專利名稱：耐輻射異常球菌R1 trkB基因培育耐鹽植物的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及耐福射異常球菌Rl (Deinococcus radiodurans Rl) trkB基因(DR1667，GeneID: 1799538)的新功能，具體涉及該基因在增強(qiáng)植物對鹽脅迫抗性方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
鹽堿對農(nóng)作物造成的損失在所有非生物脅迫中占首位(Dracup et al.，1998)。耐輻射異常球菌Rl (D. radiodurans Rl)因?qū)﹂L期的干燥和強(qiáng)氧化脅迫具有極強(qiáng)的抗性，而成為研究微生物非生物脅迫適應(yīng)機(jī)制的理想菌株。 HKT (high-affinity K+transporter)基因家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白具有可以調(diào)節(jié)植物體內(nèi)K+/Na+平衡的能力，廣泛存在于植物、真菌、真細(xì)菌和古細(xì)菌中。耐輻射異常球菌Rl(D. radiodurans Rl)含有2個HKT類蛋白，與植物Na+轉(zhuǎn)運(yùn)關(guān)系密切密切相關(guān)，對長期的干燥和強(qiáng)氧化脅迫具有極強(qiáng)的抗性。鉀是植物體必需的營養(yǎng)元素之一，鈉是植物生長的功能元素，對于大多數(shù)植物而言，少量有益，過量則會產(chǎn)生毒害。植物對它們的吸收主要靠其體內(nèi)的通道蛋白和轉(zhuǎn)運(yùn)載體。植物HKT轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與真菌Trk轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、原核生物的KtrB和TrkH的K轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的聯(lián)系緊密，真菌中Trk轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是低K濃度下主要的K吸收系統(tǒng)。大多數(shù)植物中都可能存在HKT轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，這個基因家族并不是很大，在擬南芥中該家族只有一個成員。序列分析推測，這個家族的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可能由細(xì)菌的2次跨膜結(jié)構(gòu)的K通道進(jìn)化而來，形成現(xiàn)在的8次跨膜和4個圈的一孔結(jié)構(gòu)蛋白。HKT家族基因主要分為2個亞家族，亞家族I成員是特異性的Na低親合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，大部分分布于根系中柱的細(xì)胞質(zhì)膜上，尤其是木質(zhì)部薄壁細(xì)胞膜上，負(fù)責(zé)從木質(zhì)部汁液中重新獲取Na而阻止其向地上部的運(yùn)輸；而亞家族2成員是K/Na高親合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，尤其在K缺乏條件下負(fù)責(zé)對Na的吸收從而促進(jìn)作物的生長，主要分布于根系的皮層和內(nèi)皮層細(xì)胞膜上。Deinococcus radiodurans (D. radiodurans)是至今已知生物中最高的福射抗性的生物之一。該菌具有對致死劑量的電離輻射、UV輻射以及DNA損傷試劑的極端抗性，能將電離輻射造成上百個DNA雙鏈斷裂的基因組完整恢復(fù)如初，且不發(fā)生突變的能力。1999年基因研究所(TIGR)完成和公布了 D. radiodurans基因組全序列(White 1999)。盡管耐輻射菌株與干旱脅迫抗性在進(jìn)化上可能具有協(xié)同性，但目前未見耐福射異球菌Deinococcusradiodurans Rl中的trkB基因(DR1667，GeneID: 1799538)在增強(qiáng)植物耐鹽性方面的功能的研究報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是從D. radiodurans Rl基因組中發(fā)現(xiàn)能夠增強(qiáng)植物對高鹽的抗性基因。