專利名稱：細(xì)菌素誘導(dǎo)者肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在誘導(dǎo)者細(xì)菌存在下刺激由生產(chǎn)者細(xì)菌產(chǎn)生細(xì)菌素的新型的肽以及使用所述肽用于細(xì)菌素產(chǎn)生的方法。
背景技術(shù)：
正常的腸道細(xì)菌對(duì)于任何宿主動(dòng)物的健康都是重要的。宿主通過(guò)由天然細(xì)菌生物相介導(dǎo)的消化代謝過(guò)程而受益。從腸道細(xì)菌來(lái)看，競(jìng)爭(zhēng)和隨之發(fā)生的進(jìn)化提供營(yíng)養(yǎng)素和生存空間并增加繁殖潛能，使得某些菌株和菌種獲得生存優(yōu)勢(shì)。在細(xì)菌進(jìn)化期間，細(xì)菌素的產(chǎn)生已經(jīng)發(fā)生。在給定的競(jìng)爭(zhēng)利基(competitive niche)中，細(xì)菌素對(duì)于其他生物體是拮抗的并因此提供生態(tài)優(yōu)勢(shì)。這些生物素一般是低分子量的多肽，并被基于分子量的差異分類 (Klaenhammer, FEMS Microbiol. Rev. , 1993年 12-39-85卷)。這些化合物可以容易地被宿主蛋白酶消化成其組成氨基酸。細(xì)菌素可能代表得自競(jìng)爭(zhēng)性排斥的益處中的重要部分(Nurmi 和 Rantala, Nature (自然)，倫敦，1973 年，第 241 卷，210-211)。
Nurmi和Rantala (1973,同上)最早描述了通過(guò)使用得自健康的成年禽糞便的未確定的細(xì)菌菌群控制沙門(mén)氏菌在新孵化的雛雞中的定殖中的競(jìng)爭(zhēng)性排斥的優(yōu)點(diǎn)。該途徑對(duì)于目前涉及合成抗生素的耕作方法而言是有吸引力的備選方案。得自粘膜的競(jìng)爭(zhēng)性排斥菌群被描述為得自健康的成年母雞的腸粘膜內(nèi)膜刮屑的厭氧培養(yǎng)物(Stern等，美國(guó)專利5，451，400，公布于1995年9月)。此未確定的菌群在雞中提供良好的對(duì)于沙門(mén)氏菌的定殖防護(hù)，但是僅提供不穩(wěn)定的彎曲桿菌(Campylobacter)的定殖控制(Stern, Poult. Sci, 1994年，第73卷，402-407)。競(jìng)爭(zhēng)性排斥出現(xiàn)在野生禽類腸道中并有助于健康的腸道生態(tài)。
微生物產(chǎn)生各種顯示抗菌性質(zhì)的化合物。一類這樣化合物，細(xì)菌素，由具有類似于離子載體抗生素的作用機(jī)制的殺菌蛋白質(zhì)組成。細(xì)菌素常具有抵抗與該細(xì)菌素的生產(chǎn)者密切相關(guān)的菌種的活性。它們?cè)趶膹?fù)雜的微生物群落(例如腸道、口腔或其他的上皮表面)分離出來(lái)的細(xì)菌菌種中的廣泛存在，表明細(xì)菌素在細(xì)菌生態(tài)系統(tǒng)中的種群動(dòng)態(tài)方面可能具有調(diào)節(jié)作用。細(xì)菌素被定義為由細(xì)菌產(chǎn)生的具有生物活性的蛋白部分以及殺菌作用的化合物 (Tagg 等,細(xì)菌學(xué)評(píng)論(Bacteriological Reviews), 1976 年,第 40 卷,722-256)。其他的特征可以包括(1)窄譜抑制活性，集中于密切相關(guān)的菌種；(2)與特定細(xì)胞受體附著；(3) 質(zhì)粒攜帶的細(xì)菌素產(chǎn)生和具有宿主細(xì)胞細(xì)菌素免疫性的遺傳定子。未完全確定的拮抗物質(zhì)被稱為“細(xì)菌素樣物質(zhì)”。一些有效抵抗革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，相反不抵抗革蘭氏陰性細(xì)菌的細(xì)菌素，具有較廣譜的活性。已有建議術(shù)語(yǔ)細(xì)菌素，當(dāng)被用于描述由革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌產(chǎn)生的抑制劑時(shí)，應(yīng)該符合(I)是一種肽，(2)具有殺菌活性(Tagg等人，同上)的最低標(biāo)準(zhǔn)。3
為了經(jīng)濟(jì)上可行地在商業(yè)上利用細(xì)菌素，在產(chǎn)生期間將產(chǎn)量最優(yōu)化是必要的 (Chen 和 Hoover,食品科學(xué)和食品安全綜述(Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety), 2003年,第2卷,82-100)。Chen和Hoover宣稱發(fā)現(xiàn)在生長(zhǎng)介質(zhì)中，針對(duì)尼生素(nisin)生產(chǎn)的關(guān)鍵因素是維持最優(yōu)化的pH以及針對(duì)每種產(chǎn)生細(xì)菌素的菌株或多種菌株補(bǔ)充具有特定的營(yíng)養(yǎng)物的介質(zhì)。
