīng)有描述(參見'Combinatorial Chemistry,Apractical Approach' , Oxford University Press (2000), Ed H.Fenniri)。備選地，標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)室流體處理和/或組織培養(yǎng)機(jī)器人(例如由Beckman Coulter Inc,Fullerton,CA ；The Automation Partnership, Royston, UK制備)能夠空間地編碼多重抽樣的同一性，并根據(jù)既定程序的方法對(duì)其進(jìn)行加入、除去或移位。細(xì)胞單元的分析和/或分離在每輪細(xì)胞培養(yǎng)后，或在限定的輪數(shù)后，可研究細(xì)胞單元以觀察可能受到組織培養(yǎng)條件影響而產(chǎn)生的任何細(xì)胞過(guò)程。下文的實(shí)例是例證性的而非意在限制本發(fā)明的范圍。在每輪細(xì)胞培養(yǎng)后，或在限定的輪數(shù)后，可分析細(xì)胞單元以確定是否存在成員顯示增加的細(xì)胞增殖。這可通過(guò)各種技術(shù)實(shí)現(xiàn)，例如在顯微鏡下目測(cè)檢查細(xì)胞單元，或測(cè)定細(xì)胞的標(biāo)記產(chǎn)物特征。這可以是內(nèi)源的標(biāo)記物，例如特定的DNA序列、或可通過(guò)配體或抗體檢測(cè)的細(xì)胞蛋白質(zhì)。備選地可將外源的標(biāo)記物，例如綠色熒光蛋白(GFP)導(dǎo)入細(xì)胞單元進(jìn)行測(cè)試以提供特定(活)細(xì)胞讀數(shù)?？衫酶鞣N活體染色劑顯像活的細(xì)胞，或相反地利用各種方法，例如利用碘化丙錠標(biāo)記死細(xì)胞。此外可通過(guò)各種技術(shù)人工和自動(dòng)化的從未標(biāo)記的細(xì)胞單元分離標(biāo)記的細(xì)胞單元，包括親合純化('淘選')，或通過(guò)突光激活細(xì)胞分揀法(FACS)或廣泛相似的技術(shù)(圖16)。根據(jù)應(yīng)用可使用標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)室設(shè)備，或可能使用特殊的測(cè)試設(shè)備是有利的.例如，某些分析和分揀儀器(例如參見Union Biometrica Inc.,Somerville MA,USA)具有達(dá)到I毫米的流通細(xì)胞直徑，其容許流通分揀直徑達(dá)到500微米的珠子。這些儀器提供珠子大小和吸光度以及來(lái)自標(biāo)記物例如GFP、YFP或DS-紅的2種熒光發(fā)射波長(zhǎng)的讀數(shù)。每小時(shí)180，000個(gè)珠子的分揀速度和分配進(jìn)入多孔平板或進(jìn)入批量受體都是可能的。在每輪細(xì)胞培養(yǎng)后，或在限定的輪數(shù)后，可測(cè)試細(xì)胞單元以確定是否存在成員顯示特定的基因型或表型?？衫霉募夹g(shù)進(jìn)行基因型確定，例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、熒光原位雜交(FISH)、DNA測(cè)序等?？赏ㄟ^(guò)各種技術(shù)進(jìn)行表型確定，例如在顯微鏡下目測(cè)檢查細(xì)胞單元，或檢測(cè)細(xì)胞的標(biāo)記產(chǎn)物特征。這可以是內(nèi)源的標(biāo)記物，例如特定的DNA或RNA序列，或可通過(guò)配體、酶底物的轉(zhuǎn)化、或識(shí)別特定表型的標(biāo)記物而檢測(cè)的細(xì)胞蛋白質(zhì)(例如看見 Appendix E of Stem Cells !Scientific Progress and Future ResearchDirections.Department of Health and Human Services.2001 年6 月；附錄在此引入作為參考)。遺傳標(biāo)記也可以是外源的，即已經(jīng)例如通過(guò)轉(zhuǎn)染或病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)而導(dǎo)入細(xì)胞群體的遺傳標(biāo)記。