并將該基因轉(zhuǎn)入植物，使轉(zhuǎn)入該基因的植物獲得耐鹽的能力。本發(fā)明通過如下研究發(fā)現(xiàn)，首次發(fā)現(xiàn)，SEQ ID NO: I所示序列的Deinococcusradiodurans Rl的trkB基因(DR1667，GeneID: 1799538)具有抗鹽脅迫的功能，可用于培育耐鹽性狀的植物I、獲得含有D. radiodurans Rl trkB基因(DR1667)的重組工程菌株I)通過 PCR 從 D. radiodurans Rl (DSM 20539)菌株基因組擴(kuò)增出 D. radioduransRltrkB基因(DR1667)，基因序列號為GeneID :1799538。其大小為1377bp，該基因編碼456個氨基酸，將其克隆于載體pGEMT-easy上，構(gòu)建了含有完整trkB基因的重組質(zhì)粒pGEMT-trkB ；2)將trkB基因(DR1667)連接于pRADZ3穿梭質(zhì)粒上，該質(zhì)粒含有能在大腸桿菌和耐輻射異球菌中都起作用的groEL啟動子，構(gòu)建含有g(shù)roEL啟動子的完整trkB基因(DR1667)重組質(zhì)粒 pRADZ3-trkB G ；3)將導(dǎo)入trkB基因(DR1667)的重組質(zhì)粒pRADZ3-trkB G轉(zhuǎn)入受體大腸桿菌JM109 中，獲得工程菌株JM-trkB (詳見實(shí)施例I)；2、含有D. radiodurans Rl trkB基因工程菌株的耐鹽實(shí)驗實(shí)驗證實(shí)，經(jīng)4M NaCl 沖擊后，含有 D. radiodurans Rl trkB 基因(DR1667)的JM-trkB重組菌株生長狀況良好，菌落數(shù)高于只含空質(zhì)粒的JM-Z3菌株(見實(shí)施例2及圖
4)。該工程菌株具有耐受4M NaCl沖擊的能力。此實(shí)驗表明D. radiodurans Rl trkB基因(DR1667)具有增強(qiáng)原核生物耐鹽的能力。3、trkB基因(DR1667)在油菜中表達(dá)及轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽抗性鑒定I)將D. radiodurans Rl trkB基因(DR1667)連接到植物表達(dá)載體pBI121中，構(gòu)建具有trkB基因(DR1667)的重組質(zhì)粒pBI121_trkB ；2)將pBI121-trkB重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化油菜中，獲得了能夠耐鹽的轉(zhuǎn)基因油菜植株；此實(shí)驗表明D. radiodurans Rl trkB基因(DR1667)具有培育耐鹽植物的用途(見實(shí)施例3及圖5 6)。


圖I是含有D. radiodurans Rl trkB基因(DR1667)序列的PCR產(chǎn)物驗證電泳圖
-i'Tfe1曰；圖2是含有D. radiodurans Rl trkB基因(DR1667)及groEL啟動子的原核表達(dá)載體的構(gòu)建驗證電泳圖譜；圖3是在高濃度鹽(4M NaCl)沖擊前的含有空載體和含有D. radiodurans Rl trkB基因(DR1667)序列的原核表達(dá)載體的大腸桿菌的生長狀況的菌落照片，其中a是含有空表達(dá)載體的大腸桿菌JM 109菌株；b是含有D. radiodurans Rl trkB基因(DR1667)表達(dá)載體的大腸桿菌重組菌株；圖4是含有D. radiodurans Rl trkB基因(DR1667)的原核表達(dá)載體及空載體的大腸桿菌(E. coli)在含4M NaCl培養(yǎng)基中的生長情況的菌落照片，圖中的菌株如下a是含有空表達(dá)載體的大腸桿菌JM 109菌株；b是含有D. radiodurans Rl trkB基因(DR1667)表達(dá)載體的大腸桿菌重組菌株。圖5是在250mmol NaCl的培養(yǎng)基上培養(yǎng)15天后非轉(zhuǎn)基因油菜，已萎蔫；