Knutsen 等人(細(xì)菌學(xué)雜志(Journal of Bacteriology), 2004 年，第 186 卷 (10)，3078-3085)公開(kāi)了一種27個(gè)氨基酸的細(xì)菌素誘導(dǎo)肽(BIP)，其誘導(dǎo)肺炎鏈球菌 (Streptococcus Pneumoniae)中細(xì)菌素的產(chǎn)生。Diep等人(分子生物學(xué)(Molecular Biology)2003年第47(2)卷，483-494)公開(kāi)了許多革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，所述細(xì)菌已被報(bào)道為應(yīng)用所謂的基于肽信息素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來(lái)調(diào)節(jié)來(lái)自為數(shù)眾多的乳酸菌的，稱為細(xì)菌素的抗微生物肽的產(chǎn)生。其還公開(kāi)了誘導(dǎo)細(xì)菌素產(chǎn)生的肽信息素，PInA。Van Belkum和Stiles (Nat. Prod. Rep.，2000年，第17卷，323-335)公開(kāi)了一些細(xì)菌素需要調(diào)節(jié)基因的產(chǎn)物來(lái)產(chǎn)生它們。他們宣稱這些基因編碼一種分泌的誘導(dǎo)肽以及與組氨酸激酶和響應(yīng)調(diào)節(jié)因子同源的蛋白質(zhì)。該參考文獻(xiàn)進(jìn)一步公開(kāi)了一些由誘導(dǎo)肽誘導(dǎo)的II類細(xì)菌素，而其他的例如肉食桿菌素B2 (Carnobacteriocin B2)和乳桿菌素P (Sakacin P)是由誘導(dǎo)肽誘導(dǎo)或者由所合成細(xì)菌素自誘導(dǎo)的。
盡管已經(jīng)發(fā)現(xiàn)各種在細(xì)菌中誘導(dǎo)細(xì)菌素產(chǎn)生的肽，本領(lǐng)域中仍存在對(duì)于采用在體外增加細(xì)菌素產(chǎn)生的量的肽的細(xì)菌素商業(yè)化生產(chǎn)的需要。本發(fā)明提供與現(xiàn)有技術(shù)中的肽不同的肽并提供大量生產(chǎn)用于商業(yè)化用途的細(xì)菌素的方法。發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供在體外刺激細(xì)菌素產(chǎn)生的肽。
本發(fā)明的又一目的是提供在體外刺激體外細(xì)菌素產(chǎn)生，并且具有VKGLT (SEQ ID NOl)的竣基端序列的妝。本發(fā)明提供一種具有SEQ ID NO I的竣基端氣基酸序列的妝。
本發(fā)明的另一目的是提供具有MVTKSLVLAWVVALLACGMVKGLT (SEQ ID NO 3)的氨基酸序列的肽。
本發(fā)明另一個(gè)目的是提供具有TNVTKSWWVLAGCNQVVASNCNCGNVKGLT (SEQ ID NO 5)的氨基酸序列的肽。
本發(fā)明再一個(gè)目的是提供具有WNKYKTNWVLSVCNTGCACAAVKGLT (SEQ ID N07)的氨基酸序列的妝。
本發(fā)明的另一目的是提供體外增加細(xì)菌素產(chǎn)生的方法，其中具有VKGLT (SEQ ID NOl)的羧基端序列的肽被加至產(chǎn)細(xì)菌素細(xì)胞的培養(yǎng)物中。
本發(fā)明提供一種用于增加細(xì)菌素產(chǎn)生的方法，包括
a.向培養(yǎng)物體系添加產(chǎn)細(xì)菌素細(xì)菌和誘導(dǎo)者細(xì)菌，
b.添加具有SEQ ID NO I的羧基端氨基酸序列的肽，以及
c.培養(yǎng)所述細(xì)菌和所述肽一段時(shí)間以實(shí)現(xiàn)增加的所述細(xì)菌素的產(chǎn)生。
本發(fā)明提供一種用于刺激具有SEQ ID NO 2的細(xì)菌素的產(chǎn)生的方法，包括
a.向培養(yǎng)物體系添加產(chǎn)細(xì)菌素細(xì)胞系NRRL-B-30514和誘導(dǎo)者細(xì)胞系NRRL 30884，
b.添加具有SEQ ID NO 3的肽，以及
c.培養(yǎng)所述細(xì)菌和所述肽一段時(shí)間以實(shí)現(xiàn)增加的所述細(xì)菌素的產(chǎn)生。
本發(fā)明提供一種用于刺激具有SEQ ID NO 4的細(xì)菌素的產(chǎn)生的方法，包括
a.向培養(yǎng)物體系添加產(chǎn)細(xì)菌素細(xì)胞系NRRL B-30746和誘導(dǎo)者細(xì)胞系NRRL B-30510,
b.向所述體系添加具有SEQ ID NO 5的肽，以及
c.培養(yǎng)所述細(xì)菌和肽一段時(shí)間以實(shí)現(xiàn)增加的所述細(xì)菌素的產(chǎn)生。
本發(fā)明提供一種用于刺激具有SEQ ID NO 6的細(xì)菌素的產(chǎn)生的方法，包括