外源標(biāo)記物的實(shí)例是熒光蛋白質(zhì)(例如GFP)或通常不在特定細(xì)胞譜系中表達(dá)或修飾表位、或來(lái)自不同種屬的細(xì)胞表面抗原。與轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件結(jié)合的轉(zhuǎn)基因或外源標(biāo)記基因可以反映代表內(nèi)源基因特征的模式的方式表達(dá)。這可通過(guò)使基因與最小的細(xì)胞類型特異的啟動(dòng)子締合，或?qū)⑥D(zhuǎn)基因整合到特定的基因座中而實(shí)現(xiàn)(例如參見歐洲專利號(hào)EP 0695351)?？赏ㄟ^(guò)各種技術(shù)人工和自動(dòng)化的從未標(biāo)記的細(xì)胞單元分離標(biāo)記的細(xì)胞單元，包括親合純化('淘選')，或通過(guò)突光激活細(xì)胞分揀法(FACS)。Nishikawa等人(1998,Development vol125，pl747-1757)使用由抗體識(shí)別的細(xì)胞表面標(biāo)記物追蹤全能性鼠ES細(xì)胞的分化。利用FACS能夠鑒定和純化處于各種分化階段的造血系統(tǒng)的細(xì)胞。

用于富集特定基因型或表型的細(xì)胞單元的備選或補(bǔ)充技術(shù)是遺傳選擇所需要的群體。這可例如通過(guò)將可選擇的標(biāo)記物導(dǎo)入到細(xì)胞單元中并分析在選擇性條件下的存活力而實(shí)現(xiàn)，例如參見Soria等人(2000, Diabetes vol 49, pl_6),其使用這種系統(tǒng)從分化的ES細(xì)胞選擇分泌胰島素的細(xì)胞。Li等人(1998，Curr Biol vol 8，p 971-974)通過(guò)在鼠ES細(xì)胞中經(jīng)同源重組將雙功能的選擇標(biāo)記/報(bào)告子β geo (提供β -半乳糖苷酶活性和G418抗性)整合到Sox2位點(diǎn)中來(lái)鑒定神經(jīng)祖代。因?yàn)樯窠?jīng)祖代的一個(gè)特征是表達(dá)Sox2，因此可在利用視黃酸誘導(dǎo)分化后通過(guò)添加G418而從非神經(jīng)元系統(tǒng)選擇整合標(biāo)記基因的這些細(xì)胞。可通過(guò)在顯微鏡下觀察，或通過(guò)監(jiān)測(cè)β-gal活性來(lái)確定細(xì)胞成活力。不同于可通過(guò)利用合適的配體或抗體的基于表型的選擇方式，遺傳選擇可應(yīng)用于任何差異表達(dá)的基因。確定細(xì)胞單元的同一性或細(xì)胞培養(yǎng)歷史當(dāng)處理大量細(xì)胞單元時(shí)，它們的同一性和/或細(xì)胞培養(yǎng)歷史(例如任何一個(gè)群體或單元可能已經(jīng)接觸的一系列培養(yǎng)條件的時(shí)序和準(zhǔn)確特性)可能變得混亂。例如，細(xì)胞培養(yǎng)的分開-匯合方法必定包括在每輪中混合細(xì)胞單元，使得難以追隨個(gè)別單元。確定已經(jīng)經(jīng)受多重培養(yǎng)條件的細(xì)胞單元混合物中細(xì)胞單元的細(xì)胞培養(yǎng)歷史有時(shí)被稱為細(xì)胞培養(yǎng)歷史的，反演，。進(jìn)行這個(gè)過(guò)程的一個(gè)方法是標(biāo)記細(xì)胞單元，因此標(biāo)記細(xì)胞單元是有利的。可在實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，或在每輪實(shí)驗(yàn)期間進(jìn)行標(biāo)記，并且可以包括獨(dú)特的標(biāo)記(在實(shí)驗(yàn)的過(guò)程中可以或未必進(jìn)行改進(jìn))或包括獨(dú)特聚集物的一系列標(biāo)記。類似地，在每輪實(shí)驗(yàn)期間或僅僅在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)進(jìn)行標(biāo)記的讀取。優(yōu)選地，在每輪期間讀取獨(dú)特的標(biāo)記，例如RFID標(biāo)記，而在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)讀取在每一輪連續(xù)加入的標(biāo)記?？