圖6是在250mmol NaCl的培養(yǎng)基上培養(yǎng)15天后轉(zhuǎn)基因油菜，轉(zhuǎn)基因油菜能在含250mmol的NaCl的脅迫下正常生長。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例中所舉的質(zhì)粒、菌株只用于對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明，并不對本發(fā)明的實(shí)質(zhì)內(nèi)容加以限制。凡未注明具體實(shí)驗條件的，均為按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)條件，例如Sambrook等分子克隆實(shí)驗室手冊(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例中所舉的質(zhì)粒、菌株來源如下克隆載體pGEMT-easy :為Promrga公司市售產(chǎn)品；穿梭質(zhì)粒pRADZ3 :為本實(shí)驗室保存；
植物表達(dá)載體pBI121 :為Clontech公司市售產(chǎn)品；大腸桿菌JM 109 :為北京全式金公司市售產(chǎn)品。根癌農(nóng)桿菌EHA 105由本實(shí)驗室保存。實(shí)施例I D. radiodurans Rl trkB基因(DR1667)序列在大腸桿菌中的表達(dá)根據(jù)已公布的D. radiodurans Rl基因組中的trkB基因(DR1667)序列設(shè)計I對PCR特異性引物Up 5' ATTAACTAGTATGACCCGGAACGCCGCGCT 3'Down 5' ACGCCATATGCTACCCCACCAGAATGTCGT3通過PCR方法從D. radiodurans Rl基因組DNA中擴(kuò)增出目的基因序列。反應(yīng)條件94°C IOmin, [94°C 30sec,60°C 30sec,72°C I. 5min]35 個循環(huán)，72 °C IOmin0 PCR 產(chǎn)物經(jīng)膠回收后，克隆于載體pGEMT-easy上，命名為pGEMT_trkB，并測序驗證；然后通過SpeI/NdeI雙酶切獲得含有粘性末端的trkB基因(DR1667)及含有啟動子groEL的pRADZ3載體，將trkB基因(DR1667)連接于pRAD Z3載體上，構(gòu)建大腸桿菌表達(dá)載體pRADZ3_trkB G，將該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，經(jīng)PCR、酶切，測序驗證插入序列正確(見圖1，2)，將該菌株命名為JM-trkB。將含有pRADZ3空質(zhì)粒的E. coli JMl09命名為JM-Z3。實(shí)施例2含D. radiodurans Rl trkB基因(DR1667)重組菌株的耐鹽實(shí)驗一、實(shí)驗方法I、將實(shí)施例I中獲得的2個重組的大腸桿菌分別接種于20mL LB液體培養(yǎng)基(含Amp抗生素)中，搖瓶過夜培養(yǎng)后(37 °C)，再轉(zhuǎn)接于IOOmL的LB液體培養(yǎng)基中，盡量保持接種量的一致，培養(yǎng)至0D_約0. 5左右(盡量保持OD6tltl值一致)。2、取IOmL的菌液離心后，在等體積的4M NaCl溶液中沖擊2h，每個樣品立即用無菌去離子水倍比稀釋至10_4，取10 μ L點(diǎn)在LB固體培養(yǎng)基表面，經(jīng)37°C培養(yǎng)16h，觀察菌落形成情況并照相。二、實(shí)驗結(jié)果圖3 顯示，4M NaCl 溶液沖擊前，含有 H radiodurans Rl trkB 基因(DR1667)的JM-trkB菌株與含空質(zhì)粒的JM-Z3菌株生長狀態(tài)基本一致；4M NaCl溶液沖擊后，含有D. radiodurans Rl trkB基因(DR1667)的JM-trkB重組菌株生長狀況良好，菌落數(shù)多于只含空質(zhì)粒的JM-Z3菌株(見圖4)。三、實(shí)驗結(jié)論D. radiodurans Rl trkB基因(DR1667)增強(qiáng)了原核生物耐鹽的能力。實(shí)施例3 trkB基因(DR1667)在油菜中表達(dá)及轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性鑒定(一)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化油菜實(shí)驗I.根癌農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)的制備I)挑取單菌落，接種于5mL YEB液體培養(yǎng)基(含利福平Rif 50mg/L), 28°C, 250 rpm振蕩培養(yǎng)過夜；2)取2mL菌液，加入50mL YEB液體培養(yǎng)基(含Rif 50mg/L)中，28°C，250rpm振蕩 培養(yǎng)至OD600約O. 6左右;3)將菌液轉(zhuǎn)至50mL無菌離心管中，冰浴30min,5000Xg離心5min ；4)棄上清，沉淀用2mL 20mM CaCl2重懸，每份100 μ L分裝到I. 5mL離心管中，液