d.向培養(yǎng)物體系添加產(chǎn)細(xì)菌素細(xì)胞系NRRL B-30745和誘導(dǎo)者細(xì)胞系NRRL B-30510,
e.添加具有SEQ ID NO 7的肽，以及
f.培養(yǎng)所述細(xì)菌和所述肽一段時(shí)間以實(shí)現(xiàn)增加的所述細(xì)菌素的產(chǎn)生。
本發(fā)明提供一種用于刺激具有SEQ ID NO 2的細(xì)菌素的產(chǎn)生的方法，包括
a.向培養(yǎng)物體系添加產(chǎn)細(xì)菌素細(xì)胞系NRRL-B-30514和誘導(dǎo)者細(xì)胞系NRRL 30884，
b.添加具有SEQ ID NO I的羧基端氨基酸序列的肽，以及
c.培養(yǎng)所述細(xì)菌和所述肽一段時(shí)間以實(shí)現(xiàn)增加的所述細(xì)菌素的產(chǎn)生。
本發(fā)明提供一種用于刺激具有SEQ ID NO 4的細(xì)菌素的產(chǎn)生的方法，包括
g.向培養(yǎng)物體系添加產(chǎn)細(xì)菌素細(xì)胞系NRRL B-30746和誘導(dǎo)者細(xì)胞系NRRL B-30510,
h.向所述體系添加具有SEQ ID NO I的羧基端氨基酸序列的肽，以及
i.培養(yǎng)所述細(xì)菌和所述肽一段時(shí)間以實(shí)現(xiàn)增加的所述細(xì)菌素的產(chǎn)生。
本發(fā)明提供一種用于刺激具有SEQ ID NO 6的細(xì)菌素的產(chǎn)生的方法，包括
j.向培養(yǎng)物體系添加產(chǎn)細(xì)菌素細(xì)胞系NRRL B-30745和誘導(dǎo)者細(xì)胞系NRRL B-30510,
k.添加具有SEQ ID NO I的羧基端氨基酸序列的肽，以及
I.培養(yǎng)所述細(xì)菌和所述肽一段時(shí)間以實(shí)現(xiàn)增加的所述細(xì)菌素的產(chǎn)生。
本發(fā)明又一個(gè)目的是提供用于體外增加細(xì)菌素0R-7的產(chǎn)生的方法，其中具有SEQ ID NO 3 的肽被加至唾液乳桿菌(Lactobacillus salivarius) PVD-32 (NRRL B-30514)細(xì)胞的培養(yǎng)物中。
本發(fā)明的另一目的是提供用于體外增加細(xì)菌素50-52的產(chǎn)生的方法，其中具有 SEQ ID NO 5 的肽被加至屎腸球菌(Enterococcus faecium) LffP 50-52 細(xì)胞(NRRL B-30746)的培養(yǎng)物中。
本發(fā)明再一個(gè)目的是提供用于體外增加細(xì)菌素760的產(chǎn)生的方法，其中具有SEQ ID NO 7 的肽被加至倉(cāng)鼠鏈球菌(Streptococcus cricetus)LWP 760 細(xì)胞(NRRL B-30745) 的培養(yǎng)物中。
本發(fā)明的另一目的是提供通過(guò)進(jìn)一步包括誘導(dǎo)者細(xì)胞系而增加由生產(chǎn)者細(xì)胞系產(chǎn)生細(xì)菌素的方法。
本發(fā)明再一個(gè)目的是提供通過(guò)進(jìn)一步包括誘導(dǎo)者細(xì)胞系卷曲乳桿菌(Lactobacillus crispatus)LWP 252 (NRRL B-30884)而增加由生產(chǎn)者細(xì)胞系唾液乳桿菌 (Lactobacillus salivarius) PVD-32 產(chǎn)生細(xì)菌素 0R-7 的方法。
本發(fā)明再一個(gè)目的是提供通過(guò)進(jìn)一步包括誘導(dǎo)者細(xì)胞系嗜酸乳酸桿菌 (Lactobacillus acidophilus)LffP 320 (NRRL B-30510)而增加經(jīng)生產(chǎn)者細(xì)胞系屎腸球菌 (Enterococcus faecium) LffP 50-52 產(chǎn)生細(xì)菌素 50-52 的方法。
本發(fā)明再一個(gè)目的是提供通過(guò)進(jìn)一步包括誘導(dǎo)者細(xì)胞系嗜酸乳酸桿菌(Lactobacillus acidophilus) LffP 320而增加經(jīng)生產(chǎn)者細(xì)胞系倉(cāng)鼠鏈球菌 (Streptococcus cricetus) LWP-760 產(chǎn)生細(xì)菌素 760 的方法。
本發(fā)明其他的目的和優(yōu)勢(shì)從下述說(shuō)明中將會(huì)變得明顯。
微生物的保藏