赏ㄟ^(guò)各種方式實(shí)現(xiàn)細(xì)胞單元的標(biāo)記，例如標(biāo)記細(xì)胞本身，或細(xì)胞附著或與之關(guān)聯(lián)的任何物質(zhì)。任何化學(xué)品和用于編碼合成的組合文庫(kù)的非化學(xué)方法可能適宜這個(gè)目的，一些在 Methods in Enzymology Vol 267(1996), 1 Combinatorial Chemistry1 ,John N.Abelson(Editor) ；Combinatorial Chemistry, Oxford University Press (2000),Hicham Fenniri (Editor) ;K.Braeckmans 等人，'Scanning the code' , Modern DrugDiscovery (2003 年 2 月)；Κ.Braeckmans 等人，'Encoding microcarriers:Present andFuture Technologies' ；Nature Reviews Drug Discovery, vol.1, p.447-456 (2002)中有描述，其所有的在此引入作為參考。下列是一些標(biāo)記法的實(shí)例。一個(gè)標(biāo)記細(xì)胞單元的方法包括使細(xì)胞單元與標(biāo)記物聯(lián)合，該標(biāo)記物在處于不同的培養(yǎng)條件中時(shí)序貫發(fā)生變化。這可能包括例如向標(biāo)記物加入或減少進(jìn)一步的單元以使得其立體化學(xué)、序列或質(zhì)量發(fā)生改變；或讀寫RF轉(zhuǎn)發(fā)器的電子儲(chǔ)存發(fā)生變化(參見下文)。另一個(gè)標(biāo)記細(xì)胞單元的方法包括每當(dāng)在不同的條件下培養(yǎng)時(shí)連續(xù)地使獨(dú)特的標(biāo)記物與細(xì)胞單元聯(lián)合，以使得標(biāo)記物的后繼檢測(cè)和鑒定提供已經(jīng)接觸細(xì)胞單元的細(xì)胞培養(yǎng)條件的時(shí)序和同一性的明確記錄。標(biāo)記物可能由細(xì)胞吸收，或通過(guò)吸附作用、或合適的配體或抗體、或結(jié)合細(xì)胞-締合的基質(zhì)，例如吸附的載體、膠體力或各種結(jié)合，例如共價(jià)鍵或非共價(jià)鍵，例如生物素-鏈霉抗生物素結(jié)合而附著于細(xì)胞表面。例如，可導(dǎo)入細(xì)胞或附著于與細(xì)胞締合的基質(zhì)的一個(gè)簡(jiǎn)單標(biāo)記物是限定長(zhǎng)度和/或序列的寡核苷酸。寡核苷酸可包括任何種類的核酸(例如RNA、DNA、PNA、線性的、環(huán)狀的或病毒的)，并且可能包含用于擴(kuò)增的特異序列(用于PCR的引物序列)或用于檢測(cè)的標(biāo)記(例如熒光基團(tuán)或淬滅劑、或同位素標(biāo)記物)。這些標(biāo)記的檢測(cè)可以是直接的，例如通過(guò)對(duì)oligos進(jìn)行測(cè)序或使其與互補(bǔ)序列雜交(例如在陣列或芯片上)，或是間接的，例如通過(guò)監(jiān)測(cè)編碼寡核苷酸的基因產(chǎn)物、或核苷酸對(duì)細(xì)胞活性的干擾(例如特定基因的反義抑制)。擴(kuò)增核酸的有利方法是滾動(dòng)循環(huán)擴(kuò)增(RCA ；2002,V.Demidov, Expert Rev.Mo 1.Diagn.2 (6), p.89-95)，其中核酸標(biāo)記物可包括RCA模板、延伸引物、或幫助環(huán)化小環(huán)模板的支持物)。
可使用任何分子或大分子的標(biāo)記物，只要其能被檢測(cè)，包括肽標(biāo)記物、顏色或熒光化合物、仲胺、鹵化碳、穩(wěn)定同位素的混合物等。標(biāo)記物可以直接或借助于中間物而附著于細(xì)胞單元，例如針對(duì)細(xì)胞單元成分產(chǎn)生的抗體，或借助于相互作用的對(duì)，例如生物素-鏈霉抗生物素。此外可以通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)的成分，例如化學(xué)品或其他修飾或通過(guò)包封而防止標(biāo)記物降解?？稍谠S多不同的培養(yǎng)基，例如在珠子中進(jìn)行標(biāo)記物的包封，許多類型的珠子可從例如Bangs Laboratories Inc.