氣中保存?zhèn)溆谩?.重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌I)將約Iyg的pBI121-trkB質(zhì)粒DNA分別加入到IOOyL EHA105感受態(tài)細(xì)胞中，混勻，冰浴5min ；2)將離心管置液氮中冷凍8min，迅速轉(zhuǎn)至37° C水浴中溫浴5min ；3)加入ImL YEB液體培養(yǎng)基，在28°C搖床上250rpm復(fù)蘇4 5h ;4)取適量菌液涂布到含利福平(Rif) 50mg/L和卡那霉素(Kan) 100mg/L的YEB固體培養(yǎng)基上，置28°C培養(yǎng)24 48h。3.農(nóng)桿菌質(zhì)粒DNA的提取I)挑取菌落于含利福平(Rif) 50mg/L和卡那霉素(Kan) 100mg/L的YEB液體培養(yǎng)基中(YEB :胰蛋白胨5g/L，酵母提取物lg/L，蔗糖5g/L，硫酸鎂0. 5g/L)，28。C，250rpm振蕩培養(yǎng)20h ；2)取 I. 5mL 菌液離心后，棄上清，用 STE 溶液(Tris-HCI IOmM ρΗ8· O,NaCl IOmM,EDTA IOmM pH 8. 0)洗滌2次，棄上清，加入預(yù)冷的溶液I (50mM葡萄糖，25mM Tris-HClpH8. O7IOmM EDTA pH 8. O7RNase A 100 μ g/mL) 300 μ L，用移液器反復(fù)抽吸混勻，室溫靜置IOmin ；3)加入新鮮配置的溶液II (0. 2M NaOH, 1%SDS) 600 μ L，上下顛倒幾次混勻；4)加入預(yù)冷的溶液III(5M乙酸鉀pH 5. 2，冰醋酸IL 5mL，加水至100mL)450y L，充分混勻，冰浴5min,4° C 12000 Xg離心5min,上清加入0. 6倍體積的異丙醇沉淀；5)沉淀加 50 μ L TE (Tris-HCI IOmmoI/L, lmmol/L EDTA, pH 8. O)溶解后，經(jīng) PCR、Bam HI、Sac I雙酶切驗證。4.油菜無菌苗的準(zhǔn)備及農(nóng)桿菌介導(dǎo)的trkB基因(DR1667)遺傳轉(zhuǎn)化I)油菜無菌苗的培養(yǎng)甘藍(lán)型油菜(Brassica napus L. ) (84100-18)種子在超凈工作臺上用滅菌水浸泡IOmin, 10%的NaClO滅菌12min,再用0. 1%的升萊溶液消毒7_8min,用滅菌水洗3_5遍，并把滅菌的油菜種子均勻地擺放在無激素的預(yù)培養(yǎng)基上(7.5%瓊脂)。光照培養(yǎng)，4-5d齡油菜幼苗最適于遺傳轉(zhuǎn)化。
2)預(yù)培養(yǎng)用75%的酒精和高溫消毒滅菌的剪刀剪掉子葉和生長點(diǎn)，剪取油菜無菌苗緊鄰生長點(diǎn)下約O. 5cm長的下胚軸，置于預(yù)培養(yǎng)基(MS+6-BA 2mg/L+2, 4_D lmg/L+AgN03 2. 5mg/L+AS 19. 62mg/L)上，光照預(yù)培養(yǎng)2d。3)農(nóng)桿菌的培養(yǎng)在50mL LB液體培養(yǎng)基(含卡那霉素100mg/L、利福平50mg/L)中加入O. ImLlea-EHA 105菌液，28°C下220rpm振蕩培養(yǎng)16h左右，室溫下4000 Xg離心lOmin，棄上清液，菌體用滅菌的MS液體培養(yǎng)基(含AS 100 μ mol/L)懸浮，稀釋到原體積的5_20倍，在28°C下220rpm振蕩培養(yǎng)lh，使菌液的0D_達(dá)O. 5左右。4)共培養(yǎng)把預(yù)培養(yǎng)2d的下胚軸放入菌液中浸染lmin，用藥勺撈出下胚軸，放在滅菌的吸水 紙上，吸干下胚軸上的多余菌液，再放到覆蓋有滅菌濾紙的預(yù)培養(yǎng)基上，用封口膜封好培養(yǎng)皿，25° C左右，于暗處共培養(yǎng)約2d (暗培養(yǎng))。5)誘導(dǎo)培養(yǎng)把共培養(yǎng)2d的下胚軸放到誘導(dǎo)培養(yǎng)基(MS+6-BA 2mg/L+AgN03 2.5mg/L)上，用封口膜封好培養(yǎng)皿，25。