唾液乳桿菌(Lactobacillussalivarius),標(biāo)明為NRRL B_30514(菌株P(guān)VD32),于 2001年8月3日保藏;倉(cāng)鼠鏈球菌(Streptococcus cricetus),標(biāo)明為NRRL B_30745(菌株 LffP 760)，以及屎腸球菌(Enterococcus faecium)標(biāo)明為 NRRL B-30746 (菌株 LWP-50-52) 于2004年5月3日保藏；而乳酸菌(Lactobacillus sp·)，標(biāo)明為NRRL B-30510 (菌株 LffP 320)于 2001 年 8 月 3 日保藏。卷曲乳桿菌(Lactobacillus crispatus),標(biāo)明為 NRRL B-30884(菌株LWP 252)于2005年11月4日保藏。所有上述菌株已按照布達(dá)佩斯條約的規(guī)定保藏于美國(guó)農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)研究培養(yǎng)物保藏中心(國(guó)家農(nóng)業(yè)應(yīng)用研究中心(National Center for Agricultural Utilization Research), 1815N. University Street, Peoria, Illinois 61604)。


圖IA和IB是顯示SDS-PAGE (A)和等電聚焦(B)后對(duì)信號(hào)肽和細(xì)菌素0R-7直接檢測(cè)的照片。凝膠用空腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni)覆蓋以確定哪個(gè)或哪幾個(gè)條帶與抗微生物活性對(duì)應(yīng)，并確定分子量和等電點(diǎn)。在圖IA中第I道——2，100-12, 500范圍的 LMW 分子量標(biāo)記(Amersham Pharmacia Biotech)2, 100 ；5, 780 ；8, 400 ； 12, 500Da。包含純的細(xì)菌素0R-7的第2道的條帶對(duì)應(yīng)抗菌活性，生長(zhǎng)抑制的區(qū)域具有約5. 5kDa的質(zhì)量。 包含純的來(lái)自PVD-32的信號(hào)肽的第3道的條帶具有約2. 5kDa的質(zhì)量。在圖IB中，包含純的細(xì)菌素0R-7的第I道對(duì)應(yīng)抗菌活性；生長(zhǎng)抑制的區(qū)域具有約8. 4的pi。包含純的來(lái)自 PVD-32的信號(hào)肽的第2道的條帶具有約7. 9的pi。第3道包含pi標(biāo)準(zhǔn)物(蛋白質(zhì)測(cè)試混合物，I 標(biāo)記蛋白，Serva) 10. 0,9. 2,8. 1,6. 9,5. 5,4. 3。
圖2A和2B是顯示SDS-PAGE (A)和等電聚焦(B)后對(duì)信號(hào)肽和細(xì)菌素50-52直接檢測(cè)的照片。凝膠用空腸彎曲桿菌覆蓋以確定哪個(gè)或哪幾個(gè)條帶對(duì)應(yīng)抗菌活性，并確定分子量和等電點(diǎn)。在圖IA中第I道——約2，100-12, 500范圍的LMW分子量標(biāo)記(Amersham Pharmacia Biotech)2, 100 ；5, 780 ；8, 400 ；12, 500Da。包含純的細(xì)菌素 50-52 的第 2 道的條帶對(duì)應(yīng)抗菌活性，生長(zhǎng)抑制的區(qū)域具有約3. 9kDa的質(zhì)量。包含純的針對(duì)LWP-50-52的信號(hào)肽的第3道的條帶具有約3. IkDa的質(zhì)量。在圖2B中，包含純的細(xì)菌素50-52的第I道對(duì)應(yīng)抗菌活性；生長(zhǎng)抑制的區(qū)域具有約8. 4的pi。包含純的來(lái)自LWP-50-52的信號(hào)肽的第2 道的條帶具有約8. I的pi。第3道包含pi標(biāo)準(zhǔn)物(蛋白質(zhì)測(cè)試混合物，I標(biāo)記蛋白，Serva): 10. 0,8. 1,7. 9,6. 4,5. 5,4. 3,4. I 以及 3. 8。
圖3A和3B是顯示SDS-PAGE (A)和等電聚焦(B)后對(duì)信號(hào)肽和細(xì)菌素760直接檢測(cè)的照片。凝膠用空腸彎曲桿菌覆蓋以確定哪個(gè)或哪幾個(gè)條帶對(duì)應(yīng)抗菌活性，并確定分子量和等電點(diǎn)。在圖3A中，第3道顯示約2，100-12，500范圍的LMW分子量標(biāo)記(Amersham Pharmacia Biotech)2, 100 ；5, 780 ；8, 400 ；12, 500Da。包含純的細(xì)菌素 760 的第 I 道的條帶對(duì)應(yīng)抗菌活性，生長(zhǎng)抑制的區(qū)域具有約5. 5kDa的質(zhì)量。包含純的來(lái)自LWP 760的信號(hào)肽的第3道的條帶具有約2. IkDa的質(zhì)量。在圖3B中，包含純的細(xì)菌素760的第I道的條帶對(duì)應(yīng)抗菌活性；生長(zhǎng)抑制的區(qū)域具有約9. 5的pi。包含純的來(lái)自LWP-760的信號(hào)肽的第2道的條帶具有約8. 9的pi。第3道包含pi標(biāo)準(zhǔn)物(蛋白質(zhì)測(cè)試混合物，I標(biāo)記蛋白，Serva) 10. 0,8. 1,7. 9,6. 4,5. 5,4. 3,4. I 以及 3. 8。
具體實(shí)施方式