(Fishers IN, USA)的供應(yīng)商獲得,并且除提供用于標(biāo)記物擴(kuò)增和/或檢測(cè)(例如提供為DNA標(biāo)記所用的PCR引物)的成分之外，包封可用于標(biāo)準(zhǔn)化標(biāo)記物的劑量。標(biāo)記細(xì)胞單元的優(yōu)選方法是使用突光珠子，例如由LuminexCorporation (Austin, TX, USA)制造的珠子。Luminex系統(tǒng)包括聚苯乙烯珠子,其可以或未必是外部衍生化的(例如用抗生物素蛋白或抗體)，其內(nèi)部用不同比率的2種光譜的不同熒光基團(tuán)染色，以及能夠表征每個(gè)珠子的光譜特征的閱讀儀。進(jìn)一步優(yōu)選的方法是使用例如由Bangs Laboratories Inc.(Fishers IN,USA)制造的珠子。Bangs系統(tǒng)包括能夠根據(jù)不同大小而鑒別的珠子種類(例如4.4μ M和5.5 μ M直徑的珠子種類)。而且每套內(nèi)的珠子相互之間根據(jù)由于差異負(fù)載有單個(gè)的熒光染料產(chǎn)生不同的熒光強(qiáng)度而可以是不同的。有可能使用許多具有不同吸收作用或發(fā)射特性的不同染料，其可以是通過(guò)許多方式內(nèi)部加載或外部附著于載體的。而且可使用，量子點(diǎn)^以獲得可方便讀取的極高數(shù)量的不同熒光。細(xì)胞生長(zhǎng)基質(zhì)，例如所述的與形成細(xì)胞單元有關(guān)的基質(zhì)可以是衍生化的或涂有便于標(biāo)記并且不防礙細(xì)胞生長(zhǎng)的物質(zhì)。衍生化載體的優(yōu)選方法是用生物素共價(jià)或非共價(jià)地加以修飾，使標(biāo)記物能夠借助于鏈霉抗生物素或抗生物素蛋白進(jìn)行附著。通常使用本身不會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞效應(yīng)(即惰性標(biāo)記物)，而且能夠不同于存在于細(xì)胞單元或培養(yǎng)基中的分子，能夠附著于其靶物并且隨后在這種分子的背景中被檢測(cè)到的標(biāo)記物是很重要的。為了便于檢測(cè)，從細(xì)胞單元有選擇地洗脫標(biāo)記物或利用選擇性的條件從細(xì)胞單元脫落細(xì)胞可能是有利的。也可預(yù)計(jì)更復(fù)雜的分子標(biāo)記策略，包括^雙體編碼，的策略，其中通過(guò)指定到一組分子標(biāo)記物及其混合物的一組雙體密碼子來(lái)記錄信息。標(biāo)記物的檢測(cè)可伴隨有本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種方法。這些方法包括質(zhì)譜、核磁共振、測(cè)序、雜交、抗原檢測(cè)、電泳、分光術(shù)、顯微術(shù)、圖像分析、熒光檢測(cè)等。特別感興趣的是其中只進(jìn)行一次標(biāo)記或標(biāo)記和/或檢測(cè)是非身體性的而因此是非侵入性的標(biāo)記或編碼策略。射頻鑒定(RFID)是顯示這些特性的系統(tǒng)的實(shí)例。RFID使用轉(zhuǎn)發(fā)器(RF標(biāo)記物)、天 線和讀取儀。RF標(biāo)記是小的電子線路，通常包裹在玻璃或塑料中，其中以最簡(jiǎn)單的形式通過(guò)合適的電子設(shè)備提供可以，讀取，的獨(dú)特代碼的入口，而不需接觸或視線。標(biāo)記也可儲(chǔ)存由使用者產(chǎn)生的信息，也不需要接觸或觀測(cè)線。'讀取儀'是往返于一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記物轉(zhuǎn)移信息的電子單元(應(yīng)該注意到術(shù)語(yǔ)讀取儀可互換地用于指只讀和讀/寫單元)。讀取儀的大小和構(gòu)造可以進(jìn)行相當(dāng)大的變化，并且可以分離或連接遠(yuǎn)程計(jì)算機(jī)系統(tǒng)的方式進(jìn)行操作。使用天線來(lái)將信息從讀取儀傳送到標(biāo)記物，并且接收由RF標(biāo)記物發(fā)送的信息。天線的大小和規(guī)格形式將反映特定的應(yīng)用，可以從小的圓形線圈變化到大的平面構(gòu)造。RFID系統(tǒng)可以分離或連接遠(yuǎn)程計(jì)算機(jī)的方式進(jìn)行操作，來(lái)用于對(duì)來(lái)源于標(biāo)記物的同一性和相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行更廣泛的譯碼和操作。用于組合化學(xué)的一個(gè)RFID策略在 Nicolaou 等人(1995, Angew Chem Intl Ed Engl, vol.34p.2289)中有描述，并且包括:
(i)包含合成基質(zhì)和半導(dǎo)體標(biāo)記物的多孔包裹體；(ii)固相合成樹脂；(iii)玻璃-包裹的單個(gè)或多個(gè)可訪問(wèn)的射頻標(biāo)記半導(dǎo)體單元，其能夠接收，儲(chǔ)存和發(fā)射射頻信號(hào)。僅僅通過(guò)用組織培養(yǎng)微載體或合適的細(xì)胞單元替代固相合成樹脂的類似裝置可適合于生長(zhǎng)和追蹤細(xì)胞單元?？深A(yù)計(jì)這個(gè)策略的更多變化，包括但不限于其上直接生長(zhǎng)細(xì)胞的(涂覆或未涂覆的)RF標(biāo)記物、或植入到細(xì)胞單元或生物體中的射頻標(biāo)記物。這種標(biāo)記物最初未必通過(guò)其化學(xué)或分子結(jié)構(gòu)而加以鑒別。可設(shè)計(jì)非化學(xué)標(biāo)記策略的多重變化以確定混合物中給定細(xì)胞單元的同一性或推導(dǎo)包括混合物的不同細(xì)胞單元的身份。例如已經(jīng)描述了標(biāo)記的光學(xué)或目測(cè)法，其中以不同形狀的物體、編碼圖形的物體或不同的顏色表示樣品的身份(例如參見1998, Guiles等人，Angew.Chem.1ntl Ed Engl,vol.37, p926 ；Luminex Corp, Austin TX, USA ；BD Biosciences ；Memobead Technologies,Ghent, Belgium)，或其中將圖案或條碼蝕刻到例如陶瓷棒的基質(zhì)上并且利用圖形識(shí)別技術(shù)進(jìn)行識(shí)別(例如參見 1997,Xiao 等人,Angew.Chem.1ntl Ed Engl, vol 36,p780 ；SmartBeadTechnologies, Babraham,英國(guó))。追蹤或標(biāo)記細(xì)胞單元的進(jìn)一步方法是空間地，即通過(guò)其空間位置編碼它們的身份。在這個(gè)方法中，在限定的相對(duì)位置分離不同的細(xì)胞單元，這些位置表示或編碼單元的身份。例如，可以在陣列中培養(yǎng)細(xì)胞單元，借此了解每個(gè)單元的身份和/或培養(yǎng)歷史并且使其與陣列中特定的位置相關(guān)。通過(guò)其最簡(jiǎn)單的形式，這種陣列能夠包括組織培養(yǎng)瓶、多孔平板的孔或載玻片或其他表面上定位的采集?？稍贕eysen等人(1984,Proc Natl Acad SciUSA vol.81，ρ.3998-4002)、Fodor 等人(1991，Science vol.251，p.767-773)、Ziauddin和 Sabatini (2001，Nature，Vol.411，ρ.107-110)、以及 Wu 等人(2002, Trends Cell Biol.Vol.12(10，p.485-8)中發(fā)現(xiàn)定位編碼策略的實(shí)例。本發(fā)明具有具有許多方面，每個(gè)可能具有許多形式，可以將其合并形成本發(fā)明的許多改變。顯而易見的是，為了能夠推導(dǎo)關(guān)于來(lái)自細(xì)胞培養(yǎng)方法組合的輸出結(jié)果的信息而標(biāo)記所有細(xì)胞單元不是必需的。因此不標(biāo)記細(xì)胞單元仍然可以根據(jù)本發(fā)明分析細(xì)胞培養(yǎng)條件的大量組合，并且確定這些組合的一種或多種是否能夠產(chǎn)生特定的細(xì)胞效應(yīng)。然而優(yōu)選細(xì)胞單元是標(biāo)記的。細(xì)胞單元的標(biāo)記容許與所有的細(xì)胞單元對(duì)照，從考慮到通過(guò)標(biāo)記細(xì)胞單元而取樣的特定條件結(jié)果的實(shí)驗(yàn)推導(dǎo)有用的信息。備選地，有時(shí)標(biāo)記全部暴露于某一培養(yǎng)方法的一個(gè)或幾個(gè)細(xì)胞單元群體是有利的，例如在特定的分開或匯合步驟期間，已經(jīng)分離到相同培養(yǎng)基中的細(xì)胞單元群。