C左右光照培養(yǎng)，每2周繼代I次，直至長出膨大的愈傷組織。6)選擇培養(yǎng)把膨大的愈傷組織轉(zhuǎn)移到篩選培養(yǎng)基(MS+6-BA 2mg/L+AgN03 2. 5mg/L+Kan100mg/L)上，用封口膜封好培養(yǎng)皿，25° C左右光照培養(yǎng)，每2周繼代I次，直至長出苗。7)生根培養(yǎng)當(dāng)幼芽長到l-2cm高時，把它們從愈傷組織上分離，轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上(1/2MS+NAA 0. 5mg/L+Kan 25mg/L)進(jìn)行生根培養(yǎng)。在抗生素篩選條件下，約87%的芽在2周后形成根。8)煉苗和移栽生根后的幼苗長到5-6cm高時，半敞開培養(yǎng)瓶蓋子，進(jìn)行煉苗；待幼苗適應(yīng)外界環(huán)境以后，轉(zhuǎn)移到室內(nèi)滅菌的蛭石中栽種培養(yǎng)，并用1/2MS培養(yǎng)液澆灌。當(dāng)幼苗生長至7-9cm時，將幼苗移植到泥土中生長，然后再進(jìn)行下一步實(shí)驗。(二)含trkB基因(DR1667)序列轉(zhuǎn)基因油菜的耐鹽性鑒定I、實(shí)驗?zāi)康蔫b于該核苷酸序列已被證明在大腸桿菌中對鹽脅迫具有抗性，進(jìn)一步對轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行抗旱性鑒定。2、實(shí)驗方法對苗期的轉(zhuǎn)基因油菜植株和非轉(zhuǎn)基因油菜植株均分別一次性澆足含250NaCl的營養(yǎng)液后不再澆水，15天后觀察對比兩種油菜植株的生長情況。3、實(shí)驗結(jié)果從圖5可觀察到,在250mmol NaCl的培養(yǎng)基上培養(yǎng)15天后，非轉(zhuǎn)基因油菜已萎蔫;從圖6可觀察到，在250mmol NaCl的培養(yǎng)基上培養(yǎng)15天后，轉(zhuǎn)基因油菜在250mmol的NaCl脅迫下仍可正常生長。
4、實(shí)驗結(jié)論上述所有結(jié)果均表明，所克隆的trkB基因(DR1667)具有對鹽脅迫的抗性，可用于利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)控制植 物對鹽脅迫的研究和產(chǎn)業(yè)化中。
權(quán)利要求
1.SEQ ID NO: I所示序列的基因培育耐鹽植物的用途。
2.含SEQID NO: I所示序列的基因的重組質(zhì)粒。
3.權(quán)利要求2所述重組質(zhì)粒培育耐鹽植物的用途。
4.權(quán)利要求3所述的用途，所述重組質(zhì)粒是能在大腸桿菌表達(dá)的質(zhì)粒。
5.權(quán)利要求3所述的用途，所述重組質(zhì)粒是能在植物中表達(dá)的質(zhì)粒。
6.權(quán)利要求2所述的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞培育耐鹽植物的用途。
7.權(quán)利要求6所述的用途，所述宿主細(xì)胞包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。
8.含SEQID NO: I所示序列的基因的重組工程菌株。
9.權(quán)利要求8所述的重組工程菌株培育耐鹽植物的用途。
10.權(quán)利要求1、3 7、9中任一所述的用途，所述植物是油菜。
全文摘要
本發(fā)明發(fā)現(xiàn)耐輻射異球菌Deinococcus radiodurans R1中的trkB基因(DR1667)具有增強(qiáng)原核生物及植物的抗逆能力。本發(fā)明構(gòu)建了包含上述基因的重組載體，把它們分別導(dǎo)入原核及真核宿主細(xì)胞。實(shí)驗證明，trkB基因(DR1667)在原核宿主細(xì)胞和油菜中表達(dá)后，均能增強(qiáng)其耐鹽抗性。
文檔編號C12R1/19GK102807991SQ20121029161
公開日2012年12月5日 申請日期2012年8月15日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月15日
發(fā)明者林敏 , 王勁, 左開井, 陳明, 張維, 平淑珍, 陸偉, 燕永亮 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所