腸感染在人中的重要性已經(jīng)被日益充分地認(rèn)識(shí)到，家禽污染和人感染之間的關(guān)系也有詳盡記載。通過(guò)干預(yù)家禽加工廠消除這種健康危險(xiǎn)的能力也是眾所周知的。在肉仔雞產(chǎn)生和加工過(guò)程中，含有病原體的糞便物轉(zhuǎn)移到肉上，并繼續(xù)存在于加工食品的廚房中。
競(jìng)爭(zhēng)性生物的代謝物可能有助于控制病原體例如空腸彎曲桿菌和沙門(mén)氏菌。唾液乳桿菌(Lactobacillus salivarius),標(biāo)明為 NRRL B-30514 (菌株 PVD32),倉(cāng)鼠鏈球菌(Streptococcus cricetus),標(biāo)明為 NRRL B-30745 (菌株 LWP 760),以及屎腸球菌 (Enterococcus faecium),標(biāo)明為 NRRL B-30746 (菌株 LWP-50-52)產(chǎn)生新細(xì)菌素,所述新細(xì)菌素是2003年8月21日遞交的待決美國(guó)專利申請(qǐng)10/644,927以及2003年5月I日遞交的待決美國(guó)專利申請(qǐng)10/426，688的主題，所述專利均通過(guò)引用整體包括在本文中。這些菌株還產(chǎn)生體外刺激所述菌株產(chǎn)生更高量的細(xì)菌素的新肽。
本發(fā)明提供新信號(hào)肽以及產(chǎn)生所述肽的菌株，新誘導(dǎo)者菌株、氨基酸序列以及使用所述的新肽和誘導(dǎo)者菌株的方法。
唾液乳桿菌，PVD-32(NRRL B-30514)產(chǎn)生信號(hào)肽SEQ ID NO 3。它是一種好氧且革蘭氏陽(yáng)性的桿菌，并且能夠在約37° C生長(zhǎng)。所述菌株在營(yíng)養(yǎng)瓊脂或平板計(jì)數(shù)瓊脂(Plate Count Agar)上生長(zhǎng)產(chǎn)生不規(guī)則形狀的邊緣。在約37° C需氧培養(yǎng)約24小時(shí)后，所述的菌落是白色的且直徑約3mm。
屎腸球菌，LWP 50-52 (NRRL B-30746)產(chǎn)生信號(hào)肽SEQ ID NO 5。它是一種兼性好氧菌和革蘭氏陽(yáng)性球菌，并且能夠在約37°C生長(zhǎng)。所述菌株在營(yíng)養(yǎng)瓊脂或平板計(jì)數(shù)瓊脂上生長(zhǎng)產(chǎn)生不規(guī)則形狀的邊緣。在約37° C微需氧培養(yǎng)約24小時(shí)后，所述的菌落是灰色的且直徑約2mm。
倉(cāng)鼠鏈球菌，LWP-760 (NRRL B-30745)產(chǎn)生信號(hào)肽SEQ ID NO 7。它是一種兼性好氧菌和革蘭氏陽(yáng)性球菌，并且能夠在約37°C生長(zhǎng)。所述菌株在營(yíng)養(yǎng)瓊脂或平板計(jì)數(shù)瓊脂上生長(zhǎng)產(chǎn)生規(guī)則形狀的邊緣。在約37° C微需氧培養(yǎng)約24小時(shí)后，所述的菌落是灰色的且直徑約1mm。
嗜酸乳酸桿菌，LffP 320 (NRRL B-30510)，是這樣的誘導(dǎo)者菌株，它是兼性好氧菌和革蘭氏陽(yáng)性球菌，并且能夠在約37°C生長(zhǎng)。所述菌株在營(yíng)養(yǎng)瓊脂或平板計(jì)數(shù)瓊脂上生長(zhǎng)產(chǎn)生不規(guī)則形狀的邊緣。在約37° C微需氧培養(yǎng)約24小時(shí)后，所述的菌落是白色的且直徑約 3mm。
卷曲乳桿菌LWP 252 (NRRL B-30884)是這樣的誘導(dǎo)者菌株，它是好氧菌和革蘭氏陽(yáng)性球菌，并且能夠在約37°C生長(zhǎng)。所述菌株在營(yíng)養(yǎng)瓊脂或平板計(jì)數(shù)瓊脂上生長(zhǎng)產(chǎn)生規(guī)則形狀的邊緣。在約37° C需氧培養(yǎng)約24小時(shí)后，所述的菌落是灰色的且直徑約1mm。
來(lái)自產(chǎn)細(xì)菌素菌株的信號(hào)肽被分離并純化。生產(chǎn)者細(xì)胞主要通過(guò)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)分泌 II 類細(xì)菌素(Haverstein 等,Mol. Microbiol.,第 16 卷，229-240，1995 ；Gajic 等,J. Biol. Chem.,第36卷，34291-34298，2003)。這類細(xì)菌素中的一些的分泌是由于由位于細(xì)胞質(zhì)膜上的Sec轉(zhuǎn)位酶激活的信號(hào)肽發(fā)生的(Cintas等，Appl. Environ. Microbiol.,第 63 卷，4321-4330，1997 ；Doi 等，J. Biosci. Bioeng.，第 93 卷，434-436，2002 ；Leer 等， 微生物學(xué)(Microbiology),第 141 卷,1629-1635，1995 ；Martinez 等，微生物學(xué)，第 145 卷，3155-3161，1999 ;Tomita 等，J. Bacteriol.