明顯的是，標(biāo)記某些細(xì)胞單元容許推斷其他細(xì)胞單元(或許是未標(biāo)記的)的身份。類似地，顯然進(jìn)行省略了多種條件的細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)可以產(chǎn)生關(guān)于相對(duì)于特定實(shí)驗(yàn)性結(jié)果的那些條件的應(yīng)用的信息。因此在某種意義上可能根據(jù)本發(fā)明通過(guò)許多次地重復(fù)實(shí)驗(yàn)，每次省略不同類的條件來(lái)評(píng)估每個(gè)取樣的條件。也可使用分開-分開的細(xì)胞培養(yǎng)步驟來(lái)確定特定種類的條件對(duì)實(shí)驗(yàn)性結(jié)果的效應(yīng)。有效的分開-分開步驟導(dǎo)致已經(jīng)在分支的時(shí)候各自暴露于獨(dú)特細(xì)胞培養(yǎng)條件的細(xì)胞單元形成特定的譜系。通過(guò) 研究不同的譜系，有可能相對(duì)于特定的實(shí)驗(yàn)性結(jié)果確定在分支點(diǎn)研究的組織培養(yǎng)條件的用途(圖6)。在下文的實(shí)施例中進(jìn)一步描述本發(fā)明。實(shí)施例實(shí)施例1-利用分開-匯合的細(xì)胞培養(yǎng)分化ES細(xì)胞單元為了分析可能產(chǎn)生多巴胺能表型的神經(jīng)元的組織培養(yǎng)條件，利用未分化小鼠ES細(xì)胞的起始培養(yǎng)物進(jìn)行分開-匯合的培養(yǎng)試驗(yàn)。在存在1，400U πιΓ1的白血病抑制因子(LIF ;Chemicon)時(shí)，在由補(bǔ)充有15% FCS、IOOmM MEM非必需氨基酸、0.55mM 2-巰基乙醇、L-谷氨酰胺、和抗生素(所有的都來(lái)自GIBC0/BRL)的敲除(knockout) Dulbecco' s 基本培養(yǎng)基(DMEM ；GIBC0/BRL)組成的 ES 細(xì)胞培養(yǎng)基中，在涂有白明膠的組織培養(yǎng)平板上生長(zhǎng)未分化的ES細(xì)胞。為了誘導(dǎo)胚狀體(EB)形成，通過(guò)含有0.05%的胰蛋白酶和0.04%的EDTA的PBS將細(xì)胞分離成為單細(xì)胞懸液，并且在如上所述的培養(yǎng)基中以2-2.5 X IO4個(gè)細(xì)胞cm_2的密度接種到非粘附的細(xì)菌培養(yǎng)皿上。形成EBs 4天，然后在ES細(xì)胞培養(yǎng)基中接種到粘附性的組織培養(yǎng)表面上。培養(yǎng)24h后，伴隨通過(guò)無(wú)血清的胰島素/轉(zhuǎn)鐵蛋白/硒/纖連蛋白(ITSFn)培養(yǎng)基替代ES細(xì)胞培養(yǎng)基并且培養(yǎng)10天來(lái)選擇nestin-陽(yáng)性細(xì)胞。使用這些nestin-陽(yáng)性細(xì)胞作為分開-匯合培養(yǎng)試驗(yàn)的起始材料。具體地,通過(guò)
0.05 %胰蛋白酶/0.04 % EDTA離解細(xì)胞，并且以大約1.5_2 X IO5個(gè)細(xì)胞/cm_2接種在>10，000個(gè)玻璃生物球上(Whatman，英國(guó))。此后所使用的組織培養(yǎng)皿由非粘附材料制成。用聚鳥氨酸(ISmgmr1)和層粘連蛋白(lug πιΓ1,兩者都來(lái)自Becton Dickinson Labware,Bedford, MA)預(yù)涂層無(wú)菌的玻璃珠。將珠子隨機(jī)地分為4組，每組在4種組織培養(yǎng)基(表示為A1、A2、A3或A4)中的一種中培養(yǎng)，下列表I中給出了這些培養(yǎng)基的組成。這些培養(yǎng)基是根據(jù)Johe等人(1996，Genes Dev, vol 10，p 3129-3140)基于N2培養(yǎng)基而改進(jìn)的，并且此后被簡(jiǎn)稱為N2培養(yǎng)基。表I
權(quán)利要求