，第 178 卷，3585-3593，1999 ；fforobo 等，J. Bacteriol.，第 177 卷，3143-3149,1995;以及 Herranz 等，J. Appl. Environ. Microbiol.,第71卷(4)，1959-1963，2005)。信號(hào)肽的另一功能可能與細(xì)菌現(xiàn)象“群體感應(yīng)(quorum sensing)，，有關(guān)(De Kievit 等，感染與免疫(Infection and Immunity), 第68卷(9)，4839-4849，2000 ；Dunny等，在微生物信號(hào)傳遞與通信(Microbial Signaling and Communication)中，England 等編，英國(guó)劍橋大學(xué)出版社(University Press, Cambridge, United Kingdom) , 117-138, 1999 ；Dunning 和 Leonard, Annu.Rev. Microbiol.,第 51 卷，527-564，1997 ；以及 Kleerebezem 等，Mol. Microbiol.,第 24 卷，895-904，1997)。信號(hào)肽單獨(dú)或與誘導(dǎo)菌株的代謝物一起激活生產(chǎn)者中的組氨酸蛋白，由此增加細(xì)菌素的產(chǎn)生。為了獲得最大化的肽產(chǎn)生，產(chǎn)生信號(hào)肽的細(xì)胞，例如PVD 32， LWP50-52以及LWP 760，在選自由苯丙氨酸、色氨酸、丙氨酸及其混合物所組成的組的氨基酸所補(bǔ)充的M9肉湯中培養(yǎng)約2-10小時(shí)。對(duì)于包括在所述組合物中的每種氨基酸，本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案包括在約O. 01%到約O. 1%范圍內(nèi)的氨基酸的量。約10%的布氏肉湯介質(zhì)導(dǎo)致產(chǎn)生較低濃度的信號(hào)肽。
采用硫酸銨沉淀，隨后(I)采用Superose 12的高分辨色譜的凝膠過(guò)濾；和(2)辛基-瓊脂糖凝膠6B Fast Flow (快速流動(dòng))疏水作用色譜而將信號(hào)肽從培養(yǎng)物上清液中分離出來(lái)。
本發(fā)明的信號(hào)肽被用于在誘導(dǎo)者細(xì)菌存在時(shí)體外增加由生產(chǎn)者細(xì)胞的細(xì)菌素產(chǎn)生。所述的信號(hào)肽可以在誘導(dǎo)者和生產(chǎn)者細(xì)菌的培養(yǎng)期間的任何時(shí)刻添加。若給予本文的發(fā)明的詳細(xì)說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以容易地確定何時(shí)添加所述信號(hào)肽以獲得與僅含所述的肽和生產(chǎn)者、或僅含生產(chǎn)者和誘導(dǎo)者細(xì)菌的培養(yǎng)物的細(xì)菌素產(chǎn)生相比高水平的細(xì)菌素產(chǎn)生。
當(dāng)使用信號(hào)肽和抵抗空腸彎曲桿菌(C. jejuni)和腸炎沙門(mén)氏菌 (S. enteritidis)的誘導(dǎo)者細(xì)菌菌株時(shí)產(chǎn)生的細(xì)菌素的拮抗活性采用斑點(diǎn)試驗(yàn)來(lái)評(píng)定。 所述步驟包括取約10微升體積的各種濃度(yg/ml)的平板接種在預(yù)先接種有靶細(xì)菌細(xì)胞的血補(bǔ)給彎曲菌瓊脂(Campylobacter Agar)或營(yíng)養(yǎng)瓊脂(MPA或后蛋白胨瓊脂(Meta Peptone Agar))上的純細(xì)菌素制備物。含空腸彎曲桿菌培養(yǎng)物的平板于約42° C在微需氧條件下生長(zhǎng)。含腸炎沙門(mén)氏菌的平板于約37° C在需氧條件下生長(zhǎng)。細(xì)菌素的活性以每I毫升制備物任意單位(AU)在其上出現(xiàn)可見(jiàn)的培養(yǎng)物生長(zhǎng)抑制區(qū)域表示(Henderson 等，生物化學(xué)和生物物理存檔(Archives of Biochemistry and Biophysics),第 295卷，5-12，1992，通過(guò)引用并入本文)。比活也可以以每毫克純細(xì)菌素任意單位表示。
本發(fā)明的信號(hào)肽包括由細(xì)菌素分泌細(xì)菌產(chǎn)生的任何具有VKGLT(SEQ ID NO I)的羧基端序列的肽，當(dāng)被加至包括生產(chǎn)者細(xì)菌或生產(chǎn)者細(xì)菌和誘導(dǎo)者細(xì)菌的培養(yǎng)物時(shí)，所述肽增加細(xì)菌素的產(chǎn)生。