1.體外從干細(xì)胞或雙潛能、多潛能或全能祖細(xì)胞獲得分化的細(xì)胞的方法，包括下列步驟: (a)使附著于微載體或珠子、限制在培養(yǎng)基可滲透屏障物的范圍內(nèi)或截留的干細(xì)胞或祖細(xì)胞在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)； (b)將步驟(a)中的細(xì)胞從一種培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到另一種培養(yǎng)基； (C)重復(fù)步驟(b);以及 (d)獲得分化的細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中通過(guò)酶促的脫附作用從微載體或珠子分離分化的細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中通過(guò)消化微載體來(lái)分離分化的細(xì)胞。
4.體外誘導(dǎo)細(xì)胞中的細(xì)胞過(guò)程的方 法，包括下列步驟: Ca)培養(yǎng)附著于微載體、珠子、限制在培養(yǎng)基可滲透屏障物的范圍內(nèi)或截留的細(xì)胞； (b)將所述細(xì)胞暴露于三種或更多種不同的細(xì)胞培養(yǎng)條件，所述細(xì)胞培養(yǎng)條件包括培養(yǎng)基的變化；和 (c)誘導(dǎo)所述細(xì)胞過(guò)程。
5.用于培養(yǎng)干細(xì)胞和來(lái)源于干細(xì)胞的分化的細(xì)胞的方法，包括使所述附著于微載體或珠子或限制在培養(yǎng)基可滲透屏障物的范圍內(nèi)或截留的細(xì)胞生長(zhǎng)，其中所述細(xì)胞經(jīng)受至少兩種培養(yǎng)條件的變化，所述培養(yǎng)條件的變化包括培養(yǎng)基的變化。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中產(chǎn)生細(xì)胞的匯合物并反復(fù)重分。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6的方法，其中所述方法包括: Ca)組合在不同條件下生長(zhǎng)的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)物；以及 (b)在普通的條件下培養(yǎng)所述細(xì)胞。
8.根據(jù)權(quán)利要求5至7中任一項(xiàng)的方法，其中所述方法包括: Ca)培養(yǎng)所述細(xì)胞培養(yǎng)物； (b)將所述培養(yǎng)物分為兩個(gè)或更多個(gè)細(xì)胞群；以及 (C)在兩種或更多種不同種類的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)所述的細(xì)胞群。
9.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所述微載體包括塑料、大分子如纖維素、葡聚糖、瓊脂糖或丙烯酰胺、或無(wú)機(jī)材料如玻璃。
10.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所述細(xì)胞截留在纖維素纖維如DEAE、TLC、QAE、TEAE或陶瓷柱體中。
11.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的方法，其中所述細(xì)胞是多潛能細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及細(xì)胞培養(yǎng)。具體地，涉及一種用于確定多種培養(yǎng)條件對(duì)細(xì)胞的影響的方法，包括下列步驟a)提供第一組各自包括一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞單元群，并且將所述的群體暴露于所需要的培養(yǎng)條件；(b)匯聚兩個(gè)或多個(gè)所述的群體以形成至少一個(gè)第二組；(c)再重分該第二組以產(chǎn)生進(jìn)一步的細(xì)胞單元群；(d)將所述的進(jìn)一步的群體暴露于所需要的培養(yǎng)條件；(e)任選地，根據(jù)需要反復(fù)地重復(fù)步驟(b)-(d)；以及(f)任選地評(píng)估已經(jīng)接觸細(xì)胞的培養(yǎng)條件對(duì)所述的給定細(xì)胞單元的影響。
文檔編號(hào)C12N5/0735GK103205393SQ20121029080
公開日2013年7月17日 申請(qǐng)日期2003年10月3日 優(yōu)先權(quán)日2002年10月3日
發(fā)明者蔡延 申請(qǐng)人:可塑細(xì)胞有限公司