為了本發(fā)明的目的，誘導(dǎo)者細(xì)菌被定義為任何這樣的細(xì)菌，所述細(xì)菌當(dāng)與產(chǎn)細(xì)菌素細(xì)菌——生產(chǎn)者細(xì)菌一起——連同與生產(chǎn)者的信號(hào)肽一起培養(yǎng)時(shí)，將細(xì)菌素的產(chǎn)生增加到超過(guò)僅含所述生產(chǎn)者細(xì)菌和其信號(hào)肽的培養(yǎng)物的細(xì)菌素的產(chǎn)生。
為了本發(fā)明的目的，術(shù)語(yǔ)“肽”意為至少兩個(gè)或更多個(gè)氨基酸或氨基酸類似物的化合物。所述氨基酸或氨基酸類似物可以通過(guò)肽鍵相連。在另一個(gè)實(shí)施方案中，氨基酸可以通過(guò)其他鍵，例如酯，醚等相連。肽可以是任何結(jié)構(gòu)構(gòu)型，包括線性，分支，或環(huán)狀構(gòu)型。本文所用的術(shù)語(yǔ)“氨基酸”指天然或合成的氨基酸，包括D或L光學(xué)異構(gòu)體，以及氨基酸類似物兩者。
本發(fā)明的肽衍生物和類似物包括但不限于包含作為一級(jí)氨基酸序列的的那些，所述肽的所述氨基酸序列的全部或部分包括改變的序列，其中，功能上等同的氨基酸殘基替代所述序列中的殘基導(dǎo)致保守氨基酸替代。
例如，序列中的一個(gè)或更多個(gè)氨基酸殘基可以由具有相似極性的另外的氨基酸替代，所述具有相似極性的另外的氨基酸起功能等同物的作用，導(dǎo)致沉默改變。序列中氨基酸的替代物可以選自該氨基酸所屬類別的其他成員。例如，非極性(疏水)氨基酸包括丙氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，纈氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，和甲硫氨酸。含有芳香環(huán)結(jié)構(gòu)的氨基酸是苯丙氨酸，色氨酸和酪氨酸。極性中性氨基酸包括甘氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，半胱氨酸，酪氨酸，天門(mén)冬酰胺，和谷氨酰胺。帶正電荷的(堿性)氨基酸包括精氨酸，賴氨酸，和組氨酸。帶負(fù)電荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。預(yù)期這種改變不會(huì)顯著影響聚丙酰胺凝膠電泳確定的分子量或等電點(diǎn)。非保守氨基酸替代也可以被引入以替換氨基酸，使之具有特別偏好的性質(zhì)。例如，Cys可以被引入到可能的位置以與另一個(gè)Cys形成二硫橋。 Pro可以因其特別平面的結(jié)構(gòu)而被引入。
本發(fā)明的肽可以被化學(xué)合成。合成肽可以用熟知的固相、液相，或肽縮合(peptide condensation)技術(shù),或任何其組合制備，并且可以包括天然的和/或合成的氨基酸。用于肽合成的氨基酸可以是使用Merrifield的原創(chuàng)的固相程序的標(biāo)準(zhǔn)去保護(hù)、中和、耦聯(lián)和洗滌方法(J. Am. Chem. Soc,第85卷，2149-2154，1963)的標(biāo)準(zhǔn)Boc (N°-氨基保護(hù)的 N°-t-丁基氧羰基)氨基酸樹(shù)脂，或堿敏感的N°-氨基保護(hù)的9-芴基甲氧羰基(Fmoc)氨基酸(Carpino 和 Han, J. Org. Chem.，第 37 卷，3403-3409，1972)。此外，本發(fā)明的方法可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的其他Na-保護(hù)的基團(tuán)。固相肽合成可以用本領(lǐng)域的普通技術(shù)(參見(jiàn)例如 Stewart 和 Young, Solid Phase Synthesis (固相合成)，第二版，Pierce Chemical Company, Rockford, 111. , 1984;Fields和Noble, Int. J. Pept. Protein Res.,第 35卷，161-214，1990)，或用自動(dòng)合成儀完成。
下述實(shí)施例僅僅是為了進(jìn)一步舉例說(shuō)明本發(fā)明，并非要限制由權(quán)利要求確定的本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例I
屎腸球菌LWP50-52、倉(cāng)鼠鏈球菌LWP-760以及唾液乳桿菌PVD-32菌株的細(xì)胞被平板接種在含有約300mL下列介質(zhì)的燒瓶中布氏肉湯，10%布氏肉湯或如下表I所不的由氨基酸補(bǔ)充的M9。在約37° C振蕩培養(yǎng)約2、4、6和8小時(shí)。旋轉(zhuǎn)速度約為120rpm。約-4° C 下將培養(yǎng)液的等分試樣在約6000Xg離心約15分鐘。通過(guò)用約40%的(NH4)2SO4溶液在約 4° C沉降蛋白大約24小時(shí)，隨后通過(guò)使用SupeiOse-12高分辨色譜凝膠過(guò)濾并選擇低分子量級(jí)份而將蛋白分離。這些級(jí)份被施于辛基-瓊脂糖凝膠6B Fast Flow (快速流動(dòng))疏水作用色譜柱并用約O. IM Tris緩沖液中，pH 5. I的O. 4-0. 9M的K2HPO梯度洗脫。結(jié)果在下面示于表I中。從表I可見(jiàn)，從生產(chǎn)者PVD 32,LffP 50-52以及LWP 760分離的肽是低分子量的并且主要在含饑餓法介質(zhì)的培養(yǎng)物中積累(M9+指明的氨基酸)。
表I來(lái)自菌株P(guān)VD-32、LWP-50_52以及LWP-760的誘導(dǎo)者狀的分離和鈍化
權(quán)利要求
1.一種具有SEQ ID NO I的羧基端氨基酸序列的肽。
2.一種具有SEQ ID NO 3的氨基酸序列的肽。
3.一種具有SEQ ID NO 5的氨基酸序列的肽。
4.一種具有SEQ ID NO 7的氨基酸序列的肽。
5.一種用于增加細(xì)菌素產(chǎn)生的方法，包括a.向培養(yǎng)物體系添加產(chǎn)細(xì)菌素細(xì)菌和誘導(dǎo)者細(xì)菌，b.添加具有SEQID NO I的羧基端氨基酸序列的肽，以及c.培養(yǎng)所述細(xì)菌和所述肽一段時(shí)間以實(shí)現(xiàn)增加的所述細(xì)菌素的產(chǎn)生。
6.一種用于刺激具有SEQ ID NO 2的細(xì)菌素的產(chǎn)生的方法，包括a.向培養(yǎng)物體系添加產(chǎn)細(xì)菌素細(xì)胞系NRRL-B-30514和誘導(dǎo)者細(xì)胞系NRRL30884，b.添加具有SEQID NO 3的肽，以及c.培養(yǎng)所述細(xì)菌和所述肽一段時(shí)間以實(shí)現(xiàn)增加的所述細(xì)菌素的產(chǎn)生。
7.一種用于刺激具有SEQ ID NO 4的細(xì)菌素的產(chǎn)生的方法，包括a.向培養(yǎng)物體系添加產(chǎn)細(xì)菌素細(xì)胞系NRRLB-30746和誘導(dǎo)者細(xì)胞系NRRLB-30510，b.向所述體系添加具有SEQID NO 5的肽，以及c.培養(yǎng)所述細(xì)菌和肽一段時(shí)間以實(shí)現(xiàn)增加的所述細(xì)菌素的產(chǎn)生。
8.一種用于刺激具有SEQ ID NO 6的細(xì)菌素的產(chǎn)生的方法，包括d.向培養(yǎng)物體系添加產(chǎn)細(xì)菌素細(xì)胞系NRRLB-30745和誘導(dǎo)者細(xì)胞系NRRLB-30510，e.添加具有SEQID NO 7的肽，以及f.培養(yǎng)所述細(xì)菌和所述肽一段時(shí)間以實(shí)現(xiàn)增加的所述細(xì)菌素的產(chǎn)生。
9.一種用于刺激具有SEQ ID NO 2的細(xì)菌素的產(chǎn)生的方法，包括a.向培養(yǎng)物體系添加產(chǎn)細(xì)菌素細(xì)胞系NRRL-B-30514和誘導(dǎo)者細(xì)胞系NRRL30884，b.添加具有SEQID NO I的羧基端氨基酸序列的肽，以及c.培養(yǎng)所述細(xì)菌和所述肽一段時(shí)間以實(shí)現(xiàn)增加的所述細(xì)菌素的產(chǎn)生。
10.一種用于刺激具有SEQ ID NO 4的細(xì)菌素的產(chǎn)生的方法，包括g.向培養(yǎng)物體系添加產(chǎn)細(xì)菌素細(xì)胞系NRRLB-30746和誘導(dǎo)者細(xì)胞系NRRLB-30510，h.向所述體系添加具有SEQID NO I的羧基端氨基酸序列的肽，以及i.培養(yǎng)所述細(xì)菌和所述肽一段時(shí)間以實(shí)現(xiàn)增加的所述細(xì)菌素的產(chǎn)生。
11.一種用于刺激具有SEQ ID NO 6的細(xì)菌素的產(chǎn)生的方法，包括j.向培養(yǎng)物體系添加產(chǎn)細(xì)菌素細(xì)胞系NRRL B-30745和誘導(dǎo)者細(xì)胞系NRRL B-30510,k.添加具有SEQ ID NO I的羧基端氨基酸序列的肽，以及I.培養(yǎng)所述細(xì)菌和所述肽一段時(shí)間以實(shí)現(xiàn)增加的所述細(xì)菌素的產(chǎn)生。
全文摘要
由產(chǎn)細(xì)菌素細(xì)菌產(chǎn)生的新型的肽在體外刺激細(xì)菌素的產(chǎn)生。為了實(shí)現(xiàn)細(xì)菌肽產(chǎn)生的增加，在新的誘導(dǎo)者細(xì)菌和具有VKGLT的羧基端序列的肽的存在下培養(yǎng)所述生產(chǎn)者細(xì)菌。
文檔編號(hào)C12R1/46GK102977187SQ20121029159
公開(kāi)日2013年3月20日 申請(qǐng)日期2006年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月8日
發(fā)明者N·J·斯特恩, E·A·斯韋托奇, B·V·葉魯斯拉諾夫, V·V·佩雷列金, V·P·列夫查克 申請(qǐng)人:由農(nóng)業(yè)部部長(zhǎng)代表的美利堅(jiān)合眾國(guó), 國(guó)家應(yīng)用微生物和生物技術(shù)研究中心